王千，李若瑜，劉偉

北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科，北京大學(xué)真菌與真菌病研究中心，皮膚病分子診斷北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100034

致病性曲霉的耐藥性研究進(jìn)展

王千，李若瑜，劉偉

北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科，北京大學(xué)真菌與真菌病研究中心，皮膚病分子診斷北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100034

隨著抗真菌藥物在臨床上的廣泛使用，致病性真菌的耐藥率越來越高，耐藥曲霉對侵襲性曲霉病的診治產(chǎn)生了重要影響。目前，致病性曲霉耐藥性的確定主要依靠抗真菌藥敏試驗(yàn)和分子診斷。在有關(guān)曲霉耐藥機(jī)制的研究中，報(bào)道最多的是曲霉對唑類藥物的耐藥，其機(jī)制主要包括外排泵表達(dá)增加、靶酶Cyp51突變和表達(dá)水平增高、形成生物膜，以及熱休克蛋白90(Hsp90)介導(dǎo)的信號通路參與而導(dǎo)致的耐藥。本文就上述領(lǐng)域近年來的主要進(jìn)展進(jìn)行綜述。

曲霉;耐藥;唑類抗真菌藥物

近年來，隨著實(shí)體器官移植和骨髓移植的開展、糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用等，免疫受損個(gè)體不斷增多。同時(shí)，由于抗生素的大量使用引起體內(nèi)菌群失調(diào)，導(dǎo)致侵襲性曲霉病(invasive aspergillosis)的發(fā)病率不斷上升。80%的侵襲性曲霉病由煙曲霉(Aspergillus fumigatus)引起，15% ～20%由黃曲霉引起，少數(shù)由黑曲霉和土曲霉引起［1］。

目前治療侵襲性曲霉病的藥物主要有4類:多烯類，如兩性霉素B;三唑類，如伊曲康唑、伏立康唑和泊沙康唑;棘白菌素類，如卡泊芬凈、米卡芬凈和阿尼芬凈［2］;烯丙胺類，如特比萘芬。雖然侵襲性曲霉病的診斷和治療水平不斷提高，但其病死率仍很高，耐藥菌株的出現(xiàn)是導(dǎo)致治療失敗的重要原因，感染耐唑類曲霉的侵襲性曲霉病患者病死率高達(dá)88%［3］。因此，對曲霉的耐藥性進(jìn)行早期診斷、研究曲霉的耐藥機(jī)制有利于檢測和控制耐藥曲霉病的發(fā)生。現(xiàn)就有關(guān)致病性曲霉的耐藥性進(jìn)展作一簡要綜述。

1 抗真菌藥敏試驗(yàn)及曲霉耐藥菌株的確定

可靠的藥敏試驗(yàn)?zāi)苤笇?dǎo)臨床合理選擇抗真菌藥物及監(jiān)測臨床療效。目前臨床上使用的藥敏試驗(yàn)方法主要包括肉湯常量和微量稀釋法、瓊脂擴(kuò)散法、紙片擴(kuò)散法和E-test法。這些技術(shù)在費(fèi)用、重復(fù)性、方法之間的兼容性及結(jié)果的解釋方面均有所不同［4］。

致力于提高體外藥敏試驗(yàn)的可重復(fù)性和客觀性，美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)于2008年推出了針對絲狀真菌敏感試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化方法M38-A2，歐洲抗菌藥物敏感性試驗(yàn)委員會(huì)(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST)也推出了針對絲狀真菌藥敏試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化方法E.DEF.9.1。這些藥敏試驗(yàn)方法的標(biāo)準(zhǔn)化對確定致病性曲霉的耐藥菌株具有重要意義。同時(shí)，有學(xué)者建議使用微量稀釋法確立唑類藥物對煙曲霉的判讀折點(diǎn):當(dāng)伊曲康唑和伏立康唑的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)＜2 mg/L時(shí)為敏感，MIC=2 mg/L為中介，MIC＞2 mg/L為耐藥;對于泊沙康唑，MIC＜0.25 mg/L、0.25＜MIC＜0.5 mg/L和MIC＞0.5 mg/L分別為敏感、中介和耐藥［5］。更多的多烯類和棘白菌素類藥敏終點(diǎn)判定的標(biāo)準(zhǔn)化工作正在進(jìn)行，判讀折點(diǎn)和藥敏試驗(yàn)的具體方法還有待進(jìn)一步確定。

2 曲霉耐藥的分子診斷

曲霉耐藥的分子診斷方法:通過設(shè)計(jì)引物，利用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)特異擴(kuò)增曲霉基因組(包含待檢測突變位點(diǎn)的基因序列)，隨后將其與包含突變位點(diǎn)的陽性序列進(jìn)行比對，判斷該曲霉是否發(fā)生了特定位點(diǎn)突變導(dǎo)致的耐藥［6］。目前，煙曲霉對唑類藥物耐藥的分子診斷方法主要是檢測cyp51A基因中的突變。PCR的模板DNA多來源于臨床菌株培養(yǎng)后收集、提取的基因組DNA［7］。

但Spiess等利用改良PCR，可直接將送檢標(biāo)本中提取的DNA作為模板，對目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測cyp51A中的突變熱點(diǎn)及啟動(dòng)子區(qū)插入的重復(fù)序列。目前可檢測的耐藥突變位點(diǎn)包括M220、TR34［8］、L98H［9］和TR46［6］。

3 耐藥機(jī)制

3.1 對多烯類藥物耐藥

多烯類抗真菌藥物通過與真菌細(xì)胞膜上的麥角固醇直接結(jié)合，造成細(xì)胞膜對單價(jià)和二價(jià)陽離子的通透性增加，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。目前用于治療侵襲性曲霉病的多烯類藥物主要包括兩性霉素B脫氧膽酸(D-AMB)及其含脂制劑(LFAB)(如兩性霉素B脂質(zhì)復(fù)合體、兩性霉素B脂質(zhì)體和兩性霉素B膠質(zhì)分散體)。其中D-AMB可用于侵襲性曲霉病的初始治療［2］。

在曲霉屬中，除土曲霉對兩性霉素B天然耐藥外，其繼發(fā)耐藥較少見，偶可發(fā)生于嚴(yán)重免疫抑制患者。關(guān)于致病性曲霉是否對多烯類藥物產(chǎn)生耐藥性，CLSI的M38-A2方案并沒有對兩性霉素B體外藥敏試驗(yàn)MIC判讀的折點(diǎn)作出明確規(guī)定。但有研究表明，體外藥敏試驗(yàn)中對兩性霉素 B MIC≥2 mg/L的菌株，在感染動(dòng)物模型中對兩性霉素B的治療無反應(yīng)［10］。此外，有學(xué)者利用藥代-藥效模型模擬體內(nèi)兩性霉素B的血藥濃度，確立了兩性霉素B對煙曲霉的判讀折點(diǎn):MIC≤0.5 mg/L、0.5＜MIC＜2 mg/L和≥2 mg/L分別表示敏感、中介和耐藥［11］。

曲霉對兩性霉素B耐藥的機(jī)制目前尚不明確，而土曲霉對兩性霉素B天然耐藥。以前有研究認(rèn)為，細(xì)胞膜麥角固醇減少是導(dǎo)致土曲霉對唑類藥物耐藥的重要因素［12］。然而，Blum等通過比較兩性霉素B耐藥土曲霉與敏感土曲霉，發(fā)現(xiàn)兩者細(xì)胞壁中麥角固醇的含量無顯著差異，但耐藥株胞內(nèi)藥物濃度低于敏感株，且抗氧化水平更好，表明麥角固醇的含量減少并非耐藥的主要影響因素［13］。

3.2 對唑類藥物耐藥

唑類藥物通過抑制麥角固醇合成途徑中的細(xì)胞色素P450 14α-去甲基酶(Cyp51)，引起羊毛固醇積聚及麥角固醇缺乏，使真菌細(xì)胞膜合成受阻，從而導(dǎo)致真菌細(xì)胞破裂而死亡。唑類藥物包括氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑等，后三者目前均可用于侵襲性曲霉病治療。根據(jù)2008年美國感染病學(xué)會(huì)(Infectious Diseases Society of America，IDSA)公布的曲霉病治療指南，伏立康唑被推薦為治療侵襲性曲霉病的首選藥物，伊曲康唑可用于補(bǔ)救治療，泊沙康唑可用于粒細(xì)胞缺乏、白血病或骨髓增生異常綜合征患者，以及發(fā)生移植物抗宿主病的同種異體造血干細(xì)胞移植受者等易發(fā)生曲霉病高?；颊叩念A(yù)防治療。歐洲尚批準(zhǔn)泊沙康唑用于伊曲康唑治療無效的侵襲性曲霉?。?］。

1997年Denning首次描述了煙曲霉對伊曲康唑產(chǎn)生耐藥性［14］。之后，有關(guān)耐唑類藥物的煙曲霉菌株報(bào)道增多，且部分菌株對伏立康唑等唑類藥物交叉耐藥。可以預(yù)測，致病性曲霉對唑類藥物的耐藥性將對侵襲性曲霉病治療藥物的選擇產(chǎn)生重要影響。目前，已知致病性曲霉對唑類藥物的耐藥機(jī)制主要有以下幾種。

3.2.1 藥物外排機(jī)制外排泵基因過表達(dá)使外排泵作用增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)唑類藥物含量減少導(dǎo)致煙曲霉耐藥。煙曲霉藥物外排泵包括兩類:一是ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette，ABC)蛋白，二是主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族(major facilitator superfamily，MFS)?；蚪M分析顯示，煙曲霉基因組中包含49個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因和278個(gè)MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因［15，16］。2002年Slaven等首次克隆了煙曲霉中的外排泵基因atrf，并用斑點(diǎn)雜交方法證實(shí)了伊曲康唑耐藥株中atrf表達(dá)量是敏感株的5倍［17］。最近，F(xiàn)raczek等對曼徹斯特地區(qū)的耐藥曲霉進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)＞50%的耐藥菌株無cyp51A或啟動(dòng)子區(qū)突變，并對非cyp51A突變的耐藥機(jī)制進(jìn)行了研究。研究表明，外排泵基因cdr1B過表達(dá)與耐唑類藥物有關(guān)［18］，但仍需開展大規(guī)模的基因過表達(dá)分析及基因敲除研究，以確定影響藥物外排泵基因表達(dá)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和轉(zhuǎn)錄因子在耐藥發(fā)生中的作用。

3.2.2 cyp51A基因突變Cyp51是唑類藥物的作用靶點(diǎn)，煙曲霉中唑類藥物靶酶的編碼基因有cyp51A和 cyp51B，黃曲霉中有 cyp51A、cyp51B和cyp51C，目前已明確煙曲霉的cyp51A突變與對唑類藥物的耐藥性密切相關(guān)。研究表明，煙曲霉cyp51A基因突變引起的靶酶Cyp51中G138和G448氨基酸替換導(dǎo)致其對伏立康唑和伊曲康唑耐藥;M220和G54的氨基酸替換能導(dǎo)致對伊曲康唑和泊沙康唑耐藥;M236的氨基酸替換能導(dǎo)致對伊曲康唑耐藥［5］。

2007年，荷蘭科學(xué)家發(fā)現(xiàn)很多侵襲性曲霉病患者(包括未使用過唑類藥物治療的原發(fā)患者)感染了對唑類藥物交叉耐藥的曲霉菌株，并發(fā)現(xiàn)其耐藥機(jī)制主要是由于TR34/L98H，即cyp51A基因啟動(dòng)子區(qū)34 bp串聯(lián)重復(fù)序列插入及編碼區(qū)98位亮氨酸突變?yōu)榻M氨酸［19］。2007～2011年，有6個(gè)歐洲國家(英國、西班牙、比利時(shí)、丹麥、法國和挪威)相繼報(bào)道了 TR34/L98H類型耐藥菌株。2012～2013年，更多國家報(bào)道了TR34/L98H耐藥菌株，其中包括來自德國的首次報(bào)道和法國的后續(xù)報(bào)道。關(guān)于原發(fā)耐藥菌株的來源，有學(xué)者利用基因標(biāo)記技術(shù)檢測了142株歐洲分離的耐藥菌株，發(fā)現(xiàn)TR34/L98H菌株的基因變異比敏感株或其他耐藥機(jī)制的菌株少。這表明歐洲的TR34/L98H耐藥株有共同的祖先，可能是在荷蘭，以后遷移至整個(gè)歐洲。相反，印度的TR34/L98H菌株(包括環(huán)境株和臨床分離株)均有相同的微衛(wèi)星基因型，但這種基因型未在其他區(qū)域發(fā)現(xiàn)，推測可能是唑類耐藥菌株與印度本土菌株雜交的結(jié)果［20］。

最近有學(xué)者在荷蘭報(bào)道了cyp51A基因啟動(dòng)子區(qū)46 bp串聯(lián)重復(fù)序列插入和編碼區(qū)121位、289位氨基酸替換(TR46/Y121F/T289A)的突變類型，可導(dǎo)致煙曲霉對伏立康唑耐藥［21］。隨后比利時(shí)學(xué)者也報(bào)道了這種基因型，表明其有地理上的擴(kuò)散［22］。本課題組新近確定，煙曲霉TR34/L98H菌株合并出現(xiàn)基因突變所致的T248N和L307P介導(dǎo)了對伏立康唑和伊曲康唑的交叉耐藥［23］。另外，還在國際上首次確定cyp51C的T788G錯(cuò)義突變可導(dǎo)致黃曲霉對伏立康唑耐藥［24］。

3.2.3 熱休克蛋白90熱休克蛋白90(heat shock protein 90，Hsp90)是一種常見的分子伴侶。研究表明，Hsp90可通過依賴鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，主要參與假絲酵母(又稱念珠菌)對唑類、曲霉對棘白菌素類藥物的適應(yīng)性反應(yīng)，使真菌出現(xiàn)快速耐藥。Cowen等通過構(gòu)建Hsp90表達(dá)量不同的菌株Lo90(低)、Re90(中)和Hi90(高)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)Hsp90含量與真菌耐藥性有關(guān)，含量越高耐藥性越強(qiáng)，如果Hsp90缺失，耐藥性也隨之消失;Hsp90對基因組各類突變及Erg3介導(dǎo)的耐藥性都是必需的［25］;耐藥性一旦出現(xiàn)，則菌株對Hsp90不再具有依賴性［26，27］。Hsp90抑制劑格爾德霉素聯(lián)合卡泊芬凈或他克莫司對唑類耐藥菌株有殺菌作用［28］。此外，Hsp90的賴氨酸殘基去乙?；瘜sp90活化具有重要意義，賴氨酸去乙?；?lysine deacetylase，KDAC)抑制劑可阻斷Hsp90活化，從而抑制耐藥性出現(xiàn)并增加曲霉的敏感性［29］。

此外，Hsp90可能還通過調(diào)節(jié)其他信號途徑來介導(dǎo)真菌對各種壓力的反應(yīng)［25］，是一種新型抗真菌藥物的作用靶點(diǎn)。

3.2.4 曲霉生物膜的形成生物膜是由細(xì)胞外多聚基質(zhì)包裹的菌絲相互黏附構(gòu)成的有結(jié)構(gòu)的微生物群落，是相對于游離狀態(tài)菌而言的微生物另一種存在方式。本課題組研究表明，煙曲霉可形成生物膜［30］，曲霉生物膜可通過藥物外排泵基因和唑類靶酶基因的表達(dá)量升高而對藥物產(chǎn)生耐藥［31］，棘白菌素類藥物與唑類藥物或兩性霉素B聯(lián)用可發(fā)揮對曲霉生物膜的協(xié)同殺傷作用［32］。

3.3 對棘白菌素類藥物耐藥

棘白菌素類藥物作用于真菌細(xì)胞壁，通過抑制1，3-β-D-葡聚糖合成酶，影響真菌細(xì)胞壁合成，使真菌生長過程中細(xì)胞壁葡聚糖缺乏、滲透壓失常而最終導(dǎo)致細(xì)胞溶解［2］。目前臨床常用的棘白菌素類藥物有卡泊芬凈、米卡芬凈及阿尼芬凈。

2008年，Eschertzhuber從1例心臟移植術(shù)后并發(fā)侵襲性曲霉病患者體內(nèi)分離出1株耐卡泊芬凈黃曲霉［33］。目前，耐棘白菌素類曲霉仍少見。Rocha等通過研究從實(shí)驗(yàn)室分離獲得的耐卡泊芬凈煙曲霉，發(fā)現(xiàn)其耐藥機(jī)制主要是由于編碼葡聚糖合成酶的基因fks1突變引起678位氨基酸替代(S678P)，導(dǎo)致卡泊芬凈、阿尼芬凈、米卡芬凈的最低有效濃度(minimal effect concentration，MEC)升高至 16 mg/L［34］。

此外，Lewis等利用感染了煙曲霉野生株和AfFKS1突變株(S678P)的中性粒細(xì)胞減少的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)卡泊芬凈、阿尼芬凈的給藥量每日＞0.5 mg/kg時(shí)能有效降低野生株負(fù)荷，但只有當(dāng)卡泊芬凈給藥量每日＜1 mg/kg、阿尼芬凈給藥量每日＞4 mg/kg時(shí)才能有效降低突變株負(fù)荷，證實(shí)Fks1中S678P突變導(dǎo)致菌株耐藥［35］。

但對臨床耐棘白菌素類曲霉的耐藥機(jī)制，由于缺乏臨床耐藥菌株而未能進(jìn)行更深入的研究和報(bào)道。

3.4 對烯丙胺類藥物耐藥

烯丙胺類抗真菌藥物通過抑制真菌的角鯊烯環(huán)氧化酶阻斷真菌細(xì)胞麥角固醇的合成，進(jìn)而破壞其細(xì)胞膜的生成。雖然烯丙胺類藥物主要用于淺部真菌病的治療，但有證據(jù)表明真對侵襲性曲霉病也有一定的療效15?。代表藥物有萘替芬、特比萘芬、布替萘芬等。有關(guān)特比萘芬耐藥的報(bào)道較少，但有研究表明，煙曲霉角鯊烯環(huán)氧化酶編碼基因ergA突變使389位氨基酸被替代(F389L)，可導(dǎo)致煙曲霉對特比萘芬耐藥［36］。另外，靶酶基因拷貝數(shù)增加也可導(dǎo)致煙曲霉對特比萘芬耐藥［37］。

4 結(jié)語

目前臨床上治療侵襲性曲霉病的首選藥物是唑類，但耐唑類菌株的出現(xiàn)使其在臨床上的應(yīng)用受到限制。因此，建立標(biāo)準(zhǔn)化的藥敏試驗(yàn)手段，開展分子診斷方法，深入研究致病性曲霉的耐藥機(jī)制，將有利于抗真菌藥物的合理使用和控制真菌耐藥的發(fā)生。

［1］ Krishnan S，Manavathu EK，Chandrasekar PH.Aspergillus flavus: an emerging non-fumigatus Aspergillus species of significance［J］.Mycoses，2009，52(3):206-222.

［2］ Walsh TJ， Anaissie EJ， Denning DW， HerbrechtR，Kontoyiannis DP，Marr KA，Morrison VA，Segal BH，Steinbach WJ，Stevens DA，van Burik JA，Wingard JR，Patterson TF; Infectious Diseases Society of America. Treatment of aspergillosis:clinical practice guidelines of the Infectious Diseases Society of America［J］.Clin Infect Dis，2008，46(3): 327-360.

［3］ van der Linden JW，Snelders E，Kampinga GA，Rijnders BJ，Mattsson E，Debets-Ossenkopp YJ，Kuijper EJ，Van Tiel FH，Melchers WJ，VerweijPE.Clinicalimplicationsofazole resistance in Aspergillus fumigatus，The Netherlands，2007-2009［J］.Emerg Infect Dis，2011，17(10):1846-1854.

［4］ Lass-Fl?rl C.In vitro susceptibility testing in Aspergillus species:an update［J］.Future Microbiol，2010，5(5): 789-799.

［5］ Verweij PE，Howard SJ，Melchers WJ，Denning DW.Azoleresistance in Aspergillus:proposed nomenclature and breakpoints［J］.Drug Resist Updat，2009，12(6):141-147.

［6］ Spiess B，Postina P，Reinwald M，Cornely OA，Hamprecht A，Hoenigl M，Lass-Fl?rl C，Rath PM，Steinmann J，Miethke T，Lauten M，Will S，Merker N，Hofmann WK，Buchheidt D.Incidence of Cyp51 A key mutations in Aspergillus fumigatus—a study on primary clinical samples of immunocompromised patients in theperiod of1995-2013［J］.PLoS One，2014，9 (7):e103113.

［7］ van der Linden JW，Jansen RR，Bresters D，Visser CE，Geerlings SE，Kuijper EJ，Melchers WJ，Verweij PE.Azoleresistant central nervous system aspergillosis［J］.Clin Infect Dis，2009，48(8):1111-1113.

［8］ Spiess B，Seifarth W，Merker N，Howard SJ，Reinwald M，Dietz A，Hofmann WK，Buchheidt D.Development of novel PCR assays to detect azole resistance-mediating mutations of the Aspergillus fumigatus cyp51A gene in primary clinical samples from neutropenic patients［J］.Antimicrob Agents Chemother，2012，56(7):3905-3910.

［9］ van der Linden JW，Snelders E，Arends JP，Daenen SM，Melchers WJ，Verweij PE.Rapid diagnosis of azole-resistant aspergillosis by direct PCR using tissue specimens［J］.J Clin Microbiol，2010，48(4):1478-1480.

［10］ Odds FC，Van Gerven F，Espinel-Ingroff A，Bartlett MS，Ghannoum MA，Lancaster MV，Pfaller MA，Rex JH，Rinaldi MG，Walsh TJ.Evaluation of possible correlations between antifungal susceptibilities offilamentous fungi in vitro and antifungal treatment outcomes in animal infection models［J］.Antimicrob Agents Chemother，1998，42(2):282-288.

［11］ Elefanti A，Mouton JW，Verweij PE，Zerva L，Meletiadis J.Susceptibility breakpoints for amphotericin B and Aspergillus species in an in vitro pharmacokinetic-pharmacodynamic model simulating free-drug concentrationsin human serum ［J］.Antimicrob Agents Chemother，2014，58(4):2356-2362.

［12］ Deak E，Wilson SD，White E，Carr JH，Balajee SA.Aspergillus terreus accessory conidia are unique in surface architecture，cell wall composition and germination kinetics［J］.PLoS One，2009，4(10):e7673.

［13］ Blum G，H?rtnagl C，Jukic E，Erbeznik T，Pümpel T，Dietrich H，Nagl M，Speth C，Rambach G，Lass-Fl?rl C.New insight into amphotericin B resistance in Aspergillus terreus［J］.Antimicrob Agents Chemother，2013，57(4):1583-1588.

［14］ Denning DW，Venkateswarlu K，Oakley KL，Anderson MJ，Manning NJ， Stevens DA， Warnock DW， Kelly SL.Itraconazole resistance in Aspergillus fumigatus［J］.Antimicrob Agents Chemother，1997，41(6):1364-1368.

［15］ Chamilos G，Kontoyiannis DP.Update on antifungal drug resistance mechanisms of Aspergillus fumigatus［J］.Drug Resist Updat，2005，8(6):344-358.

［16］ Nierman WC，Pain A，Anderson MJ，Wortman JR，Kim HS，Arroyo J，Berriman M，Abe K，Archer DB，Bermejo C，Bennett J，Bowyer P，Chen D，Collins M，Coulsen R，Davies R，Dyer PS，F(xiàn)arman M，F(xiàn)edorova N，F(xiàn)edorova N，F(xiàn)eldblyum TV，F(xiàn)ischer R，F(xiàn)osker N，F(xiàn)raser A，García JL，García MJ，Goble A，Goldman GH，Gomi K，Griffith-Jones S，Gwilliam R，Haas B，Haas H，Harris D，Horiuchi H，Huang J，Humphray S，Jiménez J，Keller N，Khouri H，Kitamoto K，Kobayashi T，Konzack S，Kulkarni R，Kumagai T，Lafon A，Latgé JP，Li W，Lord A，Lu C，Majoros WH，May GS，Miller BL，Mohamoud Y，Molina M，Monod M，Mouyna I，Mulligan S，Murphy L，O’Neil S，Paulsen I，Pe?alva MA，Pertea M，Price C，Pritchard BL，Quail MA，Rabbinowitsch E，Rawlins N，Rajandream MA，Reichard U，Renauld H，Robson GD，Rodriguez de Córdoba S，Rodríguez-Pe?a JM，Ronning CM，Rutter S，Salzberg SL，Sanchez M，Sánchez-Ferrero JC，Saunders D，Seeger K，Squares R，Squares S，Takeuchi M，Tekaia F，Turner G，Vazquez de Aldana CR，Weidman J，White O，Woodward J，Yu JH，F(xiàn)raser C，Galagan JE，Asai K，Machida M，Hall N，Barrell B，Denning DW.Genomic sequence of the pathogenic and allergenic filamentous fungus Aspergillus fumigatus［J］.Nature，2005，438(7071):1151-1156.

［17］ Slaven JW，Anderson MJ，Sanglard D，Dixon GK，Bille J，Roberts IS，Denning DW.Increased expression of a novel Aspergillus fumigatusABC transportergene，atrF，in the presence of itraconazole in an itraconazole resistant clinical isolate［J］.Fungal Genet Biol，2002，36(3):199-206.

［18］ Fraczek MG，Bromley M，Buied A，Moore CB，Rajendran R，Rautemaa R，Ramage G，Denning DW，Bowyer P.The cdr1B efflux transporter is associated with non-cyp51a-mediated itraconazole resistance in Aspergillus fumigatus ［J］. J Antimicrob Chemother，2013，68(7):1486-1496.

［19］ Mellado E，Garcia-Effron G，Alcázar-Fuoli L，Melchers WJ，Verweij PE，Cuenca-Estrella M，Rodríguez-Tudela JL.A new Aspergillus fumigatus resistance mechanism conferring in vitro cross-resistance to azole antifungals involves a combination of cyp51A alterations［J］.Antimicrob Agents Chemother，2007，51(6):1897-1904.

［20］ Vermeulen E，Lagrou K，Verweij PE.Azole resistance in Aspergillus fumigatus:a growing public health concern［J］.Curr Opin Infect Dis，2013，26(6):493-500.

［21］ van der Linden JW，Camps SM，Kampinga GA，Arends JP，Debets-Ossenkopp YJ，Haas PJ，Rijnders BJ，Kuijper EJ，van Tiel FH，Varga J，Karawajczyk A，Zoll J，Melchers WJ，Verweij PE.Aspergillosis due to voriconazole highly resistant Aspergillus fumigatus and recovery of genetically related resistant isolates from domiciles［J］.Clin Infect Dis，2013，57(4):513-520.

［22］ Vermeulen E，Maertens J，Schoemans H，Lagrou K.AzoleresistantAspergillusfumigatusdueto TR46/Y121F/T289A mutation emerging in Belgium，July 2012［J］.Euro Surveill，2012，17(48):pii=20326.

［23］ Sun Y，Liu W，Liu W，Tan J，Li F，Zhan Q，Wang C.Mechanism ofmultiple-azole-resistance in mixed Aspergillus fumigatus strains isolated from sputum of a patient with probable invasive aspergillosis failed to azole treatment［J］.Mycoses，2012，55(Suppl):89.

［24］ Liu W，Sun Y，Chen W，Liu W，Wan Z，Bu D，Li R.The T788G mutation in thecyp51C geneconfersvoriconazole resistance in Aspergillusflavuscausing aspergillosis［J］.Antimicrob Agents Chemother，2012，56(5):2598-2603.

［25］ Cowen LE，Lindquist S.Hsp90 potentiates the rapid evolution of new traits:drug resistance in diverse fungi［J］.Science，2005，309(5744):2185-2189.

［26］ Zhang J，Liu W，Tan J，Sun Y，Wan Z，Li R.Antifungal activity of geldanamycin alone or in combination with fluconazole against Candida species［J］.Mycopathologia，2013，175(3-4): 273-279.

［27］ Cowen LE.The evolution of fungal drug resistance:modulating the trajectory from genotype to phenotype［J］.Nat Rev Microbiol，2008，6(3):187-198.

［28］ Lamoth F，Juvvadi PR，Gehrke C，Steinbach WJ.In vitro activity of calcineurin and heat shock protein 90 inhibitors against Aspergillus fumigatus azole-and echinocandin-resistant strains［J］.Antimicrob Agents Chemother，2013，57(2):1035-1039.

［29］ Robbins N，Leach MD，Cowen LE.Lysine deacetylases Hda1 and Rpd3 regulate Hsp90 function thereby governing fungal drug resistance［J］.Cell Rep，2012，2(4):878-888.

［30］ 李麗娟，陳偉，許輝，萬喆，李若瑜，劉偉.曲霉生物膜的形成過程與結(jié)構(gòu)特征［J］.中國真菌學(xué)雜志，2011，6(2):93-97.

［31］ 李麗娟，陳偉，許輝，萬喆，李若瑜，劉偉.曲霉生物膜對常用抗真菌藥物的敏感性測定及其耐藥的分子機(jī)制初探［J］.中華皮膚科雜志，2011，44(6):382-386.

［32］ Liu W，Li L，Sun Y，Chen W，Wan Z，Li R，Liu W.Interaction of the echinocandin caspofungin with amphotericin B or voriconazole against Aspergillus biofilms in vitro［J］.Antimicrob Agents Chemother，2012，56(12):6414-6416.

［33］ Eschertzhuber S，Velik-Salchner C，Hoermann C，Hoefer D，Lass-Florl C.Caspofungin-resistant Aspergillus flavus after heart transplantation and mechanical circulatory support:a case report［J］.Transpl Infect Dis，2008，10(3):190-192.

［34］ Rocha EM，Garcia-Effron G，Park S，Perlin DS.A Ser678Pro substitution in Fks1p confers resistance to echinocandin drugs in Aspergillus fumigatus［J］.Antimicrob Agents Chemother，2007，51(11):4174-4176.

［35］ Lewis RE，Liao G，Hou J，Prince RA，Kontoyiannis DP.Comparative in vivo dose-dependent activity of caspofungin and anidulafungin againstechinocandin-susceptible and -resistant Aspergillus fumigatus［J］.J Antimicrob Chemother，2011，66 (6):1324-1331.

［36］ Rocha EM，Gardiner RE，Park S，Martinez-Rossi NM，Perlin DS.A Phe389Leu substitution in ergA confers terbinafine resistance in Aspergillus fumigatus［J］.Antimicrob Agents Chemother，2006，50(7):2533-2536.

［37］ Liu W，May GS，Lionakis MS，Lewis RE，Kontoyiannis DP.Extra copies of the Aspergillus fumigatus squalene epoxidase gene confer resistance to terbinafine:genetic approach to studying gene dose-dependent resistance to antifungals in A.fumigatus［J］.Antimicrob Agents Chemother，2004，48(7):2490-2496.

The progress in antifungal resistance of pathogenic Aspergillus spp.

WANG Qian，LI Ruo-Yu，LIU Wei
Department of Dermatology，Peking University First Hospital，Research Center for Medical Mycology，Beijing Key Laboratory of Molecular Diagnosis on Dermatoses，Peking University，Beijing 100034，China

With the wide use of antifungals in the clinic，there have been increasing reports of resistant strains of Aspergillus spp.to antifungals.The resistance of Aspergillus spp.has important impact on the diagnosis and treatment of invasive aspergillosis.Currently，the determination of antifungal resistance of pathogenic Aspergillus spp.relies on antifungal susceptibility testing and molecular detection.Recently，the resistance of Aspergillus spp.to antifungals is mainly focused on azole antifungals.The research progress on antifungal resistance of pathogenic Aspergillus spp.，including the diagnosis for resistance and the molecular mechanisms，such as over-expression of efflux pumps，mutations in the target enzyme(Cyp51)，formation of biofilm and heat shock protein 90(Hsp90)-mediated signaling pathways are reviewed.

Aspergillus spp.;Drug resistance;Azole antifungals

.LIU Wei，E-mail:liuwei@bjmu.edu.cn

2014-11-18)

國家自然科學(xué)基金(81471925)，教育部“新世紀(jì)人才支持計(jì)劃”(NCET-10-0198)

劉偉