姜 燕， 王印庚， 麥康森， 張 正， 廖梅杰， 榮小軍， 李 彬， 王新安

(1.中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室，山東 青島266003；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島266071)

?

利用釀酒酵母發(fā)酵刺參飼料的條件優(yōu)化研究*

姜 燕1, 2， 王印庚2， 麥康森1， 張 正2， 廖梅杰2， 榮小軍2， 李 彬2， 王新安2

(1.中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室，山東 青島266003；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島266071)

以釀酒酵母為發(fā)酵菌種，開展了刺參飼料發(fā)酵條件優(yōu)化的研究。測定不同含水量、溫度和發(fā)酵時間條件下發(fā)酵飼料的感官性狀評價和理化指標。結(jié)果表明，以10%(V/W)的接種量接入釀酒酵母種子液、發(fā)酵溫度25℃、含水量70%發(fā)酵時間為3d的實驗組效果最好：發(fā)酵飼料的干物質(zhì)回收率(Dry matter recovery, DMR)、粗蛋白含量(Crude protein, CP)、氨基酸態(tài)氮占總氮的含量(Percentage of amino acid nitrogen to total nitrogen, AA-N/tN)分別達到最高值，氨態(tài)氮占總氮的含量(Percentage of ammonia nitrogen to total nitrogen, NH3-N/tN)相對較低；飼料的氣味、顏色和黏度等綜合感觀性狀達到最佳。研究表明，釀酒酵母可以作為發(fā)酵刺參飼料的備選菌種，其最適發(fā)酵條件：環(huán)境溫度25℃、基礎(chǔ)飼料含水量70%、發(fā)酵時間3d。研究結(jié)果將為新型海參飼料的制備和應(yīng)用提供途徑。

釀酒酵母； 刺參； 飼料； 發(fā)酵； 工藝參數(shù)； 粗蛋白含量； 氨基酸

刺參(Apostichopusjaponicus)是我國海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)產(chǎn)值最高的單一養(yǎng)殖品種，增養(yǎng)殖面積已超過15萬公頃，年產(chǎn)量近14萬噸，產(chǎn)值逾300億元，經(jīng)濟效益顯著[1]。在刺參養(yǎng)殖業(yè)蓬勃發(fā)展的同時，對飼料的需求也在不斷增加。傳統(tǒng)刺參飼料的主要成份是鼠尾藻、馬尾藻等大型藻類，所占比例高達60%～80%[2-4]。目前藻類資源量急劇下降[5]，若在養(yǎng)殖中仍然大量使用，有可能造成養(yǎng)殖成本不斷上升。因此，尋找一種新型的刺參飼料替代天然藻類，一方面可以保護海藻資源，另一方面也可有效控制刺參養(yǎng)殖成本，保障產(chǎn)業(yè)的平穩(wěn)、健康發(fā)展。

發(fā)酵飼料是將傳統(tǒng)飼料添加微生物菌種后進行發(fā)酵處理，不僅能夠有效降解飼料中大分子物質(zhì)，去除抗營養(yǎng)因子，并且能夠產(chǎn)生一些消化酶、有機酸、維生素等活性物質(zhì)，提高飼料的營養(yǎng)價值。而且還可以將動物機體難以消化吸收的粗蛋白等降解成易被消化吸收的氨基酸、小分子肽等營養(yǎng)物質(zhì)，改善飼料的適口性，提高養(yǎng)殖動物的攝食量[6-10]。作為一種新型飼料，發(fā)酵飼料已被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)。已有研究表明，投喂發(fā)酵飼料可以顯著提高牛、豬等畜牧動物的生長率和抗病力[11-14]，獲得較好的養(yǎng)殖效益。在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面，通過在飼料中添加一定比例的發(fā)酵豆粕，能夠促進異育銀鯽[15]和石斑魚[16-17]的生長。張建等[18]利用光合菌對啤酒糟進行發(fā)酵處理加工成優(yōu)質(zhì)魚飼料，顯著提高了飼料的蛋白含量。而基礎(chǔ)飼料經(jīng)發(fā)酵處理后投喂刺參，生長速度也明顯優(yōu)于投喂未發(fā)酵飼料組[19]。因此，發(fā)酵飼料在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有廣闊的應(yīng)用前景。

通過實際考察發(fā)現(xiàn)，目前大多數(shù)刺參養(yǎng)殖廠在保苗期間投喂的飼料是按一定比例配成的基礎(chǔ)飼料經(jīng)過1d的“發(fā)酵”進行投喂，因時間短其發(fā)酵效果有待探索。為此，本實驗在前期預(yù)實驗的基礎(chǔ)上進行5d的發(fā)酵追蹤測定以確定發(fā)酵效果。在本文研究中，選用釀酒酵母(Saccharomgcescerevisae)作為發(fā)酵菌種對刺參基礎(chǔ)飼料進行發(fā)酵實驗。釀酒酵母屬于真菌類，雖然不是海洋生物腸道的固有微生物，但研究表明，可通過飼料添加的途徑投喂魚、蝦、參等養(yǎng)殖動物。釀酒酵母能夠降解大分子的蛋白并產(chǎn)生多種消化酶類促進食物消化，從而為機體提供氨基酸和維生素等多種營養(yǎng)物質(zhì)，在一定程度上能夠防止消化道疾病的發(fā)生和促進養(yǎng)殖動物生長[20-22]。根據(jù)發(fā)酵的常規(guī)條件，本文開展了溫度、含水量和時間對飼料發(fā)酵影響的研究。實驗表明，通過發(fā)酵處理的刺參基礎(chǔ)飼料的粗蛋白含量和氨基酸態(tài)氮占總氮含量都有所提高，所獲得的發(fā)酵條件參數(shù)將為刺參飼料發(fā)酵工藝提供生產(chǎn)性指導(dǎo)和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用釀酒酵母(S.cerevisae)購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，編號為CICC1251；經(jīng)梯度耐鹽誘變獲得適鹽性較好的菌株進行實驗。將飼料原料粉碎后100目過篩，按表1中的配方配制發(fā)酵的基礎(chǔ)飼料。

實驗室條件下培養(yǎng)釀酒酵母的培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基，YPD液體培養(yǎng)基主要成分：酵母粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，氯化鈉2%。

表1 發(fā)酵基礎(chǔ)飼料的配方(以干物質(zhì)計)Table 1 Formulation of basal feed in fermentation on a dry matter basis

注：a： 由青島市瑞滋海珍品發(fā)展有限公司提供。Note:a：Qingdao Ruizi Rare Marine Animal Culture & Development Co. Ltd., Qingdao, Shandong Province, China

1.2 實驗方法

1.2.1 種子液培養(yǎng) 將保存于斜面培養(yǎng)基的釀酒酵母接種于YPD液體培養(yǎng)基中，置于37℃、120r/min恒溫水浴搖床振蕩培養(yǎng)10h作為發(fā)酵種子液，備用。

1.2.2 飼料發(fā)酵實驗 將飼料原料按上述比例混勻，用滅菌海水和發(fā)酵種子液共同配制成含水量為50%、60%、70%和80%(W/V)的發(fā)酵原料(均以干物質(zhì)計)，置于1L的塑料燒杯中，用雙層紗布夾脫脂棉封口。在溫度為20、25、30和35 ℃條件下，按照10%(v/w)的比例接種釀酒酵母種子液分別進行發(fā)酵。實驗共設(shè)16組，每組3個平行，在第1天、第2天、第3天、第4天和第5天分別對各平行組飼料進行取樣，檢測各項指標(見1.3)。發(fā)酵在恒溫水浴搖床中進行，轉(zhuǎn)速保持在130r/min。同時，在25℃、70%含水量條件下(通過預(yù)實驗得出25℃、70%含水量條件下發(fā)酵效果比較好)以不添加發(fā)酵菌種的處理組作為空白對照實驗。

1.3 檢測指標與方法

理化指標評定共檢測氨態(tài)氮(NH3-N)、氨基酸(AA)、粗蛋白(CP)、干物質(zhì)回收率(DMR)4項指標。其中NH3-N用次溴酸鹽氧化法測定[23]；AA用南京建成生物工程研究所的總氨基酸測定試劑盒法測定；CP含量用凱氏定氮法測定；DMR根據(jù)飼料發(fā)酵前后的重量和干物質(zhì)含量計算[24]。

感官性狀評定：由10名研究人員組成的小組分別從氣味、顏色、黏度3個方面對發(fā)酵飼料的感官物理性狀進行相應(yīng)的評分(評分標準為1.00～5.00分)，氣味、顏色、黏度3個方面分值的平均值即為發(fā)酵飼料感官性狀的分值，再通過數(shù)據(jù)處理進行分析[25-27]。其中，最佳的顏色指標為灰棕色，最佳氣味性狀為酸香味，最佳黏度指標為飼料顆粒較軟用兩手指輕輕一捏就松散[28]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用spss16.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析(ANOVA)，當不同處理之間存在顯著差異(P<0.05)時，采用Tukey檢驗進行多重比較。當因素間存在交互作用時，固定一個因素對另一個因素進行Tukey多重比較[29]。所有數(shù)值均采用平均值±標準差(Means±S.D.)表示。

2 結(jié)果

2.1 溫度、含水量和時間對發(fā)酵影響的方差分析

溫度、含水量、時間對發(fā)酵飼料DMR、CP、氨態(tài)氮占總氮含量(NH3-N/tN)、氨基酸態(tài)氮占總氮的含量(AA-N/tN)的方差分析結(jié)果見表2。從表中可以看出溫度、含水量、時間分別顯著影響發(fā)酵中DMR、CP、NH3-N/tN、AA-N/tN四項指標(P<0.05)，并且兩兩之間的交互作用對飼料發(fā)酵過程中各項指標的影響也是顯著的(P<0.05)，并且F檢驗均為極顯著(F>1)。

2.2 溫度、含水量、時間對飼料發(fā)酵的影響

2.2.1 飼料發(fā)酵第1天的變化特征 溫度和含水量對飼料發(fā)酵第1天的各理化指標的影響如表3所示。從表3中可以看出隨著含水量的增加，飼料的DMR顯著升高(P<0.05)；含水量為70%、80%實驗組的DMR差異不顯著(P>0.05)。在20℃、60%含水量時DMR達到該天最高值97.66%，但與20℃條件下70%和80%含水量、25℃條件下70%含水量、30℃條件下70%和80%含水量、35℃條件下80%含水量的DMR差異不顯著(P>0.05)。

飼料發(fā)酵第1天CP變化：20℃時CP隨含水量增加顯著升高(P<0.05)，而25、30和35℃水平下CP隨含水量的增加顯著下降(P<0.05)。CP最高值23.79%出現(xiàn)在20℃、含水量80%的實驗組，與20℃條件下60%和70%含水量、30℃條件下60%含水量、35℃條件下50%和60%含水量實驗組的CP差異不顯著(P>0.05)。

表2 不同發(fā)酵條件對DMR、CP、NH3-N/tN、AA-N/tN影響的方差分析Table 2 The variance analysis of the effects on DMR、CP、NH3-N/tN、AA-N/tN by the different fermentation conditions

注：P>0.05為不顯著，P<0.05為顯著。Note: Statistical significance was chosen atP<0.05.

①Indexes；②Temperature；③Water content；④Time；⑤Temperature × Water content；⑥Temperature×Time；⑦Water content× Time；⑧Temperature×Time×Water content；⑨Dry matter recovery；⑩Crude protein；Percentage of ammonia nitrogen to total nitrogen；Percentage of amino acid nitrogen to total nitrogen.

表3 發(fā)酵第1天溫度和含水量對飼料理化指標的影響Table 3 The effects on physicochemical indicators of fermentation feed on the first day by the temperature and water content

注：在同一列中標注不同字母表示差異顯著 (P<0.5)(n=3)。Note: Values denoted with different letter are significantly different in the same column(P<0.5)(n=3).

①Temperature；②Water content；③Dry matter recovery；④Crude protein；⑤Percentage of amino acid nitrogen to total nitrogen；⑥Percentage of ammonia nitrogen to total nitrogen；⑦Pooled SE.

除30℃外，其余溫度水平下 AA-N/tN隨含水量的增加總體呈現(xiàn)出下降的趨勢。含水量60%實驗組在30℃時達到該天最大值26.80%，顯著高于其余組(P<0.05)。

每一個溫度水平下NH3-N/tN隨含水量的增加均顯著降低(P<0.05)。30℃、80%含水量時最低(0.06%)，與30℃水平下70%含水量、20℃水平下70%和80%含水量、35℃水平下70%和80%含水量實驗組的差異不顯著(P>0.05)。

2.2.2 飼料發(fā)酵第2天的變化特征 飼料發(fā)酵第2天的各理化指標的變化如表4所示。飼料發(fā)酵第2天各實驗組DMR在20和30℃時隨含水量的增加先升高后下降，25℃時隨含水量增加顯著升高，35℃時趨于平穩(wěn)。在30℃條件下70%含水量組的DMR達到該天最高值98.02%，與20℃條件下70%含水量組差異不顯著(P>0.05)。

表4 發(fā)酵第2天溫度和含水量對飼料理化指標的影響Table 4 The effects on physicochemical indicators of fermentation feed on the second day by the temperature and water content

注：在同一列中不同的字母標注表示差異顯著 (P<0.5)(n=3)。Note: Values denoted with different letter are significantly different in the same column(P<0.5)(n=3).

①Temperature；②Water content；③Dry matter recovery；④Crude protein；⑤Percentage of amino acid nitrogen to total nitrogen；⑥Percentage of ammonia nitrogen to total nitrogen；⑦Pooled SE

在20和25℃時各實驗組CP隨含水量的增加總體呈現(xiàn)下降趨勢，30℃時先升高后下降，而35℃時則先下降后升高。在20℃條件下50%、60%含水量實驗組的CP值達到最高值23.68%，與35℃條件下50%和80%含水量實驗組的差異不顯著(P>0.05)。

在20℃的條件下，發(fā)酵飼料第2天的AA-N/tN隨含水量增加呈下降-升高-下降的變化，其余3個溫度組都呈現(xiàn)了先下降后升高的趨勢。其中25℃條件下含水量50%的實驗組AA-N/tN為45.31%，為飼料發(fā)酵第2天的AA-N/tN最高值，與其余組的差異均顯著(P<0.05)。

各實驗組發(fā)酵飼料第2天的NH3-N/tN隨含水量增加都呈顯著下降趨勢。在20℃條件下含水量80%的實驗組NH3-N/tN達最低值0.08%，與20℃條件下70%含水量、30℃條件下80%含水量的實驗組差異不顯著(P>0.05)。

2.2.3 飼料發(fā)酵第3天的變化特征 飼料發(fā)酵第3天的各理化指標變化見表5。除30℃條件下DMR隨含水量的增加而下降外，其余溫度組都是先升高后下降。在25℃條件下70%含水量組的DMR達最高值98.34%，與其余組的差異均顯著(P<0.05)。

表5 發(fā)酵第3天溫度和含水量對飼料理化指標的影響Table 5 The effects on physicochemical indicators of fermentation feed on the third day by the temperature and water content

注：在同一列中不同的字母標注表示差異顯著 (P<0.5)(n=3)。Note: Values denoted with different letter are significantly different in the same column(P<0.5)(n=3).

①Temperature；②Water content；③Dry matter recovery；④Crude protein；⑤Percentage of amino acid nitrogen to total nitrogen；⑥Percentage of ammonia nitrogen to total nitrogen；⑦Pooled SE

在20℃時，CP隨含水量的增加呈下降趨勢，而35℃時與之相反；在25℃的條件下，各實驗組的CP呈現(xiàn)出下降-升高-下降的趨勢，而30℃條件下的各實驗組出現(xiàn)與之相反的變化趨勢。在25℃條件下70%含水量組的CP達到最高值24.81%，與其余發(fā)酵組的差異均顯著(P<0.05)。

各實驗組AA-N/tN的含量，在20和25℃時隨含水量的增加呈下降-上升-下降趨勢，在30℃時呈逐漸上升的趨勢，在35℃時則呈先下降后上升的趨勢。在25℃條件下70%含水量組的AA-N/tN達最高值46.39%，與其余發(fā)酵組的差異均顯著(P<0.05)。

各實驗組的NH3-N/tN在不同溫度條件下均隨含水量的增加而顯著下降。在20℃條件下70%和80%含水量組的NH3-N/tN達到最低值0.10%，與20℃條件下70%含水量組的差異不顯著(P>0.05)，與其余發(fā)酵組的差異均顯著(P<0.05)。

2.2.4 飼料發(fā)酵第4天的變化特征 飼料發(fā)酵過程中各理化指標在第4天的變化見表6。從表中可以看出，在25℃條件下各實驗組DMR呈現(xiàn)下降-升高-下降的趨勢，而其余3個溫度條件下的飼料組都隨著含水量的增加先升高后下降。在25℃條件下70%含水量組的DMR達到該天最高值98.32%，與其余飼料組的差異均顯著(P<0.05)。

表6 發(fā)酵第4天溫度和含水量對飼料理化指標的影響Table 6 The effects on physicochemical indicators of fermentation feed on the forth day by the temperature and water content

注：在同一列中不同的字母標注表示差異顯著 (P<0.5)(n=3)。Note: Values denoted with different letter are significantly different in the same column(P<0.5)(n=3).

①Temperature；②Water content；③Dry matter recovery；④Crude protein；⑤Percentage of amino acid nitrogen to total nitrogen；⑥Percentage of ammonia nitrogen to total nitrogen；⑦Pooled SE

各實驗組的CP在20和30℃條件下隨含水量的增加先升高后下降，在25℃條件下則先下降后升高，在35℃條件下則呈現(xiàn)一直上升的趨勢。在20℃條件下60%含水量組的CP值最高為24.03%，與20℃條件下50%含水量、35℃條件下70%和80%含水量組的差異不顯著(P>0.05)。

各實驗組的AA-N/tN在20℃條件下隨含水量的增加先升高后下降，與30℃條件下的變化相反；在25和35℃條件下則呈現(xiàn)了下降-升高-下降的趨勢。在25℃條件下70%含水量組的AA-N/tN達到最高值43.93%，與其余飼料組的差異均顯著(P<0.05)。

各實驗組的NH3-N/tN在不同溫度條件下都隨含水量的增加而顯著下降。其中，在20℃條件下70%含水量組的NH3-N/tN含量最低為0.11%，與20℃條件下80%含水量的實驗組差異不顯著(P>0.05)。

2.2.5 飼料發(fā)酵第5天的變化特征 飼料發(fā)酵第5天的理化指標變化見表7。各實驗組的DMR在20和30℃條件下時隨含水量的增加總體呈逐漸下降趨勢，在25℃條件下呈下降-上升-下降趨勢，在35℃條件下則先升高后下降。在25℃條件下70%含水量組DMR出現(xiàn)該天最高值97.81%，與25℃條件下50%含水量、35℃條件下60%和70%含水量組差異不顯著(P>0.05)。

表7 發(fā)酵第5天溫度和含水量對飼料理化指標的影響Table 7 The effects on physicochemical indicators of fermentation feed on the fifth day by the temperature and water content

注：在同一列中不同的字母標注表示差異顯著 (P<0.5)(n=3)。Note: Values denoted with different letter are significantly different in the same column(P<0.5)(n=3).

①Temperature；②Water content；③Dry matter recovery；④Crude protein；⑤Percentage of amino acid nitrogen to total nitrogen；⑥Percentage of ammonia nitrogen to total nitrogen；⑦Pooled SE

各實驗組CP含量在20和25℃條件下隨含水量的增加而下降，但在30和35℃條件下則總體上呈上升趨勢。在20℃條件下50%含水量組的CP達最高值23.78%，與20℃條件下60%含水量的實驗組差異不顯著(P>0.05)。

各實驗組AA-N/tN在20和25℃條件下隨含水量的增加先升高后下降，在30和35℃條件下呈現(xiàn)了下降-升高-下降的趨勢。在25℃條件下70%含水量組的AA-N/tN達到最高值43.65%，與其余飼料組的差異均顯著(P<0.05)。

各實驗組的NH3-N/tN在不同溫度條件下均隨含水量的增加逐漸下降。在20℃條件下80%含水量組達最低值0.14%，與20℃條件下含水量70%實驗組的差異不顯著(P>0.05)。

2.2.6 空白對照實驗 在不添加發(fā)酵菌情況下，飼料在25℃、70%含水量條件下的空白對照實驗結(jié)果如圖1所示。加發(fā)酵菌與空白對照組的DMR在每一天的差異都很顯著(P<0.05)，CP、NH3-N/tN除第5天差異不顯著(P>0.05)外其余4天差異都很顯著(P<0.05)，而AA-N/tN在第1天差異不顯著(P>0.05)。

綜合分析飼料發(fā)酵過程中各理化指標5d的變化情況，可以看出含水量70%的實驗組在25℃條件下發(fā)酵第3天的DMR、CP、AA-N/tN均達到最高值，分別為98.34%、24.81%、46.39%，而此時的NH3-N/tN較低，為0.14%，在理想的范圍之內(nèi)。

圖1 加發(fā)酵菌與不加發(fā)酵菌對飼料發(fā)酵的影響(n=3)Fig.1 The effects on the fermentation process by adding fermentation strain (n=3)

2.3 發(fā)酵飼料的感官評定

溫度、含水量、時間對飼料發(fā)酵過程中的感官影響見表8。從表8中可以看出不同發(fā)酵條件下的飼料綜合感官分值每天都有所不同，在發(fā)酵的第1天和第5天分值比較低，第3天普遍較高；當含水量為80%時，不同發(fā)酵溫度和時間條件下的綜合感官評分都比較低；當溫度較低時(20℃)發(fā)酵進行的比較慢且程度較低，溫度較高時(35℃)發(fā)酵進程過快且最佳感官性狀不是很理想。在25℃、70%含水量條件下，飼料發(fā)酵到第3天時所得的分值最高。在相同溫度和含水量組，與第4天的綜合感官性狀分值差異不顯著(P>0.05)；在相同時間和含水量組，與其余溫度的感官分值差異顯著(P<0.05)；在相同時間和溫度組，與60%含水量的差異不顯著(P>0.05)。

3 討論分析

釀酒酵母生長代謝過程中會產(chǎn)生CO2，使飼料在發(fā)酵過程中會有一定的損失，導(dǎo)致飼料的回收率下降[30]。實驗過程中，釀酒酵母發(fā)酵的含水量70%的基礎(chǔ)飼料在25℃條件下發(fā)酵到第3天時DMR達到了最高值98.34%，與第1天相比提高了0.68%，可能是含水量比較適宜，溫度不是太高，有利于飼料中氧氣的流通，能夠滿足發(fā)酵微生物生長繁殖的需要；隨著發(fā)酵的進行發(fā)酵微生物的生長代謝逐漸達到頂峰，有效產(chǎn)物積累達到最大值，但是發(fā)酵天數(shù)的增加飼料中的有害微生物逐漸增加，其生長繁殖不利于發(fā)酵產(chǎn)物的積累。

表8 發(fā)酵飼料的感官評價 (平均值±標準差,n=10)Table 8 Sensory evaluation of fermentation feed by Saccharomyces cerevisiae (means±S.D., n=10)

注：同一行內(nèi)標有不同上標的表示差異顯著(P<0.05)。Note: Values with different letters are significantly different in the same line(P<0.05).

CP是飼料營養(yǎng)成分的重要評判指標之一，其含量多少一般是根據(jù)養(yǎng)殖動物營養(yǎng)需求確定。在本次實驗過程中，含水量70%的實驗組在25℃條件下，發(fā)酵第3天飼料中的CP含量從最初的21.70%提高到24.81%，而AA-N/tN含量也從24.16%上升到46.39%，均達到了整個發(fā)酵過程的最高值。隨著發(fā)酵的進行，微生物在降解蛋白產(chǎn)生氨基酸的同時也需要消耗一部分氨基酸來滿足自身生長繁殖的需求。因此，在發(fā)酵過程中CP和AA-N/tN出現(xiàn)上升和下降現(xiàn)象。發(fā)酵的溫度和飼料含水量不適宜，不利于發(fā)酵飼料內(nèi)部氧氣的流通，大部分酵母進行厭氧發(fā)酵，不利于本實驗中有效產(chǎn)物的積累。Yang等[31]通過發(fā)酵處理將玉米秸稈的CP含量提高119.40%，酵母細胞粗蛋白含量高達50%。因此，經(jīng)常將釀酒酵母、赤壁酵母等的酵母細胞加入到飼料中作為飼用蛋白[32]。發(fā)酵過程中，通過微生物的代謝作用，大分子的蛋白能夠得到有效降解生成小分子的肽和氨基酸[15，33-34]。另外，對豆粕進行發(fā)酵的實驗表明，通過不同的發(fā)酵處理，豆粕的CP含量都相應(yīng)的提高[35-39]，并且AA也有一定程度的提高。這些現(xiàn)象說明發(fā)酵過程中通過微生物的代謝作用，可以產(chǎn)生一定量的蛋白和氨基酸，同時還可以將大分子的蛋白轉(zhuǎn)化為小分子的氨基酸，有利于養(yǎng)殖動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收，提高飼料轉(zhuǎn)化效率。

NH3-N/tN是評定發(fā)酵飼料質(zhì)量的一項重要指標，直接影響著發(fā)酵飼料的飼用價值。實驗中隨著發(fā)酵的進行，氨基酸的分解速度逐漸占優(yōu)勢，分解產(chǎn)生的氨態(tài)氮含量也逐漸上升。因此，發(fā)酵溫度越高、含水量越低、時間越長反而不利于發(fā)酵效果；但是溫度太低、含水量太高、時間太短也不利于飼料的營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)換。當溫度為25℃、含水量為70%的條件下，發(fā)酵進行到第3天時的NH3-N/tN為0.14%，在理想的范圍之內(nèi)。Wilkins等[40]認為，青貯飼料干物質(zhì)采食量與NH3-N/tN成強負相關(guān)。因此，隨著NH3-N/tN的增加將會影響發(fā)酵飼料的營養(yǎng)價值。氨氮是水產(chǎn)養(yǎng)殖中重要的水質(zhì)指標之一，超出安全范圍將影響?zhàn)B殖動物的健康生長，因此飼料中的NH3-N/tN越低越好。

空白對照所選的實驗條件為25℃、70%含水量，是根據(jù)大多數(shù)刺參養(yǎng)殖廠保苗期間的車間平均溫度及前期預(yù)實驗的基礎(chǔ)上進行設(shè)計。通過對比可以看出，不加發(fā)酵菌的對照組DMR、CP、AA-N/tN都很低，但NH3-N/tN的含量較高；而加發(fā)酵菌的試驗組正好相反，發(fā)酵的效果比較好，并且在第3d DMR、CP、AA-N/tN都顯著高于空白對照組(P<0.05)，同時NH3-N/tN顯著低于空白對照組(P<0.05)。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因，可能是加入的發(fā)酵菌在飼料中生長繁殖比較好，在較短的時間就能占優(yōu)勢地位，有效地抑制有害菌群的生長繁殖，并使發(fā)酵產(chǎn)物得到有效的積累。隨著時間的延長反而不利于產(chǎn)物的積累，可能是飼料中的優(yōu)勢菌群逐漸改變，有害菌群生長繁殖旺盛，消耗部分發(fā)酵產(chǎn)物，從而導(dǎo)致DMR、CP、AA-N/tN含量后期又逐漸下降，而NH3N/tN則出現(xiàn)上升趨勢。毋庸置疑，飼料本身攜帶的微生物可進行一定的發(fā)酵作用，本實驗考慮到刺參養(yǎng)殖廠的一般條件未對發(fā)酵原料進行消毒處理。但是通過實驗可以看出添加發(fā)酵菌與不加發(fā)酵菌飼料的各理化指標變化趨勢差別較大。因此，起有效發(fā)酵作用的還是添加的發(fā)酵菌，飼料本身攜帶的微生物起的發(fā)酵作用微乎其微。

本文所使用的飼料原料在發(fā)酵前有海藻腥味，隨著發(fā)酵的進行各實驗組均逐漸出現(xiàn)酸香味，這與贠建民等[41]的實驗結(jié)果相同，證明通過發(fā)酵可以改善海參飼料的風味。發(fā)酵前，飼料原料主要是土黃色或淺土黃色，發(fā)酵過程中逐漸出現(xiàn)灰棕色或偏黑的顏色，在外觀性狀上趨向較暗的顏色。隨著發(fā)酵過程的進行，飼料的黏度也發(fā)生了非常明顯的變化，這可能是飼料中的微生物通過自身的代謝作用使飼料的一些物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而引起的，由此改變飼料的黏度。實驗中，在25℃、70%含水量條件下發(fā)酵到第3天時包括顏色、氣味、黏度等的感官分值最高，此時的綜合感官性狀最佳。時建青[42]認為飼料發(fā)酵后出現(xiàn)的變質(zhì)現(xiàn)象可能是梭菌等有害菌群發(fā)酵占優(yōu)勢造成的。

4 結(jié)論

(1)通過釀酒酵母的發(fā)酵實驗，刺參飼料的各種理化指標發(fā)生了明顯變化，因此釀酒酵母可以作為生產(chǎn)刺參發(fā)酵飼料的備選菌種。

(2)當發(fā)酵溫度為25℃、基礎(chǔ)原料含水量為70%、發(fā)酵時間為3天時，用釀酒酵母發(fā)酵刺參配合飼料的效果較理想，感官指標方面出現(xiàn)了酸香味、黏度增大、顏色變?yōu)榛易厣?，接近刺參天然餌料的外觀性狀。飼料各理化指標如下：DMR達98.34%、CP為24.81%、AA-N/tN高達46.39%、NH3-N/tN較低0.14%。

[1] 農(nóng)業(yè)部漁業(yè)局. 中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒2012[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2012： 29-56.

[2] Lin Y, Dong S L, Tian X L, et al. The effect of different macroalgae on the growth of sea cucumbers (ApostichopusjaponicusSelenka) [J]. Aquaculture Research, 2010, 41, e881-e885.

[3] 郭娜, 董雙林, 劉慧. 幾種飼料原料對刺參幼參生長和體成分的影響 [J]. 漁業(yè)科學(xué)進展, 2011, 32(1): 122-128.

[4] 王吉橋, 隋曉楠, 顧公明, 等. 不同飼料搭配及投喂量對仿刺參稚、幼參生長和成活的影響 [J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2008, 27(2): 55-58.

[5] Sun J Z, Ning X R, Le F F, et al. Long term changes of biodirersity of benthic macroalgae in the intertidal zone of the Nanji islands[J]. Ecologica Sinica, 2010, 30(2): 106-112.

[6] 楊永明, 盧德勛, 盧媛. 微生物發(fā)酵秸稈飼料的研究現(xiàn)狀及展望 [J]. 飼料工業(yè), 2002, 23(2): 14-18.

[7] Carlson D, Poulsen H D. Phytate degradation in soaked and fermented liquid feed-effect of diet, time of soaking, heat treatment, phytase activity, pH and temperature [J]. Animal Feed Science and Technology, 2003, 103: 141-154.

[8] 李維炯, 倪永珍, 黃宏坤, 等. 微生態(tài)制劑在生態(tài)畜牧業(yè)中應(yīng)用效果 [J]. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2003, 8(增刊): 85-92.

[9] 殷文靜, 張成林, 張書祥. 產(chǎn)彈性蛋白酶菌種的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化研究 [J]. 生物學(xué)雜志, 2007, 24(6): 49-52.

[10] 馬文強, 馮杰, 劉欣. 微生物發(fā)酵豆粕和營養(yǎng)特性研究 [J]. 中國糧油學(xué)報, 2008, 23(1): 121-124.

[11] Kobashi Y, Ohmori H, Tajima K, et al. Reduction of chlortetracycline-resistant Escherichia coli in weaned piglets fed fermented liquid feed [J]. Anaerobe, 2008, 14(4): 201-204.

[12] 王樹杰, 王學(xué)進, 稽道仿. 微生物發(fā)酵飼料飼喂泌乳牛增奶實驗 [J]. 新疆畜牧業(yè), 2009, 1: 27-29.

[13] 夏芳, 崔茂福, 鄧躍林. 發(fā)酵豆粕在斷奶仔豬飼料中的應(yīng)用研究 [J]. 廣東飼料, 2009, 18(7): 27-28.

[14] 郭春華, 魏榮祿, 陶文清, 等. 微生物發(fā)酵蛋白飼料在奶牛飼養(yǎng)中的應(yīng)用研究 [J]. 西南民族大學(xué)學(xué)報： 自然科學(xué)版, 2009, 35(4): 759-763.

[15] 陳萱. 發(fā)酵豆粕工藝改進與發(fā)酵豆粕功能拓展的研究[D]. 武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2005.

[16] Luo Zhi, Liu Yongjian, Mai Kangsen. Partial replacement of fish meal by soybean protein in diets for grouperepinepheluscoioidesjuvenilus [J]. Journal of Fisheries of China, 2004, 28(2): 75-81.

[17] Demecková V, Kelly D, Coutts A G P, et al. The effect of fermented liquid feeding on the faecal microbiology and colostrum quality of farrowing sows [J]. International Food Microbiology, 2002, 79: 85-97.

[18] 張健, 馮學(xué)愚, 劉小彬, 等. 光合菌發(fā)酵啤酒糟制魚飼料工藝優(yōu)化 [J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報, 2011, 27(8): 387-392.

[19] 姜燕, 王印庚, 薛太山, 等. 刺身池塘養(yǎng)殖系統(tǒng)中發(fā)酵飼料的制作與投喂 [J]. 漁業(yè)科學(xué)進展, 2012, 33(1): 66-71.

[20] Andlid T, Juárez R-V, Gustafsson L. Yeast Colonizing the Intestine of Rainbow Trout (Salmogairdneri) and Turbot (Scophtalmusmaximus) [J]. Microb Ecol, 1995, 30: 321-334.

[21] 陳合, 余建軍, 舒國偉, 等. 多菌種分步降解玉米秸稈生產(chǎn)蛋白飼料的工藝 [J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報, 2009, 25(12): 331-334.

[22] 羅勇泉, 張泓, 許楊, 等. 豆腐渣混合蘋果渣固態(tài)發(fā)酵改善膳食纖維適口性 [J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報, 2011, 27 (增刊1): 407-412.

[23] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局, 中國國家標準化管理委員會. 海洋監(jiān)測規(guī)范第4部分： 海水分析, GB 17378. 4-2007[S]. 北京： 中國標準出版社, 2007.

[24] 莊益芬, 張文昌, 陳鑫珠, 等. 綠汁發(fā)酵液及纖維素酶對菌糠發(fā)酵飼料品質(zhì)的影響 [J]. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報： 自然科學(xué)版, 2006, 21(6): 653-655.

[25] ?ner M D, Tekin A R, Erdem T. The use of soybean in the traditional fermented food-Tarhana [J]. Food Sci Technol: Lebensm Wiss Technol, 1993, 26(4): 371-372.

[26] Tamang J P Nikkuni S. Selection of starter cultures for the production ofkinemaa fermented soybean food of the Himalaya [J]. World J Microbiol Biotechnol, 1996, 12: 629-635.

[27] Omafuvbe B O, Abiose S H, Shonukan O O. Fermentation of soybean (Glycinemax) for soy- daddawa production by starter cultures ofBacillus[J]. Food Microbiol, 2002, 19: 561-566.

[28] Ikenebomeh M J. The influence of salt and temperature on the natural fermentation of African locust bean [J]. International Journal of Food Microbiology, 1989, 8: 133-139.

[29] Zar J H. Biostatistical Analysis [M]. London, U. K.: Prentice-Hall International Editions, 1999: 270-274.

[30] 蔡國林, 鄭兵兵, 王剛, 等. 微生物發(fā)酵提高花生粕營養(yǎng)價值的初步研究 [J]. 中國油脂, 2010, 35(5): 31-34.

[31] Yang X X, Chen H Z, Gao H L, et al. Bioconversion of corn straw by coupling counseling and solid- state fermentation [J]. Bioresour Technol, 2001, 78(3): 277-283.

[32] 王鵬銀, 王海燕, 段文娟, 等. 釀酒酵母源飼料添加劑的研究與應(yīng)用 [J]. 飼料工業(yè), 2011, 32(2): 30-35.

[33] 周付忠, 謝寶恩, 賈蘊麗, 等. 幾株益生菌發(fā)酵豆粕及其產(chǎn)物分析 [J]. 飼料工業(yè), 2007, 28(6): 35-37.

[34] 賈曉峰, 李愛科, 姚軍虎, 等. 固態(tài)發(fā)酵對棉籽粕棉酚脫毒及蛋白降解的影響 [J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版, 2009, 37(3): 49-54.

[35] Hirabayashi M, Matsui T, Yano H, et al. Fermented of soybean meal withAspergillususamiireduces phosphorus excretion in chieks [J]. Poultry Science, 1998, 77: 552-556.

[36] Zamora R G, Veum T L. Nutritive value of whole soybeans fermented withAspergillusoryzaeorRhizopusoligosporusas evaluated by neonatal pigs [J]. The Journal of Nutrition, 1988, 118: 438-444.

[37] 姚曉紅, 吳逸飛, 湯江武, 等. 微生物混合發(fā)酵去除生豆粕中胰蛋白酶抑制劑的研究 [J]. 飼料工業(yè), 2005, 26(15)： 14-16.

[38] 莫重文, 黃崗. 固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)酵豆粕的研究 [J]. 中國油脂, 2007, 32(7): 37-40.

[39] 楊旭, 蔡國林, 曹鈺, 等. 固態(tài)發(fā)酵提高豆粕蛋白含量的條件優(yōu)化研究 [J]. 中國釀造, 2008, 182(5): 17-21.

[40] Wilkins R J, Hutchinson K J, Wilson R F, et al. The voluntary intake of silage by sheepⅠ. Interrelation ships between silage composition and intake [J]. J Agric Sci Camb, 1971, 77: 531-537.

[41] 贠建民, 劉隴生, 安志剛, 等. 馬鈴薯淀粉渣生料多菌種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料工藝 [J] . 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報, 2010, 26(增刊2): 399-404.

[42] 時建青. 苜蓿、統(tǒng)糠和稻草分別與啤酒糟混合發(fā)酵飼料品質(zhì)研究 [D]. 新疆： 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006.

責任編輯 朱寶象

The Optimization of Fermentation Condition of Sea Cucumber (Apostichopus japonicus) Feed by Saccharomyces cerevisiae

JIANG Yan1, 2, WANG Yin-Geng2, MAI Kang-Sen1, ZHANG Zheng2, LIAO Mei-Jie2, RONG Xiao-Jun2, LI Bin2, WANG Xin-An2

(1. The Key Laboratory of Maricultur, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China)

The fermentation condition of sea cucumber (Apostichopusjaponicus) feed bySaccharomycescerevisiaewas optimized in this study. The effects of water content of dry feedstuff (50%, 60%, 70% and 80%), temperature (20, 25, 30 and 35℃) and time (1, 2, 3, 4 and 5d) on fermentation were determined. The fermentation treatments were inoculated with 10% (V/W) ofS.cerevisiaeseed solution. The evaluation indexes of fermentation included sensorial characteristics and physicochemical indexes of feed in the fermentation process. The results showed that the physicochemical indexes including dry matter recovery (DMR), crude protein (CP) and the percentage of amino acid nitrogen to total nitrogen (AA-N/tN) reached the highest, and the percentage of ammonia nitrogen to total nitrogen (NH3-N/tN) maintained within a low level on day 3 in 25℃,70% water content group; at the same time, the sensorial characteristics including smell, color and viscosity achieved the best in this group. These findings indicated thatS.cerevisiaecan be used as one of candidate strains for sea cucumber feed fermentation, and the optimum technological parameters (water content, fermentation temperature and fermentation time) were 70%, 25℃ and 3 days. The research may be helpful for the development and application of sea cucumber new type feed.

Saccharomycescerevisiae;Apostichopusjaponicus; feed; fermentation; technological parameter; crude protein content; amino acid

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃項目(2012AA10A412-4)；國家科技支撐計劃項目(2012BAD17B03)；國家自然科學(xué)基金項目(31202016)資助

2014-01-20,

2014-03-24

姜 燕(1985-)，女，博士生。E-mail: jiangyan851215@126.com

** 通訊作者：E-mail: wangyg@ysfri.ac.cn

S963.5

A

1672-5174(2015)05-028-11

10.16441/j.cnki.hdxb.20140025