李占省，劉玉梅*，方智遠(yuǎn)，楊麗梅，莊 木，張揚(yáng)勇，李凌云，呂紅豪，孫培田

(1．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京100081;2．農(nóng)業(yè)部蔬菜品質(zhì)監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心，北京100081)

十字花科蕓薹屬蔬菜(Brassica oleracea)如甘藍(lán)、白菜、青花菜、花椰菜、芥藍(lán)、苤藍(lán)等含有豐富的粗纖維、蛋白質(zhì)、維生素C和一些礦物質(zhì)如鈣、磷、鐵、鋅等。其中，蕓薹屬甘藍(lán)類蔬菜如青花菜、甘藍(lán)、羽衣甘藍(lán)等還含有一種抗癌活性成分——萊菔硫烷(Sulforaphane，SF)(圖1)。萊菔硫烷分子量為177．29，是一種異硫氰酸鹽類物質(zhì)。它在蔬菜中以4-甲亞磺酰基丁基硫甙(Glucoraphanin，GRA或RAA)的形式存在于植物液泡中。GRA自身并無生物活性，只有當(dāng)細(xì)胞遭到破壞時(shí)才與細(xì)胞基質(zhì)中黑芥子酶發(fā)生水解反應(yīng)，生成萊菔硫烷［1－2］。研究表明，萊菔硫烷能夠顯著降低多種癌癥的發(fā)病率如胃癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和肺癌等。此外，它在治療近視、老年癡呆和心腦血管疾病方面也有一定的功效［3－10］。

圖1 萊菔硫烷結(jié)構(gòu)式

萊菔硫烷的檢測(cè)方法有氣相色譜(GC)、氣相色譜－質(zhì)譜(GC-MS)和高效液相色譜(HPLC)［11－12］。目前，人們多采用HPLC法測(cè)定萊菔硫烷含量，但萊菔硫烷在高溫下不穩(wěn)定且易降解，所以GC和GC-MS法逐漸被HPLC替代。由于HPLC法往往需要較長的洗脫時(shí)間或沖洗時(shí)間，檢測(cè)比較耗時(shí)［13］。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確檢測(cè)蔬菜中萊菔硫烷的方法，對(duì)于提高工作效率和減少試劑消耗具有重要價(jià)值。筆者采用酶解－萃取法提取萊菔硫烷，以甲醇和水為流動(dòng)相，建立一種快速檢測(cè)萊菔硫烷的超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料 萊菔硫烷標(biāo)準(zhǔn)樣品購于美國LKTTM，純度大于98%。將10 mg標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇(HPLC)定容到10 ml棕色容量瓶中，配制成1 000 mg/L的母液，在－20℃低溫、避光保存。根據(jù)需要吸取一定量的母液，將其分別稀釋成0．1、0．5、1．0、5．0、10．0 和 20．0 μg/L 系列標(biāo)準(zhǔn)液。

1．2 樣品采集 甘藍(lán)類蔬菜被栽培于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所試驗(yàn)基地。分別對(duì)甘藍(lán)類蔬菜可食性部分(商品器官)進(jìn)行取樣，即甘藍(lán)(葉球)4份、青花菜(花球)4份、芥藍(lán)(花薹)4份和苤藍(lán)(球莖)4份。取樣后，將其去雜、擦干，然后根據(jù)需要將一定量樣品進(jìn)行液氮處理，真空冷凍、干燥。

1．3 樣品前處理 將真空冷凍、干燥好的樣品統(tǒng)一機(jī)械粉碎成粉末，精確稱取干燥樣品0．5 g，按照料液比為1∶30的比例加入pH為7．0的緩沖液(磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀配制，0．1 mol/L)，在室溫下酶解1．5 h，加入30 ml乙酸乙酯進(jìn)行萃取，5 500 r/min離心10．0 min，收集上清液，重復(fù)萃取2次后合并3次萃取液，將萃取液在35℃下旋轉(zhuǎn)蒸干，最后用10．0 ml甲醇定容，過濾膜(0．22 μm)，低溫 －20 ℃保存。

1．4 色譜－質(zhì)譜條件

1．4．1 色譜條件。Waters BEH 反相 C18(2．1 mm × 50．0 mm，1．7 μm)，柱溫30 ℃，流速0．25 ml/min，進(jìn)樣量10 μl，流動(dòng)相為甲醇和水。方法為梯度洗脫，即B泵(甲醇)初始濃度為40%，A泵為60%，10 min時(shí)B泵變?yōu)?00%，13 min時(shí)變?yōu)?0%，A泵又重新變?yōu)?0%，結(jié)束此次進(jìn)樣。

1．4．2 質(zhì)譜條件。電噴霧離子源ESI(+)，毛細(xì)管電壓為3．0 kV，離子源溫度為110℃，脫溶劑氣溫度為350℃，脫溶劑氣流量為500 L/h，錐孔反吹氣流量為50 L/h。檢測(cè)模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式(MRM)，見表1。保留時(shí)間為2．17 min。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)

2 結(jié)果與分析

2．1 樣品提取條件的優(yōu)化 萊菔硫烷具有旋光性，在高溫和強(qiáng)酸堿條件下極不穩(wěn)定［14］。萊菔硫烷前體GRA在不同的pH條件下生成的次生代謝產(chǎn)物不同，在pH 3．0～5．0時(shí)以腈類為主，在中性條件下以異硫氰酸酯類為主，而萊菔硫烷就屬于該組分，在偏堿條件下以硫氰酸酯類為主，因此要提高萊菔硫烷的生成量，就必須嚴(yán)格控制酶解條件的pH環(huán)境［15－16］。

對(duì)萊菔硫烷萃取劑的選擇，多采用乙酸乙酯［17］。該研究對(duì)乙酸乙酯、乙腈和二氯甲烷等有機(jī)溶劑展開了研究。乙腈與水互溶，分離比較困難;二氯甲烷具有中等毒性，微溶于水，與水接觸后會(huì)緩慢釋放出氯化氫氣體，且其濃度比水大，分離繁瑣;乙酸乙酯為萃取劑，不但可以降低成本和毒性，其濃度比水小，不溶于水，易收集上清液。從表2可以看出，乙酸乙酯加樣回收率為94% ～97%，能夠滿足試驗(yàn)和生產(chǎn)需要。

2．2 色譜柱的選擇 萊菔硫烷是一種飽和異硫氰酸鹽，而流動(dòng)相中甲醇濃度始終≥40%。Waters BEH反相C18(2．1 mm×50．0 mm，1．7μm)柱具有較好的峰對(duì)稱性和穩(wěn)定的柱效。1．7μm柱是通用的超高效液相色譜柱，具有較好的pH適應(yīng)性，能夠在1．0～12．0的范圍內(nèi)進(jìn)行分離。三鍵鍵合式烷基柱使其具有較好的選擇性和靈敏度。該研究表明，Waters BEH C18柱能夠很好地分離和檢測(cè)目標(biāo)成分。

2．3 色譜條件的選擇 常用的流動(dòng)相有甲醇和水、乙腈和水。該研究采用梯度洗脫的方法，研究流動(dòng)相分離萊菔硫烷的效果。從保留時(shí)間、雜質(zhì)干擾程度、峰形和基線漂移等方面進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在流速為0．25 ml/min，洗脫程序如表1所述條件下，萊菔硫烷能夠快速地被分離和檢測(cè)，保留時(shí)間為2．17 min，峰形對(duì)稱，無雜質(zhì)干擾(圖2)。因此，最終選用甲醇和水作為流動(dòng)相。

圖2 樣品中萊菔硫烷的MRM圖譜

2．4 質(zhì)譜條件的選擇 將萊菔硫烷的標(biāo)準(zhǔn)液直接進(jìn)樣后全掃描，找出目標(biāo)的分子離子峰，對(duì)其轟擊產(chǎn)生子離子。在MRM模式檢測(cè)條件下，將分子離子和1～2個(gè)信號(hào)強(qiáng)度適宜的子離子組成監(jiān)測(cè)離子對(duì)，使得特征例子的豐度和比例達(dá)到最優(yōu)。

2．5 線性范圍和檢出限 將系列標(biāo)準(zhǔn)液(0．1、0．5、1．0、5．0、10．0和20．0 μg/L)進(jìn)行測(cè)定，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，獲得線性方程。結(jié)果表明，線性方程為 Y=3．69e－4X － 1．27，R2=0．999 4，標(biāo)準(zhǔn)偏差為2．4%(RSD，n=6)，可見線性方程良好。根據(jù)前處理過程，計(jì)算出儀器檢出限(LOD，S/N=3)為0．06 ～0．15 μg/L，定量下限(LOQ，S/N=10)為0．3 ～0．4 μg/L，表明該方法具有較高的靈敏度，能夠進(jìn)行萊菔硫烷的準(zhǔn)確檢測(cè)。

2．6 準(zhǔn)確度和精密度 分別以1．0和5．0μg/L 2個(gè)濃度進(jìn)行加樣，測(cè)定回收率和精密度。從表2可以看出，萊菔硫烷加樣回收率為94% ～97%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0．6% ～1．2%，表明該方法準(zhǔn)確度和精密度較好。

2．7 樣品測(cè)定 根據(jù)建立的UPLC-MS/MS檢測(cè)體系，對(duì)甘藍(lán)類蔬菜4個(gè)變種共計(jì)20份材料進(jìn)行測(cè)定。從表3可以看出，在供試材料中均檢測(cè)到萊菔硫烷成分，且變種材料間存在差異。檢測(cè)結(jié)果表明，在4種甘藍(lán)變種中萊菔硫烷含量平均值分別為 38．65、376．54、151．31 和 133．79 mg/kgDW，可見青花菜花球中平均含量最高，甘藍(lán)葉球中含量最低，芥藍(lán)和苤藍(lán)含量間差別不大。

表2 萊菔硫烷回收率的測(cè)定

表3 蔬菜樣品中來萊菔硫烷含量mg/kgDW

3 結(jié)論

該研究用Waters BEH C18柱，以甲醇和水為洗脫溶劑，采用梯度洗脫的方法可準(zhǔn)確、快速分離目標(biāo)物萊菔硫烷，峰形對(duì)稱。該方法準(zhǔn)確可靠，快速靈敏，能夠滿足在蔬菜中快速檢測(cè)萊菔硫烷的需要。研究表明，在4個(gè)甘藍(lán)類蔬菜變種中均能檢測(cè)到萊菔硫烷成分，甘藍(lán)葉球中萊菔硫烷含量為20．46 ～58．05 mg/kgDW，青花菜花球中含量范圍為85．17 ～607．95 mg/kgDW，芥藍(lán)花薹中含量范圍為 45．59 ～210．12 mg/kgDW，苤藍(lán)球莖中含量范圍為 40．51～205．33 mg/kgDW，可見該法能夠滿足試驗(yàn)和生產(chǎn)需要。

［1］AGRAWAL S，WINNIK B，BUCKLEY B，et al．Simultaneous determination of sulforaphane and its major metabolites frombiological matrices with liquid chromatography-tandem mass spectroscopy［J］．Journal of chromatography B，analytical technologies in the biomedical and life sciences，2006，840(2):99－107．

［2］ALVAREZ-JUBETE L，VALVERDE J，KEHOE K，et al．Development of a novel functional soup rich in bioactive sulforaphane using broccoli(Brassica oleracea L．ssp italica)florets and byproducts［J］．Food Bioprocess Tech，2014，7(5):1310 －1321．

［3］ABDULL RAZISA F，IORI R，IOANNIDESC．The natural chemopreventive phytochemical R-sulforaphane is a far more potent inducer of the carcinogen-detoxifying enzymesystems in rat liver and lung than the S-isomer［J］．International journal of cancer journal international du cancer，2011，128(12):2775－2782．

［4］ABBAOUI B，RIEDL K M，RALSTON R A，et al．Inhibition of bladder cancer by broccoli isothiocyanates sulforaphane and erucin:Characterization，metabolism，and interconversion［J］．Molecular nutrition ＆ food research，2012，56(11):1675 －1687．

［5］ABDULL RAZISA F，NOORNM．Sulforaphane is superior to glucoraphanin in modulating carcinogen-metabolising enzymes in Hep G2 cells［J］．Asian Pacific journal of cancer prevention，2013，14(7):4235 －4238．

［6］AGYEMAN A S，CHAERKADY R，SHAW P G，et al．Transcriptomic and proteomic profiling of KEAP1 disrupted and sulforaphane-treated human breast epithelial cells reveals common expression profiles［J］．Breast cancer research and treatment，2012，132(1):175 －187．

［7］ANDELOVA H，RUDOLF E，CERVINKA M．In vitro antiproliferative effects of sulforaphane on human colon cancer cell line SW620［J］．Acta medica，2007，50(3):171 －176．

［8］ANNABI B，ROJAS-SUTTERLIN S，LAROCHE M，et al．The diet-derived sulforaphane inhibits matrix metalloproteinase-9-activated human brain microvascular endothelial cell migration and tubulogenesis［J］．Molecular nutrition ＆ food research，2008，52(6):692 －700．

［9］LIZ，GALLIU，BECKERL E，et al．Sulforaphane protects hearts from early injury after experimental transplantation［J］．Annals of transplantation:Quarterly of the polish transplantation society，2013，18:558 －566．

［10］MYZAK M C，DASHWOOD R H．Chemoprotection by sulforaphane:Keep one eye beyond Keap1［J］．Cancer letters，2006，233(2):208 －218．

［11］LIANGH，YUANQP，DONGH R，et al．Determination of sulforaphane in broccoli and cabbage by high-performance liquid chromatography［J］．J Food Compos Anal 2006，19(5):473 －476．

［12］CAMPAS-BAYPOLI ON，SANCHEZ-MACHADOD I，BUENO-SOLANO C，et al．HPLCmethod validation for measurement of sulforaphanelevel in broccoli by-products［J］．Biomedical chromatography:BMC，2010，24(4):387－392．

［13］CELIK H，ARIBURNU E，BAYMAK M S，et al．A rapid validated HPLC method for determination of sulforaphane and glucoraphanin in broccoli and red cabbage prepared by various cooking techniques［J］．Anal Methods-Uk，2014，6(13):4559 －4566．

［14］LIANGH，YUANQP，XIAOQ．Effects of metal ions on myrosinase activity and the formation of sulforaphane in broccoli seed［J］．JMol Catal BEnzym，2006，43(1/2/3/4):19 －22．

［15］ROSSITERJT，JONESA M，BONESA M．A novel myrosinase-glucosinolate defense system in cruciferous specialist aphids［J］．Recent Adv Phytochem，2003，37:127 －142．

［16］ANGELINO D，JEFFERY E．Glucosinolate hydrolysis and bioavailability of resulting isothiocyanates:Focus on glucoraphanin［J］．J Funct Foods，2014，7:67 －76．

［17］LI Z S，LIU Y M，F(xiàn)ANG Z Y，et al．Variation of sulforaphane levels in broccoli(Brassica oleracea var．Italica)during flower development and the role of gene Aop2［J］．J Liq Chromatogr R T，2014，37(9):1199 －1211．