許玉潔， 單洪偉， 馬 甡

(中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 26003)

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芽孢桿菌和溶藻弧菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦消化酶、免疫酶活力及抗病力的影響*

許玉潔， 單洪偉， 馬 甡**

(中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 26003)

選取初始體重(3.58±0.32)g的凡納濱對(duì)蝦，在飼料中分別添加溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)活菌、溶藻弧菌破碎菌、芽孢桿菌(Bacillussp.)活菌和芽孢桿菌破碎菌和使其菌含量為108CFU/g，通過49d的養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)研究飼料中添加芽孢桿菌和溶藻弧菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦的消化酶、免疫相關(guān)酶和抗病力的影響。結(jié)果顯示：(1)4個(gè)處理組對(duì)蝦的腸道蛋白酶水平均顯著提高。25d時(shí)各處理組淀粉酶水平均顯著高于對(duì)照組，49d時(shí)弧菌破碎組和桿菌破碎組對(duì)蝦的淀粉酶水平高于對(duì)照組(P<0.05)，其中桿菌破碎組對(duì)蝦腸道的消化酶水平最高，桿菌組對(duì)蝦腸道消化酶水平低于其他處理組。(2)49d時(shí)弧菌組對(duì)蝦的超氧化物歧化酶(SOD)水平上升(P<0.05)；弧菌破碎組對(duì)蝦的SOD、酚氧化酶(PO)和抗菌酶水平上升(P<0.05)；桿菌組對(duì)蝦PO水平上升，抗菌酶水平下降(P<0.05)；桿菌破碎組對(duì)蝦SOD和PO水平均上升，抗菌酶水平下降(P<0.05)。(3)WSSV攻毒的半致死時(shí)間為桿菌破碎組>弧菌破碎組>弧菌組>桿菌組>對(duì)照組。研究表明，飼料中添加芽孢桿菌和溶藻弧菌及其破碎菌體均能在一定程度上提高對(duì)蝦的消化酶活力和抗病力。其中添加弧菌破碎菌體能更好的提高對(duì)蝦的免疫酶水平，添加桿菌破碎菌體能促進(jìn)對(duì)蝦消化和抗病力。

凡納濱對(duì)蝦； 芽孢桿菌； 溶藻弧菌； 消化酶； 免疫

凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)原產(chǎn)于中、南太平洋海岸水域秘魯北部至墨西哥桑諾拉[1]。由于適應(yīng)力強(qiáng)、生長周期短、營養(yǎng)要求低、抗病力強(qiáng)、適鹽范圍廣等特點(diǎn)，使得凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖在我國得到了迅速的發(fā)展[2]。然而在對(duì)蝦養(yǎng)殖中，對(duì)蝦白斑綜合征(White spot syndrome，WSS)因其高傳播性、高致病性、高死亡率給對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失。目前尚無有效的疫苗能夠防治白斑綜合征，主要采用以防為主的策略，通過建立健康的養(yǎng)殖環(huán)境和提高對(duì)蝦的免疫力來達(dá)到防治的目的。

益生菌具有改善水質(zhì)、提高動(dòng)物產(chǎn)量和免疫力的作用，應(yīng)用在生產(chǎn)中能夠改善養(yǎng)殖水質(zhì)，減少漁藥、抗生素的使用，促進(jìn)健康養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[3]。芽孢桿菌(Bacillussp.)由于其耐高溫及干燥環(huán)境、便于儲(chǔ)藏和運(yùn)輸?shù)奶匦猿蔀橹匾娘暳衔⑸锾砑觿┖臀⑸鷳B(tài)制劑[4-5]。研究表明，芽孢桿菌能夠降解水體中氨氮、亞硝氮等有害物質(zhì)；定植于宿主腸道后，能夠分泌酶類和代謝產(chǎn)物、建立優(yōu)勢(shì)菌群，促進(jìn)宿主生長，提高宿主的免疫力[6-7]。實(shí)驗(yàn)表明在飼料中添加堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌能夠提高對(duì)蝦的免疫酶水平和抗病力[8]。

弧菌(Vibrio)是海水養(yǎng)殖環(huán)境中的常見菌種，其中包括很多致病菌如哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)、鰻弧菌(Vibrioanguillarum)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)等。溶藻弧菌(Vibrioalginohyticus)被認(rèn)為是一種條件致病菌，大量存在于海水中，在一定環(huán)境、宿主和環(huán)境菌群的共同作用下能夠?qū)λ拗鳟a(chǎn)生致病性[9]。然而已有部分溶藻弧菌作為益生菌應(yīng)用與水產(chǎn)養(yǎng)殖中。有研究表明，溶藻弧菌能夠提高養(yǎng)殖動(dòng)物的成活率和體重[10-11]。也有實(shí)驗(yàn)證明溶藻弧菌能夠吸收水體中的氨氮、亞硝氮，具有改善水質(zhì)的作用[12]。然而關(guān)于溶藻弧菌對(duì)對(duì)蝦生長、免疫方面的影響尚不甚清楚，需進(jìn)一步研究。

活細(xì)菌進(jìn)入腸道后能夠在腸道定植，通過調(diào)節(jié)腸道的菌群平衡，分泌胞外產(chǎn)物等途徑提高動(dòng)物的免疫水平[13]。有研究表明，細(xì)菌脂多糖和細(xì)菌肽聚糖對(duì)介導(dǎo)非特異性免疫起到重要作用[14-15]。采用新城疫病毒感染干乳酪桿菌(Lactobacilluscasei)和嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)及其破碎菌體處理的雞胚腸細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，活菌處理過的細(xì)胞干擾素IFN-γ水平較對(duì)照組顯著降低，破碎菌處理組的IFN-γ水平顯著高于對(duì)照組[16]。說明細(xì)菌活菌和破碎菌產(chǎn)生免疫調(diào)控的機(jī)制可能有所不同，菌體碎片或細(xì)胞內(nèi)的某些物質(zhì)可能會(huì)對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生免疫促進(jìn)的作用。本實(shí)驗(yàn)采用篩選自舟山的芽孢桿菌和溶藻弧菌，通過飼料添加活菌和破碎菌體，比較2株細(xì)菌及其破碎菌體對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長、消化酶活力、免疫相關(guān)酶活力和抗病力的影響。目的是比較2株細(xì)菌和不同添加方法對(duì)于免疫促進(jìn)的效果，定位免疫活性物質(zhì)的所在位置，為其在對(duì)蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

溶藻弧菌VZ5株和芽孢桿菌BZ5株均篩選自舟山對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘中，現(xiàn)保存于中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院。

1.2 實(shí)驗(yàn)飼料

對(duì)照組飼料采用正大公司生產(chǎn)的對(duì)蝦配合飼料，粗蛋白含量為42%，脂肪含量為7%。溶藻弧菌VZ5株和芽孢桿菌BZ5株活化后接種于LB液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24h。培養(yǎng)液于3000r/min離心10min收集濃縮菌液。菌液分別置于超聲波破碎儀中破碎20min(39%，3s，3s)制成破碎菌液。將活菌液和破碎菌液添加于對(duì)蝦配合飼料中，制成含菌量108CFU/g的飼料，室溫晾干后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 對(duì)蝦

凡納濱對(duì)蝦來自青島市寶榮水產(chǎn)科技發(fā)展有限公司，體質(zhì)量為(3.58±0.32)g，體色正常，健康活潑。實(shí)驗(yàn)前先暫養(yǎng)7d，每日換水1次，投餌3次。

1.4 養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)設(shè)5個(gè)處理組，弧菌組：投喂添加溶藻弧菌VZ5株活菌的配合飼料；弧菌破碎組：投喂添加破碎溶藻弧菌的配合飼料；桿菌組：投喂添加芽孢桿菌BZ5株活菌的配合飼料；桿菌破碎組：投喂添加破碎芽孢桿菌的配合飼料；對(duì)照組：只投喂配合飼料。每組各設(shè)6個(gè)平行，每個(gè)平行20尾對(duì)蝦。實(shí)驗(yàn)期間，每日投餌3次，每日吸污、換水，實(shí)驗(yàn)持續(xù)49d。

1.5 攻毒實(shí)驗(yàn)

攻毒采用從患病死蝦中粗提的白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)，從對(duì)蝦第4、5腹節(jié)注射(50μL/尾)。每隔6h觀察對(duì)蝦的死亡情況，統(tǒng)計(jì)累計(jì)死亡率(Cumulative mortality rate，CMR)，計(jì)算免疫保護(hù)率(Relative Percent Survival, RPS)，計(jì)算公式如下：

CMR=已死亡對(duì)蝦數(shù)/對(duì)蝦總數(shù)×100%；

1.6 樣品采集

分別于實(shí)驗(yàn)的第25天和第49天，每組隨機(jī)取4只蝦，解剖取出腸道、肝胰臟，-80℃保存?zhèn)溆?。使用一次性無菌注射器從對(duì)蝦腹部血竇中抽取血淋巴，在4℃下冷藏12h，5000r/min冷凍離心10min，取出上層血清，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 指標(biāo)測(cè)定

1.7.1 生長指標(biāo) 相對(duì)增重率(Weight gain rate, WGR)和特定生長率(Specific growth rate, SGR)分別按照下列公式計(jì)算：

WGR =[(Wt-W0) / W0] ×100%;

SGR=[(lnWt- lnW0) /T] ×100%。

其中：W0，Wt分別表示實(shí)驗(yàn)開始與結(jié)束時(shí)對(duì)蝦濕體質(zhì)量；T為2次測(cè)定期間的間隔天數(shù)。

1.7.2 消化酶測(cè)定

淀粉酶 采用試劑盒(購自南京建成生物研究所)測(cè)定。淀粉酶單位定義為組織中每毫克在37℃與底物作用30min，水解1mg淀粉定義為1個(gè)活力單位。酶活性以酶的比活力表示。

蛋白酶 采用南京建成胰蛋白酶測(cè)定試劑盒測(cè)定。每單位定義為：pH=8.0，37℃條件下，每毫克蛋白中含有的胰蛋白酶每分鐘使吸光值變化0.003即為1個(gè)酶活力單位。

酶液蛋白濃度 采用考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒(購自南京建成生物研究所)測(cè)定。

1.7.3 免疫指標(biāo)測(cè)定 各免疫指標(biāo)采用如下方法進(jìn)行測(cè)定。

(1)血清過氧化物酶(POD)活力的測(cè)定采用改進(jìn)的史成銀等[17]的方法。在96孔酶標(biāo)板中依次加入血清20μL和180μL的顯色緩沖液(7.3g檸檬酸，11.86g二水磷酸氫二鈉用無菌水稀釋至1L)。首先用酶標(biāo)儀于490nm波長下測(cè)定吸光值A(chǔ)1，然后再加入20μL顯色液(44μL 30%過氧化氫，4mg鄰苯二胺，10mL顯色緩沖液)，置于酶標(biāo)儀中搖勻后，避光顯色15min，于490nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)2。血清中POD活力用A2-A1計(jì)算。

(2)血清超氧化物歧化酶(SOD)活力測(cè)定采用南京建成生物工程研究所的SOD試劑盒。每毫升血清SOD的抑制率達(dá)50%時(shí)為1個(gè)SOD活力單位(U)。

(3)血清酚氧化酶(PO)活力測(cè)定采用改進(jìn)的Ashida等[18]的方法。以L-多巴為底物，在96孔酶標(biāo)板中進(jìn)行。在96酶標(biāo)板中的小孔內(nèi)依次加入0.01mol/L L-多巴10μL、0.1mol/L磷酸鉀緩沖液(pH=6.4)200μL和10μL的血清，再將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中震蕩4次，于490nm波長每2min測(cè)一次吸光值。每毫升樣品每分鐘OD值增加0.001為1個(gè)酶活力單位(U)。

(4)抗菌酶活力采用改進(jìn)的Hultmark等[19]的方法進(jìn)行。將大腸桿菌用pH=6.4的1mol/L磷酸鉀鹽緩沖液配成OD570=0.4的菌懸液，取3mL菌懸液放入干凈試管中(冰水浴條件下)，再向試管中加血清50μL，震蕩混勻，用分光光度計(jì)于570nm波長下測(cè)其吸光值A(chǔ)3，再將試管置于37℃水浴鍋中恒溫放置30min，冰水浴中終止反應(yīng)， 570nm下測(cè)定此時(shí)的吸光值A(chǔ)4?？咕盍Φ挠?jì)算公式為[(A3-A4)/A4]1/2。

1.8 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，當(dāng)差異顯著(P<0.05)時(shí)，用Duncan檢測(cè)法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 生長

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，弧菌組的增重率、特定生長率最低，桿菌破碎組最高，但差異均不顯著，各組的成活率差異不顯著(見表1)。

表1 凡納濱對(duì)蝦的生長和成活率Table 1 The growth weight and survival rate of Litopenaeus vannamei(mean±S.E.)

2.2 消化酶

如圖1、2所示，25d時(shí)，對(duì)照組和桿菌組肝胰臟中蛋白酶活力顯著高于其他各組，桿菌破碎組最低(P<0.05)。各處理組腸道中蛋白酶活力顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，桿菌破碎組腸道蛋白酶活力最高，桿菌組顯著低于其他處理組(P<0.05)。49d時(shí)，弧菌組、桿菌組和桿菌破碎組肝胰臟蛋白酶活力顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，桿菌組肝胰臟蛋白酶活力最高。各處理組的腸道蛋白酶活力均有所提高并顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。桿菌破碎組肝胰臟蛋白酶活力最高，腸道蛋白酶活力顯著低于其他處理組(P<0.05)。

圖1 各組肝胰臟胰蛋白酶活力變化

圖2 各組腸道胰蛋白酶活力變化

如圖3、4所示，25d時(shí)，對(duì)照組肝胰臟中淀粉酶活力顯著高于各處理組(P<0.05)，弧菌破碎組和桿菌組最低。對(duì)照組腸道中淀粉酶活力最低，桿菌破碎組最高(P<0.05)。49d時(shí)，對(duì)照組和桿菌破碎組肝胰臟中淀粉酶活力降低，腸道中淀粉酶活力升高。桿菌組肝胰臟中淀粉酶活力上升，腸道中淀粉酶活力下降?；【M肝胰臟和腸道中淀粉酶活力均下降，弧菌破碎組肝胰臟和腸道中淀粉酶活力均升高。對(duì)照組肝胰臟淀粉酶活力最高，弧菌組和桿菌破碎組最低(P<0.05)。桿菌破碎組腸道淀粉酶活力最高，弧菌組和桿菌組最低(P<0.05)。

2.3 免疫相關(guān)酶測(cè)定結(jié)果

2.3.1 過氧化物酶活力 25d時(shí)，弧菌組POD活力高于對(duì)照組，桿菌組和桿菌破碎組POD活力低于對(duì)照組，但差異不顯著(P>0.05)。49d時(shí)，弧菌組、桿菌組和桿菌破碎組POD活力均高于對(duì)照組，但差異不顯著(P>0.05)。

圖3 各組肝胰臟淀粉酶活力變化Fig.3 The change trend of hepatopancreas amylase of different treatments

圖4 各組腸道淀粉酶活力變化Fig.4 The change trend of intestinal amylase of different treatments

2.3.2 超氧化物歧化酶活力 25d時(shí)，弧菌組、弧菌破碎組和桿菌破碎組SOD水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其中桿菌破碎組SOD水平最高。49d時(shí)，弧菌組、弧菌破碎組和桿菌破碎組SOD水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

2.3.3 酚氧化酶活力 25d時(shí)，弧菌破碎組PO水平顯著高于對(duì)照組，桿菌破碎組PO水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。49d時(shí)，弧菌破碎組和桿菌組PO水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，桿菌破碎組PO水平顯著高于弧菌組(P<0.05)，但與對(duì)照組無顯著差異。

2.3.4 抗菌酶活力 25d時(shí)，弧菌組抗菌酶顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。49d時(shí)，弧菌組和弧菌破碎組抗菌酶水平高于對(duì)照組，其中弧菌破碎組與對(duì)照組之間差異顯著(P<0.05)。桿菌組和桿菌破碎組的抗菌酶水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

表2 凡納濱對(duì)蝦非特異性免疫指標(biāo) (mean±S.E.)Table 2 Nonspecific immune index of Litopenaeus vannamei

注：同一行中不同上標(biāo)為差異顯著(P<0.05)。Note：Data in the same row with different superscript letters are significantly different(P<0.05).

2.4 攻毒結(jié)果

由圖5所示，各組半數(shù)致死時(shí)間LT50:對(duì)照組68h, 弧菌組72h,弧菌破碎組78h,桿菌組70h, 桿菌破碎組90h。各處理組半致死時(shí)間分別比對(duì)照組延長了5.9%，14.7%，2.9%和32.4%。在96h時(shí)，對(duì)照組死亡率達(dá)到96.67%，弧菌組為86.67%，弧菌破碎組為80%，桿菌組為96.67%，桿菌破碎組為56.67%。

圖6顯示，桿菌破碎組的免疫保護(hù)率最高。48h后，弧菌破碎組的免疫保護(hù)率一直高于弧菌組和桿菌組。

圖5 凡納濱對(duì)蝦注射WSSV后的累計(jì)死亡率Fig.5 The cummulative moratality rate of Litopenaeus. vannamei after challenged with WSSV

圖6 各實(shí)驗(yàn)組免疫保護(hù)率Fig. 6 The relative percent survival of experiment treatments

3 討論

3.1 溶藻弧菌和芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長存活的影響

本實(shí)驗(yàn)中，各組對(duì)蝦的生長差異并不顯著，與李桂英等[20]的研究結(jié)果不同，這可能是由于實(shí)驗(yàn)時(shí)間較短造成的?；【M在實(shí)驗(yàn)過程中曾有2個(gè)平行出現(xiàn)了大量死亡的現(xiàn)象，其余4個(gè)平行的成活率與其他4個(gè)處理組并沒有顯著差異；而弧菌破碎組在養(yǎng)殖過程中并未出現(xiàn)大量死亡的現(xiàn)象，提示使用破碎弧菌更加安全。大部分溶藻弧菌被認(rèn)為是一種條件致病菌，在環(huán)境條件變化或動(dòng)物免疫力下降時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生致病性[9]。此株溶藻弧菌處理的凡納濱對(duì)蝦有2組在養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)大量死亡的原因尚不能確定，因此此株溶藻弧菌仍需要一定的安全性試驗(yàn)確認(rèn)其安全性才能進(jìn)一步投入使用。

3.2 溶藻弧菌和芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦消化酶的影響

馮雪等在草魚和銀鯽的腸道菌群中發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)蛋白質(zhì)酶和淀粉酶的弧菌和芽孢桿菌[21]。De Schrijver等發(fā)現(xiàn)在飼料中添加解蛋白弧菌(Vibrioproteolyticus)能夠提高大菱鲆的蛋白消化效率[22]。實(shí)驗(yàn)證明，在飼料中添加芽孢桿菌或外源微生物酶能夠促進(jìn)提高的腸道消化酶活性[23-24]。本實(shí)驗(yàn)4個(gè)菌添加處理組的腸道蛋白酶活力都顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，養(yǎng)殖過程中各組腸道蛋白酶活力均有所上升，支持上述結(jié)論。桿菌組腸道蛋白酶活力顯著低于桿菌破碎組并且顯著低于弧菌組，說明芽孢桿菌和溶藻弧菌的胞外酶可能存在較大的差異，芽孢桿菌的胞內(nèi)產(chǎn)物能更好的提高腸道蛋白酶活力。4個(gè)菌處理組的肝胰臟淀粉酶活力均顯著低于對(duì)照組，弧菌組和桿菌組的肝胰臟蛋白酶活力在49d時(shí)顯著高于其他各組，其他各組無顯著差異。劉波用地衣芽孢桿菌投喂異育銀鯽發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌能夠提高腸道消化酶活力，對(duì)肝胰臟蛋白酶活力無影響，顯著降低肝胰臟淀粉酶活力[25]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之一致。這可能是由于細(xì)菌隨飼料進(jìn)入腸道，無法直接作用到肝胰臟，同時(shí)腸道和肝胰臟的消化酶活力可能存在著一定相互作用關(guān)系，導(dǎo)致肝胰臟的淀粉酶活力下降。

弧菌破碎組和桿菌破碎組的腸道淀粉酶活力變化趨勢(shì)與對(duì)照組相似，弧菌組和桿菌組的淀粉酶活力在49d時(shí)下降，顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。破碎桿菌組的腸道淀粉酶活力始終最高。說明飼料中添加溶藻弧菌和芽孢桿菌活菌以及破碎菌體均能提高對(duì)蝦腸道的淀粉酶活性，添加芽孢桿菌和溶藻弧菌活菌在短期內(nèi)具有一定效果，添加破碎菌體有效時(shí)間更長，添加破碎桿菌效果最好。曹煜成在凡納濱對(duì)蝦消化酶的體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，一定量的地衣芽孢桿菌胞外酶能夠提高對(duì)蝦腸道淀粉酶活力，當(dāng)外源酶添加量大于0.02U/mg時(shí)，腸道淀粉酶隨著添加量的上升而降低[26]。飼料中添加活菌的處理組在養(yǎng)殖后期腸道淀粉酶活力下降可能是由于持續(xù)投喂添加活菌的飼料導(dǎo)致腸道外源酶過多造成的。

劉成榮發(fā)現(xiàn)在飼料中添加嗜水氣單胞菌的脂多糖和繡球菌菌多糖能夠提高泥鰍的免疫功能和消化功能[27]。很多糖類物質(zhì)如殼聚糖[28]、低聚木糖[29]、葡聚糖和甘露寡糖[30]等被證明添加到飼料中能夠促進(jìn)甲殼動(dòng)物的消化酶活力。本實(shí)驗(yàn)中，破碎菌處理組的腸道消化酶活性均高于活菌處理組，顯示破碎菌體對(duì)腸道消化酶的促進(jìn)作用優(yōu)于活菌的胞外酶，其中破碎菌中的多糖類物質(zhì)可能具有一定作用功效。芽孢桿菌BZ5株及溶藻弧菌VZ5株菌胞內(nèi)多糖成分對(duì)對(duì)蝦消化酶活力的影響值得進(jìn)一步探討。

3.3 溶藻弧菌和芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦非特異性免疫的影響

酚氧化酶酶原激活系統(tǒng)在對(duì)蝦的非特異性免疫中承擔(dān)著識(shí)別異物、激活細(xì)胞免疫和體液免疫的作用[31]。SOD是甲殼動(dòng)物中重要的抗氧化酶，可以清除體內(nèi)的活性氧及其自由基，與機(jī)體的抗應(yīng)激性、抗逆性具有較大的相關(guān)性[32]。對(duì)蝦受到環(huán)境脅迫或病原菌感染時(shí)，SOD和PO先上升后下降并達(dá)到穩(wěn)定水平，可能高于、低于或等于正常水平，這一過程一般是在48h內(nèi)完成的[33-35]。本實(shí)驗(yàn)中，弧菌組SOD水平顯著高于對(duì)照組而PO水平與對(duì)照組無顯著差異，桿菌組則與之相反。說明這2株細(xì)菌分別對(duì)凡納濱對(duì)蝦的SOD和PO具有長期而穩(wěn)定的影響。提示BZ5株和XZ5株對(duì)對(duì)蝦免疫的影響途徑可能有所不同。

3.4 溶藻弧菌和芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦抗病力的影響

各組對(duì)蝦的半致死時(shí)間為桿菌破碎組>弧菌破碎組>弧菌組>桿菌組>對(duì)照組。李桂英[20]在用堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌和美人魚發(fā)光桿菌投喂南美白對(duì)蝦的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，投喂益生菌能顯著提高南美白對(duì)蝦的非特異性免疫酶活性和抗病力。劉君等[8]在實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)投喂芽孢桿菌能顯著提高凡納濱對(duì)蝦抵抗WSSV的能力。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌VZ5株的活菌對(duì)于凡納濱對(duì)蝦抗病力的提高效果要高于芽孢桿菌BZ5活菌，同時(shí)發(fā)現(xiàn)飼料添加破碎菌體能比添加活菌更好地提高對(duì)蝦的抗病力。一般認(rèn)為在飼料中添加細(xì)菌是通過以下幾個(gè)方面提高養(yǎng)殖動(dòng)物的抗病力：(1)建立優(yōu)勢(shì)菌群，通過細(xì)菌間的拮抗作用抑制有害菌的生長，減少發(fā)病率[36-37]。(2)菌體本身或分泌的酶類、氨基酸、糖類等代謝物為養(yǎng)殖動(dòng)物提供了營養(yǎng)，通過改善養(yǎng)殖動(dòng)物的體質(zhì)來減少動(dòng)物的發(fā)病率[38]。(3)細(xì)菌本身能夠刺激養(yǎng)殖動(dòng)物的免疫系統(tǒng)，或能產(chǎn)生某些免疫調(diào)控物質(zhì)提高對(duì)象的免疫水平從而提高養(yǎng)殖動(dòng)物的抗病力[39]。本實(shí)驗(yàn)中破碎細(xì)菌能夠比活菌更好的提高對(duì)蝦的抗病力，這提示來自于細(xì)菌菌體內(nèi)部的某些活性成分可能具有促進(jìn)對(duì)蝦抗病力的作用。

4 結(jié)論

飼料中添加芽孢桿菌和溶藻弧菌及其破碎菌體均能在一定程度上提高對(duì)蝦的消化、免疫相關(guān)酶水平和抗病力。其中添加弧菌破碎菌體能更好的提高對(duì)蝦的非特異性免疫水平，添加桿菌破碎菌體能更好的提高對(duì)蝦消化水平和抗病力，破碎弧菌相較于弧菌活菌有更好的安全性。在養(yǎng)殖生產(chǎn)中添加破碎菌體能夠達(dá)到較好的效果，并在生態(tài)環(huán)境保護(hù)和養(yǎng)殖安全方面有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

[1] 黃凱, 王武. 南美白對(duì)蝦國外養(yǎng)殖發(fā)展概況及我國養(yǎng)殖現(xiàn)狀, 存在的問題與對(duì)策 [J]. 內(nèi)陸水產(chǎn), 2002, 8: 11-14.

[2] 王立新. 我國南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖現(xiàn)狀 [J]. 中國漁業(yè)經(jīng)濟(jì), 2001, 5: 22-23.

[3] 胡毅, 譚北平, 麥康森，等. 飼料中益生菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長、腸道菌群及部分免疫指標(biāo)的影響 [J]. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2008, 15(2): 244-251.

[4] Rengpipat S, Phianphak W, Piyatiratitivorakul S, et al. Effects of a probiotic bacterium on black tiger shrimp(Penaeusmonodon) survival and growth [J]. Aquaculture, 1998, 167(3): 301-313.

[5] Ochoa-Solano J L, Olmos-Soto J. The functional property ofBacillusfor shrimp feeds [J]. Food Microbiol, 2006, 23: 519-525.

[6] Vaseeharan B, Ramasamy P. Control of pathogenic Vibrio spp. by Bacillus subtilis BT23, a possible probiotic treatment for black tiger shrimp Penaeus monodon [J]. Letters in Applied Microbiology, 2003, 36(2): 83-87.

[7] Rengpipat S, Rukpratanporn S, Piyatiratitivorakul S, et al. Immunity enhancement in black tiger shrimp (Penaeusmonodon) by a probiont bacterium (BacillusS11) [J]. Aquaculture, 2000, 191: 271-288.

[8] 劉君, 宋曉玲, 劉莉, 等. 2 株消化道優(yōu)勢(shì)菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫酶活性和抗白斑綜合征病毒感染力的影響 [J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2012, 36(3): 444-450.

[9] 陳強(qiáng), 鄢慶枇, 馬甡. 藻弧菌致病性研究進(jìn)展 [J]. 海洋科學(xué), 2006, 30(8): 84-89.

[10] Garriques D, Arevalo G. An evaluation of the production and use of a live bacterial isolate to manipulate the microbial flora in commercial production of Penaeus vannamei postlarvae in Ecuador[C]. Browdy C L, Hopkins J S ed. Swimming through Troubled Water. Proceedings of the Special Session on Prawn Farming, Aquaculture'95. San Diego USA: World Aquaculture Society, 1995: 53-59.

[11] Gatesoupe F J. Siderophore production and probiotic effect of Vibrio sp. associated with turbot larvae, Scophthalmus maximus [J]. Aquat Living Resour, 1997, 10: 239-246.

[12] 單洪偉. 底質(zhì)改良及固定化微生物技術(shù)對(duì)對(duì)蝦養(yǎng)殖環(huán)境的調(diào)控[D]. 青島: 中國海洋大學(xué), 2013: 47-68.

[13] 李桂英. 對(duì)蝦腸道益生菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦非特異免疫力和抗病力影響的研究[D]. 青島： 中國海洋大學(xué), 2011.

[14] 王秀華, 黃健, 宋曉玲. 免疫增強(qiáng)劑一肽聚糖在對(duì)蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用 [J]. 海洋水產(chǎn)研究, 2003, 24(1): 69-74.

[15] 路景濤, 陳敏珠. 復(fù)方黃芪提取物對(duì)細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌 TNFα, NO 及 IL-1 的影響 [J]. 安徽醫(yī)藥, 2006, 10(5): 330-331.

[16] 付文卓. 兩株益生菌對(duì)雞胚腸細(xì)胞 NO, IFN-γ 產(chǎn)生的影響[D]. 哈爾濱： 東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010.

[17] 史成銀, 黃健, 宋曉玲. 對(duì)蝦皮下及造血組織壞死桿狀病毒單克隆抗體的ELISA 快速檢測(cè) [J]. 中國水產(chǎn)科學(xué), 1999, 6(3): 116-118.

[18] Ashida M. Purification and characterization of pre-phenoloxidase from hemolymph of the silkworm Bombyx mori [J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1971, 144(2): 749-762.

[19] Hultmark D, Steiner H, Rasmuson T, et al. Insect immunity. Purification and properties of three inducible bactericidal proteins from hemolymph of immunized pupase of Hyalophera cecropia [J]. Eur Biochen, 1980, 10(6): 7-16.

[20] 李桂英, 宋曉玲, 孫艷, 等. 幾株腸道益生菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦非特異免疫力和抗病力的影響 [J]. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2011, 18(6): 1358-1367.

[21] 馮雪, 吳志新, 祝東梅, 等. 草魚和銀鯽腸道產(chǎn)消化酶細(xì)菌的研究 [J]. 淡水漁業(yè), 2008, 1(3): 51-57.

[22] De Schrijver R, Ollevier F. Protein digestion in juvenile turbot (Scophthalmus maximus) and effects of dietary administration of Vibrio proteolyticus [J]. Aquaculture, 2000, 186(1): 107-116.

[23] 葉元土, 張勇, 張宇, 等. 酶制劑 EA-Ⅱ 和生物制劑 BA-Ⅰ 對(duì)鯉腸道, 肝胰臟的蛋白酶和淀粉酶活力的影響 [J]. 大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào), 1993, 8(1): 79-82.

[24] 丁賢, 李卓佳, 陳永青, 等. 芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長和消化酶活性的影響 [J]. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2004, 11(6): 580-584.

[25] 劉波, 劉文斌, 王恬. 地衣芽孢桿菌對(duì)異育銀鯽消化機(jī)能和生長的影響 [J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 28(4): 80-84.

[26] 曹煜成, 李卓佳, 馮娟, 等. 地衣芽孢桿菌 De 株之胞外產(chǎn)物對(duì)凡納濱對(duì)蝦淀粉酶活性影響的體外研究 [J]. 臺(tái)灣海峽, 2007, 26(4): 536-5421.

[27] 劉成榮, 陳振平, 張之文. 嗜水氣單胞菌脂多糖及繡球菌多糖對(duì)泥鰍免疫功能及消化功能的影響 [J]. 海洋科學(xué), 2008, 32(12)： 1-9.

[28] 任秀芳, 周鑫, 趙朝陽, 等. 殼聚糖對(duì)克氏原螯蝦生長, 血清相關(guān)免疫因子, 肌肉成分和消化酶的影響 [J]. 大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 28(5): 468-474.

[29] 陳曉瑛, 曹俊明, 王國霞, 等. 芽孢桿菌和低聚木糖對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長和消化酶活力的影響 [J]. 飼料工業(yè), 2011, 32(20): 18-22.

[30] 譚崇桂, 冷向軍, 李小勤, 等. 多糖, 寡糖, 蛋白酶對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長, 消化酶活性及血清非特異性免疫的影響 [J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 22(1): 93-99.

[31] 李光友. 中國對(duì)蝦疾病與免疫機(jī)制 [J]. 海洋科學(xué)，1995(4)： 1-3.

[32] 孔祥會(huì)，王桂忠，艾春香，等. 鋸緣青蟹不同器官組織中總抗氧化能力和SOD活性的比較研究 [J]. 臺(tái)灣海峽，2003: 469-474.

[33] 章躍陵, 王三英, 劉光明, 等. 南美白對(duì)蝦血藍(lán)蛋白對(duì)酚氧化酶活性的影響 [J]. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2005， 12(4): 402-406.

[34] 姜令緒, 潘魯青, 肖國強(qiáng). 氨氮對(duì)凡納對(duì)蝦免疫指標(biāo)的影響 [J]. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2004, 11(6): 537-541.

[35] 趙先銀, 李健, 陳萍, 等. pH 脅迫對(duì) 3 種對(duì)蝦存活率, 離子轉(zhuǎn)運(yùn)酶和免疫酶活力的影響 [J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 20(5): 720-728.

[36] 徐致遠(yuǎn). 乳桿菌的腸道定殖和菌群調(diào)節(jié)作用研究 [D]. 無錫: 江南大學(xué), 2006.

[37] 潘康成, 陳正禮, 崔恒敏, 等. 利用 ERIC-PCR 和 PCR-DGGE 技術(shù)分析喂服枯草芽孢桿菌肉雞腸道菌群的多樣性 [J]. 動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào), 2010(4): 985-991.

[38] 權(quán)小芳, 馬曉豐, 田維熙. 光合細(xì)菌對(duì)動(dòng)物的營養(yǎng)作用及對(duì)動(dòng)物疾病的防治作用 [J]. 中國動(dòng)物保健, 2011(2): 27-30.

[39] 顧笑梅, 孔健, 王富生, 等. 一株乳酸菌所產(chǎn)胞外多糖對(duì)荷瘤小鼠機(jī)體免疫功能影響的研究 [J]. 微生物學(xué)報(bào), 2003, 43(2): 251-256.

責(zé)任編輯 朱寶象

Effects of Bacillus sp. and Vibrio alginolyticus on the Activities of Digestive and Immune Enzymes Disease Resistance of Litopenaeus vannamei

XU Yu-Jie，SHAN Hong-Wei，MA Shen

(The Key Laboratory of Mariculture， Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China )

A 49-day feeding experiment was conducted to evaluate the effects of different bacteria on the activities of peroxidase (POD), superoxide dismutase (SOD) and phenoloxidase (PO) and the resistance of shrimp (Litopenaeusvannamei) with an initial body weight of 3.58±0.32g. Shrimps were fed five diets including the basic pellet, livingBacillus(the basic pellet supplemented withBacillussp. BZ5), livingVibrio(the basic pellet supplemented withVibrioalginolyticusVZ5), deadBacillus(the basic pellet supplemented with brokenBacillussp.), and deadVibrio(the basic pellet supplemented with brokenVibrioalginolyticus). The bacterial dosage supplemented in diets was 108CFU/g diet. Diets with bacterial supplementation improved the activity of protease and amylase in intestine in 25 days (P<0.05). After 49 days, the amylase activity in intestine of shrimps feeding livingand deadVibriosupplemented diets is significantly higher than that of control. The activities of Intestine digestive enzymes of shrimps feeding deadBacillussupplemented diets were higher than those of shrimps feeding livingBacillussupplemented diets. After 49 days, SOD of shrimps feeding livingVibriosupplemented diets was significantly improved, and SOD, PO and bacterial resistance of shrimps feeding deadVibriosupplemented diets were significantly improved. Phenol oxidase of shrimps feeding livingBacillussupplemented diets was significantly higher than that of control while the activity of immune enzymes dropped significantly. The activities of SOD and PO of shrimps feeding deadBacilluswere significantly improved while those of immune enzymes dropped significantly. When challenged by WSSV, the half lethal time of shrimps feeding with deadBacillussupplemented diets was longer than those feeding with deadVibriosupplemented diets, livingVibriosupplemented diets and livingBacillussupplemented diets in an descending order. The results suggested that the diet supplemented with livingVibrioandBacillusimproved the activities of Intestinal digestive enzymes, immunity of shrimp and the disease resistance of shrimps. DeadVibriowas better than others in improving the immunity of shrips while deadBacilluswasbetter in inproving the activity of digestive enzymes and disease resistance.

Litopenaeusvannamei;Bacillus;Vibrioalginolyticus; digestive enzyme; immunity

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(201103034)資助

2014-01-26；

2014-04-10

許玉潔(1988-)，女，碩士生。E-mail: xyjouc@163.com

** 通訊作者： E-mail: mashen@ouc.edu.cn

S917.4

A

1672-5174(2015)05-046-08

10.16441/j.cnki.hdxb.20140031