李妍芃 顧選 馬愷悅 吳浩忠 趙百孝 劉春生 馬長華 韓麗

·巴西草藥研究專題·

基于DNA條形碼—高效液相色譜聯(lián)用的巴西草藥SENE(番瀉葉)的品種鑒定

李妍芃 顧選 馬愷悅 吳浩忠 趙百孝 劉春生 馬長華 韓麗

目的 對(duì)巴西草藥番瀉葉SENE進(jìn)行品種鑒別,進(jìn)而研究其中番瀉苷A和番瀉苷B的含量并與中國番瀉葉番瀉苷A、B的比較,為其品種整理、臨床使用及資源開發(fā)提供參考。方法利用DNA條形碼—產(chǎn)地—形態(tài)分析聯(lián)用技術(shù)鑒定巴西草藥番瀉葉SENE的基原,高效液相色譜技術(shù)測定番瀉苷A和番瀉苷B的含量。結(jié)果 品種鑒定結(jié)果為番瀉葉,其中番瀉苷A和番瀉苷B兩者的平均總含量為巴西番瀉葉(1.56%)＞中國番瀉葉(1.52%)＞2010年版《中華人民共和國藥典》(一部)的含量要求(1.10%)。結(jié)論 巴西草藥番瀉葉來源于番瀉葉Senna alexandrina Mill.,其番瀉苷A和番瀉苷B的含量與中國番瀉葉差異不顯著,且能達(dá)到藥典要求。

巴西草藥; 番瀉葉; DNA條形碼; 高效液相色譜; 番瀉苷

在巴西植物資源寶藏中有許多植物可用于醫(yī)療保健,防治各種疾病[1]。但是,由于使用特殊語言及符號(hào)收載,品種混亂,遺傳和環(huán)境因素可能導(dǎo)致的各方面差異以及缺少權(quán)威法典等都對(duì)這些藥用植物的品種鑒定造成一定的困難。巴西草藥番瀉葉是巴西應(yīng)用最廣的導(dǎo)瀉藥之一,臨床用于熱結(jié)積滯、便秘腹癰、水腫脹滿等癥已有千余年的歷史[2],但是至今尚確定不了其來源及有效成分,因此對(duì)其進(jìn)行品種整理與質(zhì)量研究十分必要。

確定藥材的基原是藥材品種整理的重要內(nèi)容,通過產(chǎn)地調(diào)研、標(biāo)本采集和植物分類鑒定是藥材品種鑒定的傳統(tǒng)方法,具有準(zhǔn)確、可靠的優(yōu)點(diǎn),但同時(shí)存在耗時(shí)、費(fèi)力等缺點(diǎn),而且對(duì)于缺少背景信息的植物鑒定具有一定的困難。DNA條形碼鑒定是一種較為先進(jìn)的物種鑒定方法,能夠在準(zhǔn)確的基礎(chǔ)上,達(dá)到省時(shí)的目的。其中內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)序列的進(jìn)化速率適中且具有較高的物種分辨率[3],因此被廣泛應(yīng)用于中藥材的物種鑒定[4-6]和種質(zhì)資源鑒定[7]。本課題組建立的DNA條形碼—產(chǎn)地—形態(tài)聯(lián)用的品種鑒定方法,以DNA條形碼分子鑒定為核心,采用產(chǎn)地分析進(jìn)一步篩選結(jié)果,形態(tài)和顯微驗(yàn)證物種及確定入藥部位。與單一的條形碼分析鑒定比較,其準(zhǔn)確度提高了30%,可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)鑒定方法和單一鑒定方法的不足,相互補(bǔ)充,實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、快速地品種鑒定和整理研究。

藥材的品質(zhì)是關(guān)乎安全和有效的核心問題, DNA條形碼分子鑒定雖能較為準(zhǔn)確快速地鑒別品種,但難以進(jìn)行質(zhì)量好壞地判斷。利用高效液相色譜技術(shù)(high performance liquid chromatography, HPLC)對(duì)藥用植物次生代謝物即有效成分的有無及含量進(jìn)行定性和定量研究,既進(jìn)一步驗(yàn)證了品種鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性,同時(shí)又對(duì)藥材的質(zhì)量優(yōu)劣作出初步評(píng)價(jià),能夠?qū)崿F(xiàn)品種整理后根據(jù)科屬信息,結(jié)合中國相關(guān)品種進(jìn)行質(zhì)量分析,基本滿足了現(xiàn)階段對(duì)未知巴西草藥品種和質(zhì)量的同步研究。

本研究通過DNA條形碼—產(chǎn)地—形態(tài)聯(lián)用方法對(duì)巴西草藥番瀉葉的品種進(jìn)行鑒定,HPLC測定其指標(biāo)成分的含量,為巴西草藥的品種整理、合理應(yīng)用和開發(fā)、豐富藥用植物資源及促進(jìn)中醫(yī)藥的全球化發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

巴西草藥番瀉葉(巴西名SENE)3份,每份約200 g,2012年4月購自巴西隆城藥材集散地,樣品的憑證標(biāo)本保存于北京中醫(yī)藥大學(xué)標(biāo)本室。中國番瀉葉藥材購于北京同仁堂,經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為番瀉葉。

1.2 試劑

番瀉苷A(中國食品藥品檢定研究院,批號(hào)110824-201207);番瀉苷B(中國藥品生物制品檢定所,批號(hào)110825-201207);冰醋酸、醋酸銨(分析純,康源化工科技有限公司);乙腈(色譜純,美國Fisher公司);甲醇(色譜純,美國Fisher公司),娃哈哈純凈水。

1.3 儀器

美國Waters公司高效液相色譜儀(Waters 1525型泵,Waters 2996 PDA紫外檢測器);Sartorius BSA124S分析天平,AE-240分析天平,FW177型中藥粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司);KQ-400KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.4 品種整理

巴西草藥番瀉葉品種鑒定采用DNA條形碼—產(chǎn)地—形態(tài)聯(lián)用鑒定方法[8],即首先利用 DNA條形碼相似度分析進(jìn)行鑒定,根據(jù)其產(chǎn)地分析 DNA條形碼鑒定結(jié)果,再根據(jù)形態(tài)特征進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果,三種方法聯(lián)用獲得鑒定結(jié)果。

1.5 含量測定

1.5.1 供試品溶液制備 樣品均經(jīng)過中藥材粉碎機(jī)粉碎并過80目篩,藥材粉末至干燥器中備用。取各干燥樣品粉末約0.2 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密移取50%甲醇30 mL,準(zhǔn)確稱量,超聲處理(功率250W,頻率40 kHz)30分鐘,放冷至室溫后稱量,用50%甲醇補(bǔ)足其減失重量,布氏漏斗抽濾,精密量取續(xù)濾液10 mL于25 mL量瓶中,50%甲醇定容搖勻,0.45μm微孔濾膜濾過,即得。

1.5.2 對(duì)照品溶液制備 稱取經(jīng)真空干燥12小時(shí)的番瀉苷A(C42H38O20)對(duì)照品與番瀉苷B(C42H38O20)對(duì)照品適量,精密稱定,置10 mL棕色量瓶中,加50%甲醇溶液溶解,并定容至刻度,搖勻,0.45μm微孔濾膜濾過,得番瀉苷A 0.0540mg/mL和番瀉苷B 0.1050 mg/mL對(duì)照品溶液。

1.5.3 色譜條件 色譜柱:Sunfire C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5μm,美國Waters公司);流動(dòng)相:甲醇-1 mol/L醋酸—醋酸銨緩沖液(pH 5.0) (1→10分鐘)30:70;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量: 20μL;柱溫:30℃;檢測波長:280 nm和340 nm。

1.5.4 專屬性 采用1.5.1項(xiàng)下溶液制備方法制備對(duì)照品及各樣品供試溶液,分別精密吸取對(duì)照品及各樣品供試溶液20μL,按1.5.2項(xiàng)下色譜條件測定條件進(jìn)樣分析,以考察待測成分相互間是否有干擾、雜質(zhì)成分是否對(duì)待測成分有干擾,各色譜圖見圖1至圖3。測定方法專屬性好,待測成分與其它成分分離度大于1.5,且其他成分對(duì)待測成分測定無干擾。

1.5.5 線性 精密吸取1.5.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液1μL、5μL、10μL、20μL、30μL、40μL,按1.5.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定,記錄峰面積,進(jìn)行回歸分析。番瀉苷A線性方程為:y=44492x-25037,R2為=0.9999,表明番瀉苷A在質(zhì)量范圍0.054μg-2.16μg間與峰面積有良好的線性關(guān)系。番瀉苷B回歸方程與系數(shù)為:y=89038x-59020,R2=0.9999,表明番瀉苷B在質(zhì)量范圍0.105μg-4.2μg間與峰面積有良好的線性關(guān)系,見圖4至圖5。

1.5.6 精密度 精密稱定中國番瀉葉0.2 g,按1.5.1項(xiàng)下樣品制備方法制備中國番瀉葉供試品溶液,精密吸取該供試品溶液20μL,連續(xù)進(jìn)樣6次,結(jié)果番瀉苷 A峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)為1.63%,番瀉苷B峰面積的RSD為1.22%,結(jié)果表明儀器的精密度良好。

1.5.7 穩(wěn)定性 精密稱定中國番瀉葉0.2 g,按“1.5.1”項(xiàng)下樣品制備方法制備樣品溶液一份,分別于室溫放置0小時(shí)、1小時(shí)、3小時(shí)、5小時(shí)、7小時(shí),進(jìn)樣分析,記錄番瀉苷A與B峰面積,計(jì)算RSD值。番瀉苷A和番瀉苷B的RSD分別為1.26%和1.04%,結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)所采用的方法制得的供試品溶液在7小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

1.5.8 重現(xiàn)性 取中國番瀉葉0.2g/份5份,精密稱定,按1.5.1項(xiàng)下制備供試品溶液,進(jìn)樣分析,記錄峰面積,計(jì)算平均值與RSD。番瀉苷A與番瀉苷B的重現(xiàn)性RSD分別為0.79%和1.15%,結(jié)果表明該條件重現(xiàn)性良好。

1.5.9 回收率 取中國番瀉葉0.1g/份9份,精密稱定,分別按藥材含量的80%、100%、120%精密加入番瀉苷A、B對(duì)照品各3份,按照1.5.1項(xiàng)下方法制備供試溶液,制得加樣回收供試品溶液,計(jì)算番瀉苷A、B的加樣回收率與RSD,結(jié)果見表1、表2。番瀉苷A的加樣回收率為99.17%,RSD=1.76%,番瀉苷B的加樣回收率為99.87%,RSD=1.47%,結(jié)果表明該條件加樣回收率良好。

2 結(jié)果與分析

2.1 品種整理

2.1.1 基于DNA條形碼的品種鑒別 PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳驗(yàn)證,在750 bp左右出現(xiàn)單一、清晰且明亮的條帶。3份樣品的測序峰圖良好,測序結(jié)果一致,截取ITS片段后選擇一條序列用于后續(xù)分析。截取ITS片段后,經(jīng)NCBI(美國國立生物技術(shù)信息中心)數(shù)據(jù)庫檢索,樣品與豆科決明屬Senna L.植物相似度最高,相似度范圍為85%～99%,與其他屬相似度均低于87%。因此,該樣品來自豆科決明屬Senna L.植物。根據(jù)分子鑒定指標(biāo)(相同物種相似度達(dá)到 97% 以上),僅有 Senna alexandrina (KF815491.1,99%)符合要求,因此巴西草藥番瀉葉的基原可能為番瀉葉Senna alexandrina Mill.。

2.1.2 基于產(chǎn)地分析的鑒定 《巴西植物志》記載豆科決明屬約60種植物,根據(jù)DNA條形碼鑒定結(jié)果,最佳鑒定結(jié)果Senna alexandrina在巴西分布,并且在巴西以葉子入藥,因此,根據(jù)產(chǎn)地分析巴西草藥番瀉葉的基原為番瀉葉。

2.1.3 基于形態(tài)分析的鑒定 本品呈披針形或長卵形,長約1.5～5 cm,寬約0.3～1.2 cm;略卷曲,全緣,葉端短尖或微凸,葉基歪形不對(duì)稱。上表面黃綠色,下表面灰綠色,上表面較下表面平滑,上表面脈絡(luò)清晰,下表面葉脈稍隆起,兩面均有不明顯細(xì)短毛茸。少數(shù)葉面上散有細(xì)小灰棕色斑點(diǎn)。質(zhì)地較薄脆,微呈革質(zhì)狀。氣微而特異,味微苦,稍有黏性,用開水浸泡為茶色,壓之變?yōu)榛易厣?/p>

粉末黃綠色或淡綠色。晶鞘纖維多,草酸鈣方晶直徑12～15μm。非腺毛單細(xì)胞長100～350μm,直徑12～25μm,壁厚,有疣狀突起,基部稍彎曲。草酸鈣簇晶存在于葉肉薄壁細(xì)胞中,直徑9～30μm。上下表皮細(xì)胞表面觀呈多角形,垂周壁平直,上下表皮均有氣孔,主為平軸式,副衛(wèi)細(xì)胞大多為2個(gè)。形態(tài)分析表明,本品的形態(tài)特征與決明屬植物相同,入藥部位為小葉。

形態(tài)分析結(jié)果表明,本品與番瀉葉的形態(tài)及顯微特征相符合。

2.2 含量測定

分別取巴西番瀉葉和中國番瀉葉0.2g/份,精密稱定,按1.5.1項(xiàng)下制備供試品溶液,進(jìn)樣分析,記錄峰面積,計(jì)算各待測成分含量與RSD,結(jié)果見表3、表4。巴西番瀉葉中番瀉苷A、B平均含量分別為0.7953%和0.7799%;中國番瀉葉中番瀉葉A、B平均含量分別為0.7032%和0.8127%。

3 討論

臨床上的導(dǎo)瀉劑中約有一半含有番瀉葉,它不僅可以藥用,在保健品中也被廣泛利用,現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)證明番瀉葉已超出了通便消脹的范圍,尤其是對(duì)某些急癥的治療,其臨床應(yīng)用前景廣闊。因此,進(jìn)一步研究番瀉葉的資源具有重要的意義。

巴西植物志記載豆科決明屬約60種植物, Senna alexandrina在巴西分布,并且在巴西以葉子入藥,進(jìn)一步確證了DNA條形碼的鑒定結(jié)果。DNA條形碼—產(chǎn)地—形態(tài)分析聯(lián)合化學(xué)進(jìn)行雙指標(biāo)評(píng)價(jià)的方法在條形碼確定物種的前提下選擇其指標(biāo)性成分或有效成分進(jìn)行含量測定,基本能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確快速的定性和定量,滿足目前大多數(shù)藥材的品種鑒定和品質(zhì)評(píng)價(jià)要求,可以作為一種鑒別藥材品質(zhì)的新方法。

巴西番瀉葉與中國番瀉葉中番瀉苷A和B的含量差異不明顯,2010年版《中華人民共和國藥典》(一部)規(guī)定番瀉葉中番瀉苷A與番瀉苷B含量總和不得少于1.1%[9],巴西番瀉葉與中國番瀉葉均符合要求,有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行化學(xué)成分及遺傳多樣性等研究。本研究為巴西草藥的品種整理和臨床應(yīng)用提供了參考依據(jù),同時(shí)也為下一步巴西番瀉葉的資源開發(fā)及質(zhì)量研究奠定了一定基礎(chǔ)。

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Research of Brazilian herb SENE based on DNA barcoding-HPLC combined method evaluation

LIYan-peng,GU Xuan,MA Kai-yue,et al.School of Chinese Materia Medica,Beijing University ofChinese Medicine.Beijing 100102,China

ZHAO Bai-xiao,E-mail:baixiao100@gmail.com

Ob jective To identify the species of Brazilian herb SENE and study on the content of sennoside A and sennoside B,then to compare the results with Chinese Sennae folium,and provide reference for varieties systematics,clinical use and resource exploitation.Methods The source of varieties of Brazilian herb SENE was identified by a technique combined DNA barcoding,geographical origin andmorphological features,and the content of sennoside A and sennoside B was analyzed by HPLC. Results DNA barcoding identification indicated that SENE was Senna alexandrina,and its average total content of sennoside A and sennoside B(1.56%)was higher than its Chinese counterpart(1.52%)and also higher than what is required in Chinese Pharmacopoeia(1.10%).Conclusion Brazilian herb SENE derives from Senna alexandrina Mill.,and its sennoside A and sennoside B content have no significant difference with its Chinese counterpartwhich meets pharmacopoeia requirement.

Brazilian herb; SENE; DNA barcoding; HPLC; Sennoside

R284.1

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.11.007

2015-08-18)

(本文編輯:蒲曉田)

國家國際科技合作專項(xiàng)(2011DFA31370)

100102 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院[李妍芃(碩士研究生)、馬愷悅(碩士研究生)、吳浩忠、劉春生、馬長華],針灸推拿學(xué)院(趙百孝),中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)研究所(韓麗);北京華邈中藥工程技術(shù)開發(fā)中心(顧選)

李妍芃(1990-),女,2013級(jí)在讀碩士研究生。研究方向:分子生藥學(xué)和藥用植物學(xué)研究。E-mail:guiyuan1@163.com

趙百孝(1963-),博士,教授,博士生導(dǎo)師。研究方向:針灸推拿與中醫(yī)藥。E-mail:baixiao100@gmail.com