王書冉, 高艷芳， 張　良， 劉　洋， 萬　青， 呂　寧

(新鄭市疾病預防控制中心 檢驗科，河南 新鄭451150)

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金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒檢測分析

王書冉, 高艷芳， 張良， 劉洋， 萬青， 呂寧

(新鄭市疾病預防控制中心 檢驗科，河南 新鄭451150)

[摘要]目的探討金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測方法，為食物中毒處理提供依據(jù)。方法以食物樣本為實驗材料， 按照GB/T4789.10-2003，對樣品進行金黃色葡萄球菌檢測及計數(shù)，并對相關(guān)腸毒素基因SEA、SEB、SECs進行PCR擴增。結(jié)果實驗標本進行染色鏡檢，結(jié)果為革蘭陽性金黃色葡萄球菌，血漿凝固酶試驗陽性，菌落為8.5×107cfu/g，實驗標本發(fā)現(xiàn)SEA、SEB、SECs基因。結(jié)論金黃色葡萄球菌腸毒素SEA、SEB、SECs基因可能是該例食物中毒的原因，加強金黃色葡萄球菌及其腸毒素的檢驗是迫切需要解決的一個問題。

[關(guān)鍵詞]金黃色葡萄球菌；腸毒素 ；食物中毒

金黃色葡萄球菌(簡稱金葡菌)是引起人類食物中毒最常見的病原菌，產(chǎn)生的毒素主要有腸毒素、殺白細胞毒素、表皮剝脫毒素等，侵襲性酶類有血漿凝固酶、脂肪酶、透明質(zhì)酸酶和溶纖維蛋白酶。一旦毒素在體內(nèi)大量集聚，可以造成炎癥反應，如肺炎、心包炎、腸炎等，嚴重可造成多器官功能障礙。根據(jù)我國近年對食源性疾病的分析，大部分由金黃色葡萄球菌腸毒素引起[1]。筆者就新鄭市發(fā)生的1例由金葡菌的食源性中毒進行分析，采用PCR方法檢測3種腸毒素基因(SEA、SEB、SECs)。

1材料和方法

1.1流行病學調(diào)查某人在食用不潔食物后，發(fā)生惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、發(fā)熱等癥狀。 通過流行病學調(diào)查，確診為金黃色葡萄球菌污染引起的食物中毒。

1.2檢測方法

1.2.1實驗標本以送至新鄭市疾病預防控制中心進行檢查的食物樣本為實驗材料。

1.2.2標準菌株金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、表皮葡萄球菌、乙型副傷寒沙門氏菌、福氏志賀氏菌購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2.3主要儀器及材料數(shù)控恒溫水浴槽、恒溫培養(yǎng)箱、低溫冷凍高速離心機、PCR擴增儀、自動凝膠成像分析系統(tǒng)、氯化鈉肉湯、Baird-Parker瓊脂、營養(yǎng)肉湯、凍干血漿、新鮮羊血、PCR試劑、硼酸、溴化乙啶、EDTA。

1.2.4引物(1)SEA引物為： 5’-AGTCTGAATTGCAGGGAACAGC-3’，擴增產(chǎn)物大小288bp。(2)SEB引物為：5’-TAGTTATTTCTACACCCAACG -3’，擴增產(chǎn)物大小641bp。(2)SECs引物為：5’-TGGTGCAGGCATCATATCATACC-3’，擴增產(chǎn)物大小641bp。

1.3實驗方法

1.3.1標準菌株復蘇用0.5 mL BP溶解凍干株，移入增菌液中增菌，轉(zhuǎn)種于平板。

1.3.2金黃色葡萄球菌檢測按照GB/T4789.10-2003進行，對樣品進行金葡菌檢測并計數(shù)。

1.3.3DNA模板提取細菌 DNA后，從血平板和Baird-Parker平板上挑取可疑菌落，加入滅菌純水，100℃煮沸10分鐘，離心，取上清液。余標準菌株模板制備方法同上。

1.3.4PCR檢測分別對SEA、SEB、SECs基因進行PCR擴增。以DL2000maker為標準，制備瓊脂糖，取PCR擴增產(chǎn)物，電泳30 min，觀察電泳結(jié)果。

2結(jié)果

2.1染色鏡檢、血漿凝固酶試驗和菌落計數(shù)實驗標本進行染色鏡檢，結(jié)果為革蘭陽性金黃色葡萄球菌，血漿凝固酶試驗陽性，菌落為8.5×107cfu/g。

2.2PCR試驗實驗標本增出SEA、SEB、SECs基因。對照菌株未擴增出相應片段。

3討論

典型的金葡菌為球形，無鞭毛，大多無莢膜，不能運動，金葡菌在普通的培養(yǎng)基上可良好生長，為兼性厭氧菌，有很強的環(huán)境適應性，金葡菌腸毒素耐熱并且不受胰白酶的影響，在70℃水中1 h不能被殺死，在-10~15℃中不能被凍死，需要在100℃加熱2 h才能將其破壞。蔗糖或者含鹽豐富的食品才可抑制其生長[2]。金葡菌可分解葡萄糖、乳糖、蔗糖等有機物質(zhì)，部分菌種可水解尿素，還原硝酸鹽。金葡菌在環(huán)境中均可找到，在人體主要寄殖于鼻黏膜、腹股溝等部位，偶寄生于口咽部、腸道，人群為該病原菌的攜帶者。金葡菌腸毒素引起食物中毒的特征是潛伏期短。學者認為金葡菌腸毒素作用于胃腸道神經(jīng)細胞受體，達中樞神經(jīng)系統(tǒng)刺激嘔吐中樞，還可通過T細胞、巨噬細胞等細胞因子導致嘔吐和腹瀉。此外T細胞被激活后，人體早期體液免疫IgM蛋白的合成受到抑制，加以巨噬細胞清除功能被抑制，細菌大量產(chǎn)生內(nèi)毒素，引起休克、心肌細胞、肝細胞壞死[3]。

因金葡菌產(chǎn)生的毒素和酶最多，分泌多種毒性蛋白質(zhì)，毒力強，是食品安全檢測衛(wèi)生中的重要檢測項目。這些毒性物質(zhì)中最主要的一種是葡萄球菌腸毒素，腸毒素是導致暴發(fā)性食物中毒的致病因子，人食入含1~20 μg腸毒素的食品就可致病。溫度適宜時，金葡菌在6~12 h大量繁殖產(chǎn)生腸毒素，污染食品引起食物中毒。

金葡菌的檢測手段主要有顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)、金葡菌快速測試方法、免疫學方法等。對于金葡菌腸毒素檢查，傳統(tǒng)采取動物實驗中，因非腸毒素類產(chǎn)物也可致幼貓嘔吐，特異性不高，很少使用[4]。金葡菌的富集培養(yǎng)，要使金葡菌數(shù)量達到一定可檢測水平，才能進行金葡菌的分離，形態(tài)學觀察、理化鑒定，但結(jié)果只能定性不能定量。其他檢測金葡菌腸毒素的手段有免疫雙擴法、反向間接血凝法 、固相放射免疫技術(shù)及酶聯(lián)免疫吸附等。目前分子生物學檢測技術(shù)高速發(fā)展，如核酸探針、聚合酶鏈式反應、基因芯片技術(shù)也廣泛開展。聚合酶鏈反應(PCR)敏感性、特異性高，用于檢測金葡菌腸毒素的產(chǎn)毒基因[5]。

參考文獻：

[1]陳蕾,賈偉平,陸俊莤,等.上海市金黃色葡萄球菌流行調(diào)查[J].中華感染病雜志,2013,31(12):909-912.

[2]張文治.新編食品微生物學[M].北京:中國輕工出版社,2014.

[3]中華人民共和國衛(wèi)生部，中國國家標準化管理委員會.GB/T4789-2003.中國標準書號[S].北京：中國標準出版社，2004.

[4]張蓓,沈立松.實時熒光定量PCR的研究進展及其應用[J].國外醫(yī)學臨床生物化學與檢驗冊,2012,24(6):327-328.

[5]雷祚榮.葡萄球菌和葡萄球菌毒素病[M].北京:中國科學技術(shù)出版社,2012.

[責任編校：張亞光]

[中圖分類號]R 155.3

[文獻標識碼]B

[文章編號]1008-9276(2015)06-0753-02

作者簡介：王書冉 (1971-)，女，河南省新鄭市人，本科，主管檢驗師，從事衛(wèi)生檢驗與微生物檢驗工作。

收稿日期：2015-03-18