韓文霞，宋 濤，李偉澤，張 寒，邵明明，武永紅

(1.西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系，陜西 西安 710021；2.空軍工程大學(xué)校務(wù)部門診部，陜西 西安 710051)

產(chǎn)石杉堿甲新資源研究方法探索

韓文霞1，宋 濤2，李偉澤1，張 寒1，邵明明1，武永紅1

(1.西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系，陜西 西安 710021；2.空軍工程大學(xué)校務(wù)部門診部，陜西 西安 710051)

從老年癡呆癥藥物需求研究到藥物生產(chǎn)開發(fā)全方位視角對近期治療老年癡呆癥一線藥物-石杉堿甲來源及生產(chǎn)的發(fā)展與動態(tài)進(jìn)行綜述，并對今后產(chǎn)石杉堿甲菌株研發(fā)方法進(jìn)行了展望。源于天然植物的藥物開發(fā)歷史悠久且富有生命力，植物提取獲得石杉堿甲為最簡便方式，但植物提取獲得石杉堿甲已面臨植物資源匱乏瓶頸；化學(xué)合成生產(chǎn)石杉堿甲仍是研發(fā)重要途徑之一，但合成步驟繁瑣、代價昂貴，很難獲得純光學(xué)活性的合成物；利用從野生蛇足石杉內(nèi)分離獲得的內(nèi)生真菌及其發(fā)酵液中提取石杉堿甲正在取得成效；依托生物技術(shù)改造菌株獲得石杉堿甲將會是工業(yè)化生產(chǎn)開發(fā)的一個重要方向。

老年癡呆癥；石杉堿甲；蛇足石杉；內(nèi)生真菌；菌株改造

伴隨世界人口結(jié)構(gòu)老齡化進(jìn)一步加劇，阿爾茨海默病防治已變?yōu)槿蜿P(guān)注焦點(diǎn)。阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)又名老年癡呆癥。目前發(fā)展中國家AD患者人數(shù)占全球AD患者總?cè)藬?shù)的56%，預(yù)計(jì)到2050年將增至71%左右。在AD藥物市場上目前乙酰膽堿酯酶抑制劑類藥物處于主導(dǎo)地位，主要治療藥物有加蘭他敏、多奈哌齊、卡巴拉汀、他克林、美金剛、石杉堿甲。石杉堿甲為從草藥蛇足石杉中提取獲得的有效成分，是治療AD的一線藥物，但目前國內(nèi)外面臨重大技術(shù)難題是植物提取面臨生產(chǎn)周期長，資源匱乏、提取含量及其低微而難以滿足臨床需求的困難；化學(xué)合成面臨成本高、副產(chǎn)物多、純化困難、污染環(huán)境等而難以大規(guī)模應(yīng)用困難。因此，尋求更有效的生物合成獲得途徑生產(chǎn)石杉堿甲將成為今后藥物研究的熱點(diǎn)。本文對老年癡呆癥發(fā)展趨勢、發(fā)病機(jī)理、治療藥物、藥物來源與生產(chǎn)途徑做了全面綜述，以期為進(jìn)一步生物合成生產(chǎn)石杉堿甲提供參考。

1 老年癡呆癥

1.1 老年癡呆癥發(fā)展趨勢 據(jù)中國阿爾茨海默病協(xié)會2011年發(fā)布的最新調(diào)查結(jié)果顯示，全球約有3650萬人患有AD，每7 s中就會有一個人患上該疾病，患者的平均生存期一般只有5.9年，已逐步成為威脅老年人健康的主要疾病之一。1998年我國60歲以上人口達(dá)到1.2億，并已呈現(xiàn)出老齡化進(jìn)一步加快趨勢，每年以3.2%左右速度遞增，本世紀(jì)中葉可達(dá)4億左右，我國將成為世界上老齡人口最多的國家，由此導(dǎo)致老年癡呆癥(Alzheimer's disease，AD)患者急劇增多，由此表明AD藥物市場將是一個容量巨大、前景廣闊的藥物市場。

1.2 老年癡呆癥發(fā)病機(jī)理 AD是一種以進(jìn)行性癡呆為主要特征的神經(jīng)元退變性疾病，主要表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能衰退、記憶力衰退、性格及行為改變等。乙酰膽堿(Acetyl choline，Ach)是中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，它由膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶(Choline acetylase，ChAT)合成、乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase，AchE)分解，通過Ach受體直接參與植物神經(jīng)功能調(diào)節(jié)、肌肉運(yùn)動、大腦思維與記憶功能等；ChAT和AchE活性發(fā)生變化，隨后導(dǎo)致Ach代謝失調(diào)，最終使中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的生化特征改變，此為誘發(fā)AD發(fā)病的重要原因之一。

1.3 治療老年癡呆癥臨床一線藥物 目前乙酰膽堿酯酶抑制劑類藥物在AD藥物市場上處于主導(dǎo)地位。石杉堿甲(Huperzine A，HA)為從民間草藥蛇足石杉中分離獲得的新型石松類單體生物堿，具有多靶點(diǎn)作用，不僅能夠阻斷AchE對Ach的降解而增加腦內(nèi)Ach的濃度以提高學(xué)習(xí)和記憶功能；還可以由多因素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等神經(jīng)元毒性作用得到抑制[1-2]，使實(shí)驗(yàn)性記憶損害得到顯著性改善。HA是一種強(qiáng)效的可逆性的膽堿酯酶抑制劑，對AchE的抑制作用為毒扁豆堿的3倍、加蘭他敏的30倍[3]，而且外周不良反應(yīng)低。因此，HA將成為AD藥物市場上的新秀，具有廣泛的臨床應(yīng)用價值。

2 石杉堿甲

2.1 石杉堿甲的天然來源 近年來，石杉堿甲主要來源為從天然蛇足石杉的植株中提純獲得。目前由天然植株可以獲得HA的植物主要有：蛇足石杉、馬尾杉、藤石松、小接筋草。野生條件下，從孢子落地萌發(fā)到地下配子體的生成乃至形成成熟的孢子體，這個過程至少需要15年時間而且產(chǎn)孢量極其低，又難以收集。而由成熟的孢子長成一株高12 cm左右的幼苗，至少需要6年以上的時間。因此依靠天然提取獲得石杉堿甲的資源相當(dāng)有限，且石杉堿甲在蛇足石杉全草中含量甚微，石杉堿甲的獲得難以滿足臨床需求。也有學(xué)者嘗試通過植物組織培養(yǎng)及植株培育方面進(jìn)行研究[4-7]。但所獲得植株生長速度依然較緩慢，大面積的農(nóng)業(yè)推廣和藥物利用依然較難以推進(jìn)。因此，僅靠天然提取法獲得HA還遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了市場和臨床用藥的需求。

2.2 石杉堿甲化學(xué)來源 近些年國外在分離產(chǎn)HA菌株方面研究較少[8-12]，國外主要集中在利用化學(xué)方法合成HA。由于石杉堿甲的特殊療效及臨床藥物的大量需求，國內(nèi)外研究學(xué)者對HA衍生物、其類似物的合成及全合成做了眾多的研究，但其合成步驟繁瑣、代價較高，且存在環(huán)境污染及難以獲得純光學(xué)活性合成物，至今仍無法進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)[13-17]。因此利用生物手段尋找石杉堿甲來源成為關(guān)注的熱點(diǎn)。

2.3 石杉堿甲微生物來源 HA作為一種非常有潛力的治療AD一線臨床藥物，科研學(xué)者正致力于對其進(jìn)行深入研究。鑒于植物提取和化學(xué)合成法生產(chǎn)HA都面臨困難，難以滿足臨床需求，因此研究石杉堿甲的新的獲得途徑更加迫切?；趦?nèi)生真菌與其共生的宿主可以交換遺傳物質(zhì)這一理論，從野生蛇足石杉中可以分離純化內(nèi)生真菌獲得產(chǎn)石杉堿甲菌株。在內(nèi)生真菌分離方面，目前國內(nèi)主要是從我國蛇足石杉(千層塔)中分離出芽胞菌屬(Blastomyces Cost. ex Roll)、支頂孢屬(Acremonium)、葡萄孢屬(Botrytis Pets.ex Fr)、黃曲霉(Aspergillus flavus)、鐮刀菌(Fusarium sp.)、炭角菌(Xycarialern species)、枝孢芽枝屬(Cladosporium cladosporioides)、纖姿擬青霉(Paecilonmyces tennis)、炭角菌目(Xylariales)、膠胞炭疽菌(C.gheosporioideES026)、產(chǎn)黃青霉屬(Penicillium chrysogenum)、柄孢殼菌屬(Podospora)內(nèi)生真菌菌株[18-24]。已分離獲得的內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物中能夠提取出與宿主植物相同的活性成分HA，但野生菌發(fā)酵次生代謝產(chǎn)物中所含石杉堿甲量甚微，離工業(yè)化生產(chǎn)石杉堿甲還有很大距離。

3 微生物來源石杉堿甲菌株改造研究方向

隨著植物資源開發(fā)利用及面臨資源匱乏難題，如能采用生物合成途徑利用高產(chǎn)HA內(nèi)生真菌發(fā)酵生產(chǎn)石杉堿甲，不僅能有效地解決臨床一線用藥需求，拓寬石杉堿甲的藥物來源、降低成品藥品的價格，而且可有效地保護(hù)生態(tài)環(huán)境。因此如何采用生物學(xué)方法制備HA成為當(dāng)今最受人關(guān)注的研究課題。

3.1 原生質(zhì)體融合技術(shù) 隨著食用菌育種需求的發(fā)展，原生質(zhì)體技術(shù)應(yīng)用越來越廣泛。迄今，國內(nèi)外學(xué)者利用原生質(zhì)體技術(shù)對食用菌育種進(jìn)行了大量的研究[25-28]，已成功從50多種食用菌中制備獲得原生質(zhì)體，并對獲得的菌種進(jìn)行了大量研究。目前在真菌育種基礎(chǔ)研究如微生物遺傳育種、酶的定位、細(xì)胞壁的合成和基因定位工作中應(yīng)用廣泛。當(dāng)今國內(nèi)外應(yīng)用原生質(zhì)體進(jìn)行誘變育種的技術(shù)也趨于成熟化，常用的技術(shù)包括：原生質(zhì)體的制備與再生、原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體誘變、轉(zhuǎn)化及固定化等技術(shù)[29-30]。該技術(shù)在研究微生物細(xì)胞遺傳特性的改造中起著重要作用，與菌體細(xì)胞相比，原生質(zhì)體的成功制備使細(xì)胞缺乏細(xì)胞壁的保護(hù)，因此在各種誘變因素作用下更易發(fā)生基因變異。而在其誘變篩選技術(shù)中，誘變選育效率與原生質(zhì)體的制備與再生條件的成功獲得息息相關(guān)。且原生質(zhì)體的獲得也為下一步原生質(zhì)體的融合奠定基礎(chǔ)。原生質(zhì)體作為一種簡單高效的菌種改造實(shí)驗(yàn)材料，已經(jīng)在微生物學(xué)育種中得到廣泛應(yīng)用。近年來，隨著工業(yè)和醫(yī)藥迅速發(fā)展，為獲得更好的經(jīng)濟(jì)效益，真菌原生質(zhì)體的研究對象逐漸轉(zhuǎn)向具有工業(yè)和臨床價值的生產(chǎn)菌株[31-35]。

3.2 微生物轉(zhuǎn)化法 微生物轉(zhuǎn)化方法就是利用微生物細(xì)胞代謝過程中產(chǎn)生的一種或多種酶類對復(fù)雜底物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造或修飾。目前微生物轉(zhuǎn)化方法主要包括：固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化法，固定化酶轉(zhuǎn)化法，連續(xù)轉(zhuǎn)化法，分批轉(zhuǎn)化法，孢子轉(zhuǎn)化法，靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化法和干細(xì)胞轉(zhuǎn)化法。微生物轉(zhuǎn)化是利用單一微生物的單酶或多酶進(jìn)行的高密度轉(zhuǎn)化，本質(zhì)為酶催化轉(zhuǎn)化，而直接發(fā)酵法是利用多種微生物的酶進(jìn)行的低密度轉(zhuǎn)化。因此，微生物轉(zhuǎn)化具有產(chǎn)物濃度高、副產(chǎn)物少、轉(zhuǎn)化率高、工藝及后處理簡單的優(yōu)點(diǎn)。微生物轉(zhuǎn)化與化學(xué)合成方法相比同樣具有很多優(yōu)勢，如可有效減少副反應(yīng)及合成步驟、操作條件簡單溫和、提高產(chǎn)率同時大大縮減生產(chǎn)周期等。高度的選擇性為微生物轉(zhuǎn)化的最大優(yōu)勢，利用微生物轉(zhuǎn)化方法可對于某些難以進(jìn)行或反應(yīng)復(fù)雜的有機(jī)化學(xué)反應(yīng)專一、高效地完成[36]。近些年，利用微生物轉(zhuǎn)化法進(jìn)行研究逐漸成為研究熱點(diǎn)[37-44]。探索研究采用微生物轉(zhuǎn)化法，通過利用微生物酶系的修飾作用將底物轉(zhuǎn)化成HA，將會為HA合成開辟一條新的獲得途徑。

3.3 遺傳轉(zhuǎn)化研究 自20世紀(jì)90年代以來，真菌遺傳轉(zhuǎn)化已經(jīng)取得顯著進(jìn)展。近年來，隨著真菌在分子生物學(xué)水平上的研究及進(jìn)展，真菌的全基因組序列測序越來越多，約有上百種真菌成功實(shí)現(xiàn)了遺傳轉(zhuǎn)化。依托大規(guī)模隨機(jī)和定點(diǎn)突變技術(shù)的應(yīng)用，改變真菌的遺傳物質(zhì)，真菌生物學(xué)的研究進(jìn)入了功能基因組學(xué)時代。遺傳轉(zhuǎn)化的研究為深入探明真菌的一些代謝及生理機(jī)制提供了有效方法。當(dāng)前實(shí)現(xiàn)真菌的遺傳轉(zhuǎn)化主要方法：通過原生質(zhì)體融合進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化(不借助載體)、聚乙二醇介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法(Polyethlene glycol，PEG)、電擊轉(zhuǎn)化法(Eiectroporation)、電注射法(Electric injection)、基因槍法(Gene gun bombardment)、限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法(Restriction Ellzyme Mediated DNA Integrafi,REMI)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法(Agrobacterium tumefaciens—mediatedtransformation，ATMT)，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化是目前應(yīng)用最為廣泛的方法。1995年Bundock等[45]首次對釀酒酵母應(yīng)用農(nóng)桿菌質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)了遺傳轉(zhuǎn)化。1998年De Groot等[46]構(gòu)建了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌轉(zhuǎn)化體系，并證明菌組織、原生質(zhì)體、孢子、菌絲都可作為農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的初始材料。自此之后利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化的真菌已達(dá)100多種[47]，并有多種真菌利用該方法構(gòu)建了含豐富類型轉(zhuǎn)化子的突變體庫。

4 本實(shí)驗(yàn)產(chǎn)石杉堿甲菌株改造研究方向

本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中從健康蛇足石杉植株中分離獲得7株產(chǎn)生物堿內(nèi)生真菌，其中1株菌在搖瓶條件下產(chǎn)生石杉堿甲，為提高產(chǎn)HA菌株的活性，我們采用誘變育種的方法對菌株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室馴化。目前，在產(chǎn)石杉堿甲菌種選育方面，國內(nèi)外多以菌體細(xì)胞為作用對象，采用各種物理誘變和化學(xué)誘變手段進(jìn)行改造，而以原生質(zhì)體作為誘變對象以期獲得HA高產(chǎn)菌株尚未見相關(guān)研究和報(bào)道。本項(xiàng)目通過研究不同因素對HA產(chǎn)生菌原生質(zhì)體制備與再生的影響，以期獲得原生質(zhì)體制備和再生的最佳條件，為下一步誘變育種獲得HA高產(chǎn)菌株提供條件，也為原生質(zhì)體的融合和進(jìn)一步菌株基因的開發(fā)利用打下了基礎(chǔ)。

鑒于目前國內(nèi)外生物合成途徑中面臨的巨大技術(shù)難點(diǎn)是從野生蛇足石杉中分離獲得野生菌株產(chǎn)HA含量較低，且野生菌株在長期脫離宿主植株后將會丟失產(chǎn)石杉堿甲能力，因此本實(shí)驗(yàn)室研究解決的關(guān)鍵科學(xué)問題之一就是克隆石杉堿甲生物合成基因，構(gòu)建產(chǎn)HA菌株轉(zhuǎn)化體系和克隆載體生物表達(dá)體系，讓高產(chǎn)有效基因可以長期穩(wěn)定存在于菌株中。此外，通過對產(chǎn)HA菌株高產(chǎn)有效基因進(jìn)行測序，在分子水平上闡明高產(chǎn)有效基因表達(dá)的新的酶蛋白參與HA生物合成機(jī)理又是本實(shí)驗(yàn)室解決的另一個關(guān)鍵問題。通過能基于以上研究提出新的生物合成HA研究方法，解決臨床用藥問題；提出新的研究策略，指導(dǎo)瀕危植物有效成分生物合成在分子水平上的研究；提出新的科學(xué)假設(shè)，揭示全新合成機(jī)制。

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Progress on the research methods for developing new resources of huperzine A.

HAN Wen-xia1,SONG Tao2,LI Wei-ze1,ZHANG Han1,SHAO Ming-ming1,WU Yong-hong1.
1.Department of Medical Technology,Xi'an Medical University,Xi'an 710021,Shaanxi,CHINA;2.Clinic,Department of Administrative Affairs,Air Force Engineering University,Xi'an 710051,Shaanxi,CHINA

Huperzine A recently serves as the first-line drug for treating Alzheimer's disease.This paper reviews the latest progress in source and development of Huperzine A from the comprehensive angles of drug needs and pharmaceutical industry.The development of transformation methods in future is prospected.Extraction from natural herbs,as the most convenient way for obtaining huperzine A,has a long history and still has great vitality.However, the method has been faced with a bottleneck of limited plant resources.Chemical synthesis is still one of the important ways for development of huperzine A,but it has the disadvantages of trivial steps,high cost and difficulty in obtaining composites with pure optical activity.Now,adopting biological techniques to obtain huperzine A from endophytic fungi and fermentation of H.serrata has been making great progress.It is recognized that utilizing biological techniques for transformation would become one of the important directions in industrial production of huperzineA.

Alzheimer's disease;HuperzineA;H.serrata;Endophytic fungi;Transformation

R969.4

A

1003—6350（2015）15—2275—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.15.0819

2015-03-01)

國家自然科學(xué)基金(編號：81303231)；陜西省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目(編號：14JK1632)；陜西省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(編號：1753、1636）

韓文霞。E-mail：wenxiahanwendy@163.com