林 琳，鄭 晶，朱偉平

（中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東珠海519000）

腎臟纖維化是各種腎臟疾病進(jìn)展到終末期腎衰竭的共同病理特征，以大量基質(zhì)蛋白積聚和成纖維細(xì)胞增殖為主要的病理表現(xiàn)［1］。已有大量研究顯示，腎小管上皮細(xì)胞－間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（EMT）在腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用［2］。TGF－β1通過(guò)TGF－β/Smad信號(hào)途徑上調(diào)整合素連接激酶（ILK），通過(guò)ILK調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、生存、分化和凋亡，從而引起細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的積聚是促進(jìn)腎臟纖維化的機(jī)制。已有研究報(bào)道，血管內(nèi)皮細(xì)胞－間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（EndMT）在心臟和腫瘤相關(guān)的器官纖維化中起重要作用［3］，并且可能在腎臟纖維化發(fā)病機(jī)制中有重要作用。ILK作為T(mén)GF－β/Smad通路的下游效應(yīng)因子可能參與介導(dǎo)EndMT，但是對(duì)于ILK介導(dǎo)TGF－β/Smad信號(hào)通路誘導(dǎo)EndMT在腎臟纖維化中的作用卻鮮有報(bào)道。本文研究ILK在EndMT及其信號(hào)傳導(dǎo)通路中的作用，將進(jìn)一步闡明腎臟纖維化的發(fā)生機(jī)制，并為腎臟纖維化的治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 原代人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞（HGEnC），購(gòu)自美國(guó)Scien Cell公司。

1.2 儀器與試劑 胎牛血清、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑、內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（美國(guó)Scien Cell公司），TGF－β1（美國(guó)Peprotech公司）；TGF－β1Ⅰ型 受 體 抑 制 劑 LY364749、ILK 抑 制 劑 QLT－0267（德國(guó)Merk公司），蛋白酶抑制劑（美國(guó)Roche公司），小鼠抗人E－cadherin、小鼠抗人α－SMA單克隆抗體、小鼠抗人成纖維細(xì)胞特異蛋白－1（FSP－1）單克隆抗體及小鼠抗人內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1（CD31）單克隆抗體（美國(guó)Sigma公司），兔抗人磷酸化Smad 2/3（p－Smad2/3）多克隆抗體、兔抗人ILK 單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司），異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記羊抗鼠IgG（丹麥DAKO公司），總RNA提取試劑盒、Trizol試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司），P－Smad2/3、ILK 及內(nèi)參GAPDH引物（上海鼎安生科科技有限公司）。引物及產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1。CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)SHELAB公司），EXL808全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó) BIO－TEK公司），SYBR Green PCR Reagents、ABI 7500Real Time PCR System（美 國(guó) ABI公司）。

表1 引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 原代細(xì)胞按常規(guī)方法復(fù)蘇后，加入含有5%胎牛血清、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑、內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，置37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)，選取第2～4代細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞張至70%～80%融合，用無(wú)血清培養(yǎng)基靜止24h進(jìn)行同步化后進(jìn)行試驗(yàn)。將同步化后的細(xì)胞按照105個(gè)/mL濃度接種入6孔板中，每孔2mL。將HGEnC分為6組。A組（空白對(duì)照）、B組（TGF－β112.5ng/mL）、C組（TGF－β125.0ng/mL）、D 組（TGF－β1 50.0ng/mL）、E 組（TGF－β1 50.0ng/mL＋LY364749 5.0μmol/mL）、F 組（TGF－β1 50.0 ng/mL＋QLT－0267 5.0μmol/mL），每組設(shè)12個(gè)復(fù)孔。

圖1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)的結(jié)果

1.3.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察 各組細(xì)胞分別培養(yǎng)48、72h采用倒置相關(guān)顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.3.3 RT－PCR 以 RT－PCR 測(cè)定 P－Smad2/3、ILK mRNA表達(dá)水平。按照說(shuō)明書(shū)提取試劑盒制備總RNA。取RNA樣品，用核酸分析儀進(jìn)行定量，測(cè)定260和280nm的吸光度（A）值，控制A260/A280在1.9～2.1。然后應(yīng)用ABI 7500Real Time PCR System進(jìn)行擴(kuò)增。使用基于內(nèi)參物GAPDH的相對(duì)定量分析，以2－△△Ct計(jì)算目的基因mRNA表達(dá)量。

1.3.4 Western－blot 以 Western－blot測(cè)定 P－Smad2/3、ILK及E－cadherin、CD31、α－SMA 和 FSP－1蛋白的表達(dá)。用 Trizol提取細(xì)胞總蛋白后BCA法測(cè)定蛋白濃度。采用凝膠電泳分離不同相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，脫脂奶粉室溫封閉1h，一抗4℃孵育過(guò)夜。漂洗3次后加入二抗室溫孵育2h。ECL化學(xué)發(fā)光、顯影和定影。用美國(guó)UVP公司LabWorks 4.5軟件對(duì)條帶進(jìn)行定量分析，以GAPDH為內(nèi)參，用目的蛋白吸光值與內(nèi)參吸光度值的比值代表目的蛋白的相對(duì)表達(dá)含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用±s表示，多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TGF－β1在EndMT過(guò)程中的作用

2.1.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)的結(jié)果 A組細(xì)胞多呈圓形和卵圓形。B組培養(yǎng)48h后已有部分轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，B組培養(yǎng)72h后更多內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，見(jiàn)圖1。

2.1.2 PCR結(jié)果 HGEnC與不同濃度 TGF－β1共同培養(yǎng)后P－Smad2/3和ILK mRNA水平顯著升高（P＜0.01），并且具有劑量依賴(lài)性（P＜0.01），見(jiàn)表2，圖2。

2.1.3 Western blots結(jié)果 HGEnC與不同濃度 TGF－β1共同培養(yǎng)后P－Smad2/3、ILK、α－SMA和 FSP－1蛋白水平顯著升高（P＜0.01），而 E－cadherin和 CD31水平顯著降低（P＜0.01），并且具有劑量依賴(lài)性（P＜0.01），見(jiàn)表3、圖3。

表2 各組細(xì)胞P－Smad2/3和ILK mRNA水平的比較（±s，n＝6）

表2 各組細(xì)胞P－Smad2/3和ILK mRNA水平的比較（±s，n＝6）

a：P＜0.01，與A組比較；b：P＜0.01，與B組比較；c：P＜0.01，與C組比較。

0.47±0.05 0.05±0.03 B組 0.63±0.06a 0.15±0.05a C組 0.84±0.08ab 0.26±0.04ab D組 1.30±0.09abc 0.48±0.06 ILK A組組別 P－Smad2/3 abc

圖2 PCR結(jié)果

2.2 ILK在 TGF－β1介導(dǎo)EndMT中的作用

2.2.1 PCR結(jié)果 TGF－β1Ⅰ型受體抑制劑LY364749均可顯著抑制 TGF－β1導(dǎo)致的P－Smad2/3和ILK mRNA水平的升高（P＜0.01）；ILK 抑制劑 QLT－0267均可顯著抑制 TGF－β1導(dǎo)致的ILK mRNA水平的升高（P＜0.01），但是對(duì)P－Smad2/3 mRNA無(wú)顯著影響（P＞0.05），見(jiàn)表4、圖4。

表3 各組細(xì)胞P－Smad2/3、ILK及E－cadherin、CD31、α－SMA和FSP－1蛋白水平的比較（±s，n＝6）

表3 各組細(xì)胞P－Smad2/3、ILK及E－cadherin、CD31、α－SMA和FSP－1蛋白水平的比較（±s，n＝6）

a：P＜0.01，與A組比較；b：P＜0.01，與B組比較；c：P＜0.01，與C組比較。

4±0.03 0.26±0.05 B組 1.23±0.10a 0.24±0.05a 0.52±0.05a 0.65±0.09a 0.32±0.05a 0.57±0.06a C組 1.57±0.16ab 0.46±0.08ab 0.42±0.03ab 0.54±0.07ab 0.39±0.04ab 0.86±0.09ab D組 2.54±0.21abc 0.86±0.11abc 0.32±0.05abc 0.43±0.06abc 0.73±0.06abc 1.76±0.12－SMA FSP－1 A組 0.98±0.08 0.12±0.03 0.68±0.04 0.84±0.09 0.2組別 P－Smad2/3 ILK E－cadherin CD31 α abc

圖3 Western blots結(jié)果

2.2.2 West blots結(jié)果 TGF－β1Ⅰ型受體抑制劑 LY364749均 可 顯 著 抑 制 TGF－β1 導(dǎo) 致 的 P－Smad2/3、ILK、α－SMA 和FSP－1蛋白水平的升高（P＜0.01），并且顯著抑制 E－cadherin和CD31蛋白水平的降低（P＜0.01）；ILK抑制劑 QLT－0267可顯著抑制TGF－β1導(dǎo)致的ILK、α－SMA和FSP－1蛋白水平的升高（P＜0.01），并且顯著抑制E－cadherin和CD31蛋白水平的降低（P＜0.01），但是對(duì)P－Smad2/3蛋白的抑制作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表5、圖5。

表4 3組細(xì)胞P－Smad2/3和ILK mRNA水平的比較（±s，n＝6）

表4 3組細(xì)胞P－Smad2/3和ILK mRNA水平的比較（±s，n＝6）

a：P＜0.01，與D組比較。

1.32±0.16 0.52±0.07 E組 0.84±0.09a 0.27±0.05a F組 1.29±0.07 0.31±0.06 ILK D組組別 P－Smad2/3 a

圖4 PCR結(jié)果

表5 3組細(xì)胞P－Smad2/3、ILK及E－cadherin、CD31、α－SMA和FSP－1蛋白水平的比較（±s，n＝6）

表5 3組細(xì)胞P－Smad2/3、ILK及E－cadherin、CD31、α－SMA和FSP－1蛋白水平的比較（±s，n＝6）

a：P＜0.01，與D組比較。

5±0.07 1.73±0.15 E 組 1.72±0.19a 0.48±0.09a 0.51±0.05a 0.61±0.06a 0.40±0.06a 0.94±0.11a F組 2.52±0.22 0.53±0.08a 0.44±0.04a 0.54±0.04a 0.44±0.06a 0.90±0.12－SMA FSP－1 D組 2.56±0.23 0.95±0.13 0.30±0.06 0.40±0.05 0.7組別 P－Smad2/3 ILK E－cadherin CD31 α a

圖5 Western blots結(jié)果

3 討 論

腎臟纖維化是多種腎臟疾病走向腎衰竭的共同途徑，是多種慢性腎病的共同病理基礎(chǔ)。既往認(rèn)為腎臟組織中肌成纖維細(xì)胞主要來(lái)源于局部固有成纖維細(xì)胞、骨髓源性細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞和EMT。2007年Zeiberg等［4］首次發(fā)現(xiàn)血管End－MT在心臟和腫瘤相關(guān)的器官纖維化中起重要作用。EndMT參與成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的堆積，提示EndMT可能是腎早期纖維化的主要原因［5］。EndMT可以被許多細(xì)胞和細(xì)胞因子所誘導(dǎo)，TGF－β被認(rèn)為是最重要的因子，在各種進(jìn)行性腎臟疾病發(fā)展為腎臟纖維化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，是引起腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化的主要介質(zhì)。ILK是一種絲氨酸－蘇氨酸蛋白激酶，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)ILK與腎臟間質(zhì)纖維化具有密切的關(guān)系［6］。目前認(rèn)為ILK通過(guò)整合素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和TGF－β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展。但是對(duì)于ILK介導(dǎo)TGF－β/Smad信號(hào)通路誘導(dǎo)EndMT的作用卻鮮有報(bào)道，因此本文對(duì)該過(guò)程中ILK介導(dǎo)TGF－β/Smad信號(hào)通路誘導(dǎo)的作用進(jìn)行研究。

在本研究中，TGF－β1與HGEnC共同培養(yǎng)后部分內(nèi)皮細(xì)胞已轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，因此初步提示 TGF－β1促進(jìn)了HGEnC的EndMT過(guò)程。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)TGF－β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)從細(xì)胞膜傳入細(xì)胞核與基因表達(dá)偶聯(lián)依賴(lài)于Smad家族蛋白的調(diào)節(jié)，而P－Smad2/3是 TGF－β1/Smad信號(hào)通路中的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，其mRNA和蛋白表達(dá)量則是TGF－β1/Smad信號(hào)通路激活程度的標(biāo)志［7］。TGF－β1與HGEnC共同培養(yǎng)后 PSmad2/3的mRNA和蛋白水平表達(dá)顯著升高，提示TGF－β1激活了HGEnC的TGF－β1/Smad信號(hào)通路。ILK是一種存在于細(xì)胞胞質(zhì)中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是參與細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳導(dǎo)通路形成的重要介質(zhì)，調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、生存、分化和凋亡［8］。本研究中TGF－β1與HGEnC共同培養(yǎng)后ILK的 mRNA和蛋白水平表達(dá)顯著升高，提示ILK參與HGEnC的End－MT過(guò)程。腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT會(huì)出現(xiàn)E－cadherin的丟失，以及表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞特異性的成纖維細(xì)胞特異性蛋白FSP－1、α－SMA等，從而轉(zhuǎn)分化為間質(zhì)成纖維細(xì)胞［9］，在本研究我們也觀(guān)察到HGEnC的EndMT過(guò)程出現(xiàn)類(lèi)似現(xiàn)象。

綜上所述，TGF－β1可促進(jìn)腎小球內(nèi)皮－間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，TGF－β/Smad信號(hào)通路參與了該過(guò)程，ILK是其重要的下游效應(yīng)因子，可能在腎臟纖維化過(guò)程發(fā)揮重要作用。

［1］謝愷慶，史偉，李東風(fēng)，等.C反應(yīng)蛋白誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞TGFl31表達(dá)的受體途徑［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2012，92（18）：1281－1284.

［2］Burns WC，Kantharidis P，Thomas MC.The role of tubular epithelial－mesenchymal transition in progressive kidney disease［J］.Cells Tissues Organs，2007，185（1/3）：222－231.

［3］Ghosh AK，Nagpal V，Covington JW，et al.Molecular basis of cardiac endothelial－to－mesenchymal transition（End－MT）：differential expression of microRNAs during End－MT［J］.Cell Signal，2012，24（5）：1031－1036.

［4］Zeisberg EM，Potenta SE，Sugimoto H，et al.Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial－to－mesenchymal transition［J］.J Am Soc Nephrol，2008，19（12）：2282－2287.

［5］陳蓉，謝梅林.TGF－β/Smads信號(hào)通路在心肌纖維化發(fā)生和治療中應(yīng)用前景的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2012，28（9）：1189－1192.

［6］Liu BC，Li MX，Zhang JD，et al.Inhibition of integrinlinked kinase via a siRNA expression plasmid attenuates connective tissue growth factor－induced human proximal tubular epithelial cells to mesenchymal transition［J］.Am J Nephrol，2008，28（1）：143－151.

［7］曹慧霞，牛福坤，尤冠巧，等.硫化氫對(duì) TGF－β1誘導(dǎo)的HK－2細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制作用［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2012，47（5）：654－657.

［8］牛洪琳，李英，劉茂東，等.貝那普利對(duì)高糖培養(yǎng)下大鼠腎小球系膜細(xì)胞整合素連接激酶及α平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)的影響［J］.中華腎臟病雜志，2013，29（1）：33－38.

［9］翟英，孫世仁，杜銳，等.早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子1過(guò)表達(dá)促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化［J］.腎臟病與透析腎移植雜志，2009，18（6）：537－541.