臧藝玫 顧選 余春霞 王娟 韓麗 吳浩忠 肖瑤 趙百孝 劉春生 馬條華

·巴西草藥研究專題·

基于顯微—DNA條形碼—產(chǎn)地分析聯(lián)用的巴西柑橘屬植物藥FARINHA DE LARANJA (枳殼)基原鑒定研究

臧藝玫 顧選 余春霞 王娟 韓麗 吳浩忠 肖瑤 趙百孝 劉春生 馬條華

目的 利用顯微-DNA條形碼-產(chǎn)地分析聯(lián)用的方法對(duì)巴西柑橘屬植物藥FARINHA DE LARANJA粉末進(jìn)行基原鑒定研究。方法 應(yīng)用顯微鑒定的方法對(duì)藥材粉末的基原進(jìn)行初步判定;再提取樣品DNA,擴(kuò)增ITS序列,利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST功能分析相似度,對(duì)樣品品種進(jìn)行DNA條形碼鑒定;最后結(jié)合產(chǎn)地信息對(duì)數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行篩選。結(jié)果 顯微-DNA條形碼-產(chǎn)地綜合分析結(jié)果表明,該樣品為蕓香科柑橘屬Citrus L.植物酸橙Citrus aurantium的干燥未成熟果實(shí)粉末。結(jié)論 巴西植物藥FARINHADE LARANJA的鑒定可為擴(kuò)大枳實(shí)、枳殼等中藥材的藥用資源提供依據(jù)。

柑橘屬; 藥材粉末; 基原鑒定; DNA條形碼

植物藥基原鑒定的基本方法包括植物文獻(xiàn)學(xué)研究、產(chǎn)地調(diào)研、標(biāo)本采集和實(shí)驗(yàn)室植物分類鑒定等[1],但對(duì)于粉末類藥材,由于其植物形態(tài)特征大部分已被破壞,以上方法均難以實(shí)行。筆者在巴西市場收集藥材樣本時(shí)發(fā)現(xiàn),一種名為FARINHA DE LARANJA的粉末類藥材來源無法確定,因此有必要對(duì)該藥材進(jìn)行基原鑒定。

由于不同科、屬植物的顯微結(jié)構(gòu)具有不同特征,故可利用顯微鑒別的方法初步對(duì)藥材粉末進(jìn)行鑒定[2];DNA條形碼技術(shù)具有準(zhǔn)確、快速、能鑒別無背景信息物種的優(yōu)點(diǎn)[3-5],可對(duì)屬內(nèi)植物進(jìn)行較為準(zhǔn)確的鑒定;最后結(jié)合該屬植物在產(chǎn)地的分布狀況,可完成藥材粉末的基原鑒定。本文擬采用顯微-DNA條形碼-產(chǎn)地分析聯(lián)用的方法對(duì)FARINHA DE LARANJA粉末進(jìn)行基原鑒定,以期為擴(kuò)大柑橘屬藥用資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

FARINHA DE LARANJA樣品10份,每份200 g, 2012年4月購買于巴西隆城市場藥材集散地,樣品的憑證標(biāo)本保存于北京中醫(yī)藥大學(xué)標(biāo)本室。

1.2 試劑

廣譜植物基因組 DNA快速提取試劑盒(北京博邁德生物有限公司,批號(hào):69632855)、rTaq酶(上海生工生物工程有限公司,批號(hào):695673BE)、乙醇(北京化工廠,批號(hào):1124120381060079)、瓊脂糖(BIOWEST,批號(hào):142045)、ddH2O等。

1.3 儀器

顯微鏡(OLYMPUSCX-21,中國),SY-601超級(jí)恒溫水浴(天津歐諾儀器儀表有限公司),L-901渦旋振蕩儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司), JA1103N千分之一精密電子天平,SIGMA3K-15低溫高速離心機(jī)(SIGMA公司),TECHNE TC-3000PCR擴(kuò)增儀,Bio-Rad電泳儀,水平電泳槽(北京六一儀器廠),JS-680B全自動(dòng)凝膠成像分析儀(上海培清科技有限公司),GRANT制冰機(jī),超純水制備系統(tǒng),KQ5200E型超聲波清洗器,SANYO-80℃超低溫冰箱(SANYO公司),DHG-9145A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.4 基于顯微的鑒定方法

按照《中華人民共和國藥典》(一部)[6]中顯微鑒定的方法,比較樣品與中藥材枳實(shí)顯微特征的異同。

1.5 DNA條形碼鑒定方法

取10份樣品,觀察形態(tài),形態(tài)結(jié)果一致。每份樣品取40 mg進(jìn)行DNA提取。各份樣本分別用液氮冷凍后研磨成細(xì)粉,按照廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒操作步驟提取樣品DNA,1%瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA純度及完整性。采用ITS (internal transcribed spacer)序列通用引物對(duì)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增,ITS-R:5＇-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA-3＇,ITS-F:5＇-TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG-3＇。PCR擴(kuò)增條件:50μL體系含2×Taq PCR MasterMix 25μL,ITS-R(5μmol/L) 2.5μL,ITS-F(5μmol/L)2.5μL,DNA模板4μL,ddH2O 16μL。PCR擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5分鐘,94℃變性1分鐘,55℃退火1分鐘,72℃延伸1分鐘,35個(gè)循環(huán);72℃再延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),條帶單一明亮者即擴(kuò)增成功。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后,送上海生工生物工程有限公司測(cè)序部測(cè)序。各樣品均采用正向和反向測(cè)序,以保證測(cè)序的準(zhǔn)確性。

利用ContigExpress軟件對(duì)測(cè)序獲得的正、反向序列進(jìn)行拼接,以TCGA/T和GACCC/TC作為ITS序列邊界截取ITS序列,然后利用相似度法分析序列。

根據(jù) NCBI中相似度搜索法(basic local alignment search tool,BLAST)功能,檢索樣品的ITS序列,本文以相似度90%以上為屬的鑒定依據(jù),以相似度97%以上的最高相似度物種為物種鑒定依據(jù),獲得鑒定結(jié)果。若BLAST比對(duì)后得到的序列相似度均在97%以下,則認(rèn)為數(shù)據(jù)庫中可能未注冊(cè)該序列,此時(shí),根據(jù)“DNA條形碼鑒定方法”僅能鑒定到屬水平;該屬中未注冊(cè)序列的物種可能為鑒定結(jié)果。

1.6 基于產(chǎn)地分析的鑒定方法

根據(jù)“基于DNA條形碼鑒定方法”項(xiàng)下獲得的科、屬和種的鑒定結(jié)果,依據(jù)《巴西植物志》記載的巴西分布的該屬植物物種信息,依次分析最高相似度物種的產(chǎn)地是否相符合,如果符合,則為產(chǎn)地鑒定結(jié)果,繼續(xù)進(jìn)行下一項(xiàng)分析;如果不符合,則分析第二最高相似度物種,以此類推,分析直至相似度97%的物種。若相似度在97%以上的物種產(chǎn)地均與樣品產(chǎn)地不相符合,則認(rèn)為數(shù)據(jù)庫未注冊(cè)該樣品序列,無法根據(jù)“基于產(chǎn)地分析的鑒定方法”準(zhǔn)確鑒定到種水平。

2 結(jié)果

2.1 FARINHADE LARANJA粉末的顯微鑒定結(jié)果

FARINHADE LARANJA粉末的顯微特征如下:粉末黃白色或淺黃色;中果皮細(xì)胞較多,類圓形或形狀不規(guī)則,壁大多呈不規(guī)則增厚;草酸鈣方晶存在于果皮和汁囊細(xì)胞中,呈斜方形、多面體形或雙錐形,直徑3～30μm;汁囊組織淡黃色或無色,細(xì)胞多皺縮,并與下層細(xì)胞交錯(cuò)排列;螺紋導(dǎo)管、網(wǎng)紋導(dǎo)管及管胞細(xì)小;果皮表皮細(xì)胞表面觀多角形、類方形或長方形,見圖1、圖2。顯微特征分析表明,本品粉末的顯微特征與中藥材枳殼基本相同[7],而無枳實(shí)的“橙皮苷結(jié)晶、油室碎片”等顯微特征,故初步判定該粉末的來源為柑橘屬 Citrus L.植物酸橙Citrus aurantium的干燥未成熟果實(shí)。

2.2 DNA條形碼鑒定結(jié)果

2.2.1 科屬的鑒定 10份樣品的測(cè)序峰圖良好,測(cè)序結(jié)果一致,選擇一條序列用于后續(xù)分析。截取ITS片段后,經(jīng)BLAST檢索,樣品與蕓香科柑橘屬Citrus L.植物相似度最高,相似度范圍為90% ～100%,與其他屬相似度均低于97%。因此,該樣品來自蕓香科柑橘屬Citrus L.植物。

2.2.2 種的鑒定 根據(jù)分子鑒定指標(biāo)(相同物種相 似 度 達(dá) 到 97% 以 上),Citrus clementina (XM006423861. 1, 100%)、 Citrus reticulata (FJ641932.1,100%)、Citrus sinensis(JN681150.1, 100%)及Citrus aurantium(AB456074.1,98%)等植物可能為FARINHA DE LARANJA的基原,其中,最佳鑒定結(jié)果為Citrus clementina。

2.3 基于產(chǎn)地分析的鑒定結(jié)果

《巴西植物志》記載柑橘屬7種植物 C. aurantium、C.decumana、C.limetta、C.limonum、C. medica、C.spinosissima(未注冊(cè))、Citrus vulgaris,根據(jù)DNA條形碼鑒定結(jié)果,最佳鑒定結(jié)果不在巴西分布,在相似度97%以上的可能基原中,只有Citrus aurantium在巴西生長,且在巴西以果實(shí)入藥,因此,根據(jù)產(chǎn)地分析,FARINHA DE LARANJA的基原為蕓香科柑橘屬酸橙Citrus aurantium。

3 討論

粉末類的藥材易于取用且沖泡便捷,但由于性狀特征不明顯,其真?zhèn)舞b別一直是植物藥鑒定中的難點(diǎn)。顯微鑒定是傳統(tǒng)鑒定中的常用方法之一,它能夠?qū)λ幱貌课贿M(jìn)行較為準(zhǔn)確的判斷,但由于屬內(nèi)植物可能存在組織特征的相似性,部分近緣種藥材較難利用顯微鑒別區(qū)分[8]。DNA條形碼技術(shù)準(zhǔn)確度更高,且不依賴于藥材形態(tài)及鑒定人員經(jīng)驗(yàn)[9],更適用于粉末類藥材的鑒定。DNA條形碼的序列分析主要依靠NCBI數(shù)據(jù)庫中注冊(cè)的序列,還需根據(jù)本批藥材的已知產(chǎn)地來源對(duì)數(shù)據(jù)庫中的序列依次進(jìn)行篩選,最終結(jié)合入藥部位確定最佳鑒定結(jié)果。

本文研究表明,本次收集的 FARINHA DE LARANJA藥材的基原植物為蕓香科酸橙 Citrus aurantium的干燥未成熟果實(shí),與2010版《中華人民共和國藥典》(一部)中記載的枳殼基原植物相同。但其是否可被當(dāng)做枳殼使用,尚需對(duì)其主要化學(xué)成分進(jìn)行含量測(cè)定及分析研究。

巴西是全世界柑橘屬Citrus L.產(chǎn)品產(chǎn)量最大的國家,酸橙作為柑橘屬的一種,產(chǎn)量也高于其他產(chǎn)地[10-11]。因此,中國可在巴西建立酸橙栽培基地,適當(dāng)?shù)倪M(jìn)口巴西酸橙幼果和未成熟果實(shí),進(jìn)而擴(kuò)大中藥材枳實(shí)和枳殼的藥用資源。

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The variety identification of FARINHA DE LARANJA powder in Brazil based on a combined analysis ofm icroscopic-DNA barcoding-origin

ZANG Yi-mei,GU xuan,YU Chun-xia,et al. SchoolofChinese Materia Medica,Beijing University ofChinese Medicine,Beijing 100102,China Corresponding author:LIU Chun-sheng,E-mail:max_liucs@263.net

Objective o study the variety identification of a kind of herbal powder of FARINHA DE LARANJA of Citrus L.in Brazil with a combaned analysis ofmicroscope-DNA barcoding-origin. M ethods Microscopic identification was used to identify the variety of samples preliminarily;then ITSsequences were amplified by PCR and sequenced,and BLAST in NCBI database was used to calculate the similarity of sequences to identify variety of samples.,Finally,the DNA barcoding identification results were screened and analyzed according to its geographical origin information.Results The combined analysis of microscopic-DNA barcoding-origin indicated that FARINHA DE LARANJA collected from market in Brazilwas the dried fruit powder of Citrus aurantium.Conclusion The identification of Brazil FARINHADE LARANJA could enrich the alternative resources of Zhiqiao and Zhishi.

Citrus L.; Powder; Varieties identification; DNA barcoding

R284

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.11.008

2015-08-22)

(本文編輯:董歷華)

國家國際科技合作專項(xiàng)(2011DFA31370)

100102 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院[臧藝玫(碩士研究生)、顧選、王娟、肖瑤、吳浩忠、劉春生、馬長華],針灸推拿學(xué)院(趙百孝);北京華邈中藥工程技術(shù)開發(fā)中心(顧選);河南省藥品審評(píng)認(rèn)證中心(余春霞);中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)研究所[韓麗(碩士研究生)]

臧藝玫(1990-),女,2013級(jí)在讀碩士研究生。研究方向:藥用植物與分子生藥學(xué)。E-mail:meiyee0810@sina.com

劉春生(1964-),博士,教授,博士生導(dǎo)師。研究方向:藥用植物與分子生藥學(xué)。E-mail:max_liucs@263.net