臧藝玫 顧選 余春霞 肖瑤 趙百孝 劉春生 馬長華 韓麗

基于DNA條形碼—產(chǎn)地—形態(tài)分析聯(lián)用的巴西馬錢屬植物藥QUINA基原鑒定研究

臧藝玫 顧選 余春霞 肖瑤 趙百孝 劉春生 馬長華 韓麗

目的 通過DNA條形碼—產(chǎn)地—形態(tài)分析聯(lián)用的方法對巴西馬錢屬植物藥QUINA進行基原鑒定研究,為這種藥材的開發(fā)利用提供依據(jù)。方法 通過提取樣品DNA、PCR擴增及雙向測序,獲得樣品的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)序列,利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST功能計算相似度,對其基原進行DNA條形碼鑒定;根據(jù)其產(chǎn)地信息對DNA條形碼鑒定結(jié)果進行篩選和分析;依據(jù)其形態(tài)特征驗證鑒定結(jié)果。結(jié)果 本次收集的植物類藥材QUINA來源于馬錢科馬錢屬植物Strychnos pseudo quina A.St.-Hil.的根皮。結(jié)論 DNA條形碼—產(chǎn)地—形態(tài)三者聯(lián)用的方法可彌補單一鑒定方法的不足,能夠快速、準確的對未知樣品進行基原鑒定。

馬錢屬; ITS序列; 基原鑒定

巴西蘊含豐富的植物資源[1],其中許多植物具有藥用價值[2]。由于沒有植物藥藥典,巴西植物藥的品種鑒別主要依靠口授家傳[3],導致其藥材市場偽品混雜。因此,建立一套規(guī)范化的基原鑒定方法對保證巴西植物藥的用藥安全具有重要意義。

隨著分子生物學的發(fā)展,DNA條形碼技術(shù)為物種鑒定提供了新的依據(jù),其具有準確、快速、能鑒別無背景信息物種的優(yōu)點[4-7],但由于存在相似度閾值等問題,僅依靠DNA條形碼鑒定不能準確完成物種鑒定,還需結(jié)合該屬物種在巴西的分布情況對數(shù)據(jù)庫中的物種進行篩選,最終參照文獻核對該物種的性狀和顯微特征,判斷入藥部位的合理性。

巴西將可以提取到奎寧成分的29種苦味植物藥統(tǒng)稱QUINA[8],但這些不同來源的植物藥中其他的化學成分差異較大,藥理作用也不甚相同,一旦混用將帶來嚴重的安全隱患。作者在巴西市場收集藥材樣本時發(fā)現(xiàn)名為QUINA的藥材,其基原可能為馬錢屬植物,但品種難以確定。本文嘗試利用DNA條形碼—產(chǎn)地—形態(tài)分析聯(lián)用的方法對缺少背景信息的該馬錢屬植物藥進行基原鑒定研究,為其安全、正確的使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

QUINA藥材3份,每份200 g,2012年4月購買于巴西隆城市場藥材集散地。樣品的憑證標本保存于北京中醫(yī)藥大學大學標本室。

1.2 試劑

廣譜植物基因組 DNA快速提取試劑盒(北京博邁德生物有限公司,批號:69632855);rTaq酶(上海生工生物工程有限公司,批號:695671BE)、乙醇(北京化工廠,批號:1124120381060079);瓊脂糖(BIOWEST,批號:142045);ddH2O等。

1.3 儀器

顯微鏡(OLYMPUSCX-21,中國);SY-601超級恒溫水浴(天津歐諾儀器儀表有限公司);L-901渦旋振蕩儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司); JA1103N千分之一精密電子天平;SIGMA3K-15低溫高速離心機(SIGMA公司);TECHNE TC-3000PCR擴增儀,Bio-Rad電泳儀,水平電泳槽(北京六一儀器廠);JS-680B全自動凝膠成像分析儀(上海培清科技有限公司);GRANT制冰機,超純水制備系統(tǒng);KQ5200E型超聲波清洗器;SANYO-80℃超低溫冰箱(SANYO公司);DHG-9145A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)等。

1.4 DNA提取和PCR擴增方法

取3份樣品,觀察形態(tài),形態(tài)結(jié)果一致。每份樣品取40 mg進行DNA提取。各份樣本分別用液氮冷凍后研磨成細粉,按照廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒操作步驟提取樣品DNA,1%瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA純度及完整性。采用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)序列通用引物對樣品進行PCR擴增,ITS-R:5＇-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA-3＇,ITS-F:5＇-TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG-3＇。PCR擴增條件:50μL體系含2×Taq PCR MasterMix 25μL,ITS-R(5μmol/L)2.5 μL,ITS-F(5μmol/L)2.5μL,DNA模板4μL, ddH2O 16μL。PCR擴增程序:94℃預(yù)變性5分鐘,94℃ 變性1分鐘,55℃ 退火1分鐘,72℃ 延伸1分鐘,35個循環(huán);72℃再延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,條帶單一明亮者即擴增成功。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后,送上海生工生物工程有限公司測序部測序。各樣品均采用正向和反向測序,以保證測序的準確性。

1.5 DNA條形碼鑒定方法

利用ContigExpress軟件對測序獲得的正、反向序列進行拼接,以TCGA/T和GACCC/TC作為ITS序列邊界截取ITS序列,然后利用相似度法分析序列。

根據(jù) NCBI中相似度搜索法(basic local alignment search tool,BLAST)功能,檢索樣品的ITS序列,本文以相似度90%以上為屬的鑒定依據(jù),以相似度97%以上的最高相似度物種為物種鑒定依據(jù),獲得鑒定結(jié)果。若BLAST比對后得到的序列相似度均在97%以下,則認為數(shù)據(jù)庫中可能未注冊該序列,此時,根據(jù)“基于ITS序列的鑒定方法”僅能鑒定到屬水平;該屬中未注冊序列的物種可能為鑒定結(jié)果。

1.6 基于產(chǎn)地分析的鑒定方法

根據(jù)“基于DNA條形碼鑒定方法”項下獲得的科、屬和種的鑒定結(jié)果,依據(jù)《巴西植物志》記載的巴西分布的該屬植物物種信息,依次分析最高相似度物種的產(chǎn)地是否相符合,如果符合,則為產(chǎn)地鑒定結(jié)果,繼續(xù)進行下一項分析;如果不符合,則分析第二高相似度物種,以此類推,分析直至相似度97%的物種。若相似度在97%以上的物種產(chǎn)地均與樣品產(chǎn)地不相符合,則認為數(shù)據(jù)庫未注冊該樣品序列,無法根據(jù)“基于產(chǎn)地分析的鑒定方法”準確鑒定到種水平。

1.7 基于性狀分析的鑒定方法

根據(jù)“基于產(chǎn)地分析的鑒定方法”項下獲得的鑒定結(jié)果,查詢植物志(efloras)等數(shù)據(jù)庫的形態(tài)信息,按照《中華人民共和國藥典》(一部)中性狀和顯微鑒定的方法,核對性狀特征和顯微特征,進一步證實鑒定物種結(jié)果和入藥部位。

2 結(jié)果

2.1 DNA條形碼分析鑒定結(jié)果

2.1.1 科屬的鑒定 3份樣品的測序峰圖良好,測序結(jié)果一致,選擇一條序列用于后續(xù)分析。截取ITS片段后,經(jīng) BLAST檢索,樣品與馬錢科馬錢屬Strychnos L.植物相似度最高,相似度范圍為95% ～99%,與其他屬相似度均低于95%。因此,該樣品來自馬錢科馬錢屬Strychnos L.植物。

2.1.2 種的鑒定 經(jīng) BLAST檢索,相似度達到97%以上的物種有Strychnos pseudo quina A.St.-Hil. (JF938028. 1, 99%)、 Strychnos ecuadoriensis (JF937975.1,98%)、Strychnos cogens(JF937962.1, 98%)及Strychnosmitscherlichii(JF938007.1,98%)。故上述植物可能為巴西植物藥QUINA的基原,其中,最佳鑒定結(jié)果為Strychnos pseudoQuina A.St.-Hil.。

2.2 基于產(chǎn)地分析的鑒定結(jié)果

巴西植物志記載馬錢科馬錢屬共有35種植物, ITS序列的最佳鑒定結(jié)果Strychnos pseudoQuina A. St.-Hil.在巴西分布[8-9],因此,根據(jù)產(chǎn)地分析巴西植物藥 Quina的基原為 Strychnos pseudoQuina A. St.-Hil.。

2.3 基于形態(tài)分析的鑒定結(jié)果

樣品的性狀特征如下:淺槽狀,有的為不規(guī)則片狀或塊狀。厚1.0～10.0 mm。外表面紅棕色或棕褐色,多刮去外層栓皮,具“龜裂狀”淺溝紋,和“疙瘩狀”突起,粉性;內(nèi)表面偶見根痕,纖維性。質(zhì)脆,易折斷,斷面多分為兩層,內(nèi)層棕黃色或淺棕紅色,外層紅棕色或棕褐色,有時兩層分開。氣微,味極苦,見圖1。可知本樣品與馬錢屬植物性狀特征較為符合,入藥部位為根皮。

樣品的粉末顯微特征如下:粉末黃棕色;木栓細胞黃棕色,表面觀多角形,側(cè)面觀呈柵欄狀;石細胞類圓形、多角形、長方形或少數(shù)呈紡錘形,紋孔及孔溝明顯;晶鞘纖維纖維束周圍薄壁細胞中常含草酸鈣方晶,形成晶鞘纖維,見圖2。

由于以上顯微特征專屬性不強,且缺少參考資料,無法根據(jù)顯微特征對該樣品基原進行準確鑒定。

3 討論

DNA條形碼分子鑒定技術(shù)為植物藥基原物種的鑒定提供了強有力的科技支撐,但也存在如下問題:由于生物進化機制的復雜性,如多倍化現(xiàn)象,基因水平轉(zhuǎn)移,基因滲入和物種譜系分選不完全等,經(jīng)常造成物種樹與基因樹不一致,導致DNA條形碼序列在一些物種間沒有鑒別力[10];一些物種序列尚未登錄NCBI核酸數(shù)據(jù)庫,因此通過分子鑒定技術(shù)僅能夠鑒定到屬,但不能準確鑒定到物種水平;一些物種沒有準確的鑒定閾值且參比對照序列時常變化,導致鑒定標準難以統(tǒng)一;一些物種在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中比對后會出現(xiàn)相似度在99%以上物種有兩個甚至多個的情況,構(gòu)建鄰接樹時則會出現(xiàn)不同物種聚為一支的現(xiàn)象,因而無法準確進行物種鑒定。綜上所述,僅依靠DNA條形碼技術(shù)還不能滿足植物藥溯源及鑒定的要求。產(chǎn)地適宜性是大部分藥用植物的固有性質(zhì),不同物種在不同國家的分布有所不同,因此產(chǎn)地信息對植物藥的基原鑒定起到了輔助作用;植物的形態(tài)特征,包括性狀特征及顯微特征,是判斷入藥部位的重要依據(jù)。先利用分子鑒定的方法對無背景信息的藥材進行品種溯源,再結(jié)合該藥材的產(chǎn)地及形態(tài)信息對分子鑒定結(jié)果進行篩選和驗證,最后利用形態(tài)特征判斷藥材的入藥部位,三種方法相互補充,彌補了單一鑒定方法的不足,能夠快速、準確地對未知樣品進行基原鑒定。

總而言之，探究式教學是一種以學生為主體，充分發(fā)揮學生主動性的教學模式.在該教學模式下，教師需要把握好自己引導者的角色，認真分析教學內(nèi)容，精心設(shè)計教學活動和問題，不斷地引導鼓勵學生主動地完成探究.該教學模式可以有效地提高學生的自學能力和探究能力，從而向著綜合性人才方向發(fā)展.

本研究結(jié)果表明,本次收集的巴西植物藥QUINA來源于馬錢科馬錢屬Strychnos pseudo quina A.St.-Hil.的根皮。在巴西,Strychnos pseudo quina A.St.-Hil.的根皮一直是提取奎寧的原料之一,用以治療發(fā)熱、瘧疾等癥[8]。因此,中國也可以此為依據(jù),嘗試在馬錢屬植物中提取奎寧。

2010版《中國藥典》收錄的馬錢屬藥材為馬錢Strychnos nux-vomica L.的干燥成熟種子[11]。馬錢子的主要成分是單萜吲哚類生物堿,包括馬錢子堿(brucine)、偽馬錢子堿(pseudobrucine)、番木鱉堿(stryehnine)、4-羥基士的寧(4-hydroxystrychine)等[12-15]。藥理研究顯示,馬錢子提取物具有肌松、中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮、鎮(zhèn)痛、治療風濕性關(guān)節(jié)炎等作用且療效顯著[16-19]。Strychnospseudo quina A.St.-Hil.的根皮中也含有生物堿類[8],具體的化學成分還鮮有報道,但已有研究表明,皮刺馬錢(strychnos aculeata)、里渥馬錢(strychnos castelneana)等馬錢屬其他植物的根皮中也含有多種吲哚類生物堿,如黑馬錢堿(nigritanins)、裸籽士的寧(spermostrychnine)、N-乙?；惾A采馬錢堿(n-acetylisostrychnosplendine)[20]等,與馬錢子的主要成分相似。因此,可對Strychnos pseudo quina A.St.-Hil.和其他馬錢屬植物根皮提取物的化學成分及藥理活性進行深入研究,以期擴大馬錢屬植物的藥用資源。

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The variety identification of QUINA in Brazil based on a combined analysis of DNA barcodingorigin-morphology

ZANG Yi-mei,GU Xuan,YU Chun-xia,et al.School of Chinese Materia Medica,Beijing University ofChinese Medicine.Beijing 100102,China

ZHAO Bai-xiao,E-mail:baixiao100@gmail.com

Objective To study the variety identification of QUINA of Strychnos Linn.with the combined analysis of DNA barcoding-origin-morphology and provide an evidence for the exploitation of this kind of herbal in Brazil.M ethods ITS sequences were amplified by PCR from genomic DNA andsequenced.,BLAST(basic local alignment search tool)in NCBI database was used to calculate the similarity of sequences to identify the variety of samples;then the DNA barcoding identification resultswere screened and analyzed in reference to its origin information;finally,the morphological characteristics of samples was used to verify the accuracy of identification.Results QUINA collected from market in Brazil was the root bark of Strychnos pseudo quina A.St.-Hil.Conclusion The combined analysis of DNA barcoding-origin-morphology couldmake up for the deficitof onefold identificationmethod.It contributes to identifying the variety of unidentified samples quickly and accurately.

Strychnos Linn.; ITS sequence; Variety identification

R284.1

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.11.010

2015-08-18)

(本文編輯:蒲曉田)

國家國際科技合作專項(2011DFA31370)

100102 北京中醫(yī)藥大學中藥學院[臧藝玫(碩士研究生)、顧選、肖瑤、劉春生、馬長華],針灸推拿學院(趙百孝),中醫(yī)養(yǎng)生學研究所(韓麗);北京華邈中藥工程技術(shù)開發(fā)中心(顧選);河南省藥品審評認證中心(余春霞)

臧藝玫(1990-),女,2013級在讀碩士研究生。研究方向:藥用植物與分子生藥學。E-mail: meiyee0810@sina.com

趙百孝(1963-),教授,博士生導師。研究方向:針灸推拿。E-mail:baixiao100@gmail.com