白治苗，盧玉鳳，楊 眉，年 研，哈春芳

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦產(chǎn)科，銀川750004；3.榆林市第二醫(yī)院，陜西719000）

尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinase plasmino－gen activator，uPA）是尿激酶型纖溶酶原激活系統(tǒng)（簡(jiǎn)稱uPA系統(tǒng)）的一個(gè)重要組成部分，主要在細(xì)胞外基質(zhì)、基底膜等多種成分的降解中發(fā)揮作用，是維持細(xì)胞外基質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡的一種關(guān)鍵因子［1－2］。在正常情況下，uPA存在于人或動(dòng)物的血液、尿中，其本質(zhì)是一種絲氨酸蛋白酶，具有將無活性的纖溶酶原轉(zhuǎn)化成有活性的纖溶酶的作用，從而激活體內(nèi)的纖溶系統(tǒng)，但纖溶酶原激活物抑制物－1（PAI－1）能特異性地抑制uPA的活性，從而保證了機(jī)體細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡。子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs）簡(jiǎn)稱內(nèi)異癥，容易引起女性，尤其是育齡期婦女下腹墜脹痛、月經(jīng)失調(diào)、性交痛，以及不孕等癥狀的常見良性疾病。但EMs卻有著類似惡性腫瘤的黏附、種植、侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。該病的病因與發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前被普遍接受的是1921年Sampson提出的子宮內(nèi)膜種植學(xué)說，于經(jīng)期時(shí)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞隨經(jīng)血逆流，經(jīng)輸卵管進(jìn)入盆腔并種植于卵巢和鄰近的腹膜。這一學(xué)說在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已被證實(shí)，但經(jīng)血中的腺上皮、間質(zhì)細(xì)胞是如何黏附并種植于腹膜細(xì)胞外基質(zhì)中的，目前尚不清楚。因此，推測(cè)原位內(nèi)膜uPA的活性增強(qiáng)，PAI－1的抑制作用不足，使經(jīng)血中的內(nèi)膜碎片降解腹膜細(xì)胞外基質(zhì)的能力增加，為子宮內(nèi)膜的異位黏附、種植創(chuàng)造了條件。本研究試圖通過免疫組織化學(xué)和RT－PCR檢測(cè)uPA蛋白、mRNA在EMs患者在位、異位及正常內(nèi)膜組中的表達(dá)，由此闡述uPA在EMs發(fā)病機(jī)制中的可能作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年1月至2014年9月于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦產(chǎn)科因EMs行手術(shù)治療并于術(shù)中或術(shù)后確診的病理存檔石蠟標(biāo)本及新鮮組織各35例，納入病例組。按照美國生育協(xié)會(huì)（AFS）修正EMs分期法（1985），所有病例組患者均處于Ⅱ期。收集同年因子宮肌瘤經(jīng)手術(shù)治療并排除EMs的正常子宮內(nèi)膜30例作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有病例組及對(duì)照組患者于手術(shù)前月經(jīng)周期均正常，病例組于術(shù)中或術(shù)后證實(shí)為EMs，兩組近3個(gè)月均未接受過激素類藥物的治療，無不孕、子宮內(nèi)膜非典型性增生、宮頸上皮內(nèi)瘤變、生殖道炎癥等其他婦科器質(zhì)性疾病，患者年齡在25～45歲，平均（30.50±4.98）歲。

1.2 主要試劑 兔抗人uPA多克隆抗體由美國abcam生物公司生產(chǎn)（稀釋濃度分別為1∶100），兔超敏二步法免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑PV－6001，DAB顯色試劑盒均由北京中杉生物工程公司生產(chǎn)。RT－PCR所需引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，cDNA反轉(zhuǎn)錄核，免疫熒光定量試劑盒均購置于Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué) 所有標(biāo)本均由病理科證實(shí)，由甲醛浸泡過夜，10%甲醛固定，程序脫水、石蠟包埋，3～4μm厚度連續(xù)切片，65℃烤箱烤片過夜，脫蠟、水洗、抗原修復(fù)、一抗孵育過夜、PBS沖洗、二抗孵育2h、顯色、梯度乙醇脫水、二甲苯透明及中性樹膠封片，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3.2 RT－PCR步驟 引物根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，采用引物設(shè)計(jì)軟件 Primer Premier 5 設(shè) 計(jì)，上游引 物：5′－GGG AGC AGA GAC ACT AAC GAC－3′，下 游 引 物：5′－CTT ACA CTC ACA GCC CAC ACA－3′，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3.3 操作步驟（1）內(nèi)膜組織中總 RNA提?。悍Q取約50 mg在位或異位內(nèi)膜組織置于含有液氮的勻漿器中，加入1mL預(yù)冷的TRIZOL充分勻漿后將裂解液移入1.5mL EP管，4℃，12 000r/min，離心10min，取上層裂解液加入0.2mL氯仿，混勻，冰浴5min，4℃，12 000r/min，離心10min，取上層水相加0.5mL異丙醇，顛倒混勻后冰浴10min，4℃，12 000 r/min，離心10min，小心去除上清液，加入1mL 75%乙醇，4℃，7 500r/min離心5min，棄去上清液，讓沉淀RNA自然干燥5～10min.（2）RNA定量：用無RNA酶的水溶解RNA沉淀至20μL，取2μL于750紫外分度計(jì)測(cè)量RNA純度及濃度，將終濃度稀釋為1μg/μL。（3）反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性3 min，1個(gè)循環(huán)，94℃ 變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1 min，各35個(gè)循環(huán)，72℃終反應(yīng)5min。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)（1）采用OLYMPUS.BX51正置熒光顯微鏡觀察染色結(jié)果，uPA以細(xì)胞質(zhì)或基底膜中出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。用image pro－plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件對(duì)uPA蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行半定量分析，計(jì)算出每張切片的平均光密度值（IOD）。（2）RT－PCR 結(jié)果判定，用 BIO－RAD凝膠掃描系統(tǒng)分析攝像，用Roche－Lightcycler 96對(duì)產(chǎn)物半定量分析，以正常內(nèi)膜、內(nèi)異癥在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中uPA/GADPH mRNA表示相對(duì)量結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用±s表示，采用單因素方差分析、兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)方法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 uPA蛋白在3組中表達(dá)的結(jié)果 uPA蛋白主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)及基底膜中，極少數(shù)表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞中，見圖1。其中uPA蛋白在EMs異位內(nèi)膜組中的表達(dá)明顯高于EMs在位內(nèi)膜組、正常內(nèi)膜組，EMs在位內(nèi)膜組中的表達(dá)高于正常內(nèi)膜組，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖1 uPA蛋白在3組內(nèi)膜中的表達(dá)（SP×400）

圖2 uPA蛋白在3組內(nèi)膜中的表達(dá)

圖3 uPA蛋白在3組內(nèi)膜增生期、分泌期中的表達(dá)

2.2 uPA蛋白在3組內(nèi)膜中增生期與分泌期的表達(dá) uPA蛋白在3組內(nèi)膜中的增生期與分泌期中的表達(dá)無明顯差異（P＞0.05），見圖3。

2.3 uPA mRNA在3組內(nèi)膜中的相對(duì)表達(dá)量 其中uPA mRNA在EMs異位內(nèi)膜組中的表達(dá)明顯高于EMs在位內(nèi)膜組、正常內(nèi)膜組，在EMs在位內(nèi)膜組中的表達(dá)高于正常內(nèi)膜組，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 uPA mRNA在3組內(nèi)膜中的表達(dá)

3 討 論

EMs發(fā)生可能要經(jīng)過3個(gè)階段即異位內(nèi)膜的黏附、侵襲及血管形成，但異位內(nèi)膜侵襲并破壞周圍正常器官組織除了需要辨別、黏附的能力，還需要酶類，如蛋白水解酶，來降解細(xì)胞外基質(zhì)、基底膜等細(xì)胞成分。在異位內(nèi)膜的侵襲及轉(zhuǎn)移過程中，存活及生長需要大量的微血管形成以保證其營養(yǎng)供應(yīng)，而uPA在此過程中起著至關(guān)重要的作用。

uPA是一種絲氨酸蛋白水解酶，以無活性的單鏈（scuPA）和有活性的雙鏈（tc－uPA）兩種形式存在。當(dāng)細(xì)胞合成和分泌的sc－uPA與其特異性受體uPAR結(jié)合后，scPA被酶解成具有纖溶酶原激活劑活性的雙鏈形式tc－uPA，而大量有活性的uPA的聚集使纖溶酶原轉(zhuǎn)變成纖溶酶，降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜等多種成分，且可上調(diào)uPAR的表達(dá)［3］。此外，uPA與uPAR結(jié)合可激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞途徑，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和浸潤等生物學(xué)行為［4］。國內(nèi)有研究發(fā)現(xiàn)在癌變組織器官中uPA/uPAR高表達(dá)，也表明腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移與uPA/uPAR降解細(xì)胞外成分和激活細(xì)胞信號(hào)密切相關(guān)［5］。國外學(xué)者也在細(xì)胞和動(dòng)物惡性腫瘤模型水平通過小干擾RNA或相關(guān)拮抗劑下調(diào)uPA和uPAR的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)可以有效抑制惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移及增殖［6－7］。EMs在病理上雖是良性疾病，但卻有著類似于惡性腫瘤的種植、侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為。本研究結(jié)果表明，uPA蛋白在EMs患者異位內(nèi)膜腺上皮、間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于EMs在位內(nèi)膜及正常子宮內(nèi)膜，uPA mRNA在EMs患者異位、在位內(nèi)膜中的表達(dá)也明顯增強(qiáng)，且在整個(gè)月經(jīng)周期中持續(xù)表達(dá)，無明顯的波動(dòng)性，與陳露等［8］的研究結(jié)果uPA的高表達(dá)使其降解細(xì)胞周圍基質(zhì)及基底膜的能力增強(qiáng)，為異位內(nèi)膜的黏附、侵襲、轉(zhuǎn)移及形成異位病灶提供了必要條件的觀點(diǎn)基本一致。國內(nèi)學(xué)者的研究表明，在很大程度上腫瘤細(xì)胞中uPA的表達(dá)水平與其降解細(xì)胞外基質(zhì)、基底膜等細(xì)胞組分及其侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)［9］。因EMs的發(fā)病機(jī)制與惡性腫瘤相似，結(jié)合本研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)該觀點(diǎn)與EMs中uPA表達(dá)高低和異位內(nèi)膜侵襲性關(guān)系的密切程度相吻合。此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明uPA蛋白在EMs患者異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞中亦有表達(dá)，因此猜測(cè)uPA蛋白可能在異位內(nèi)膜的血管形成中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。uPA降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和基底膜，促使血管內(nèi)皮細(xì)胞在周圍組織間移動(dòng)、增殖、聚集，更容易形成血管腔，為異位的內(nèi)膜提供營養(yǎng)供應(yīng)。國外學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞釋放uPA/PAI－1復(fù)合物，而該復(fù)合物可促使人血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，進(jìn)一步支持uPA在EMs發(fā)病機(jī)制中的作用［10］。綜上所述，uPA與EMs發(fā)病階段中的異位內(nèi)膜的黏附、侵襲及血管生成密切相關(guān)。

總之，本研究結(jié)果顯示uPA mRNA及蛋白在EMs患者異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜的腺上皮、間質(zhì)細(xì)胞中呈高表達(dá)，一方面激活纖溶酶降解細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜，使異位內(nèi)膜細(xì)胞更易侵襲及轉(zhuǎn)移；另一方面uPA mRNA及蛋白在EMs患者異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞中表達(dá)，誘導(dǎo)微血管的形成為異位內(nèi)膜的黏附提供營養(yǎng)。二者共同促進(jìn)EMs的形成，為EMs的發(fā)病機(jī)制拓展一條新的思路，更為尋找EMs有效的藥物治療靶點(diǎn)提供依據(jù)，但uPA在EMs的發(fā)病機(jī)制中的具體作用仍不清楚，本課題組下一步希望通過uPA的激活劑及抑制劑干預(yù)EMs患者在位內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞后采用Transwell、RT－PCR、Western blot等試驗(yàn)方法檢測(cè)uPA蛋白、mRNA的表達(dá)及細(xì)胞侵襲性的變化進(jìn)一步驗(yàn)證uPA在EMs發(fā)生、發(fā)展中的作用。

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