單文超 馮會(huì)賓 趙琰 曾文浩 賀娜娜 趙妍 孫曄 屈會(huì)化

·論著·

間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析法測(cè)定葛根中葛根素的含量

單文超 馮會(huì)賓 趙琰 曾文浩 賀娜娜 趙妍 孫曄 屈會(huì)化

目的 利用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析法(indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay,ic-ELISA)測(cè)定葛根中葛根素的含量。方法 利用抗葛根素單克隆抗體,通過(guò)線(xiàn)性關(guān)系、精密度、回收率的考察,建立葛根素的ic-ELISA分析方法。結(jié)果 該方法的線(xiàn)性范圍為15.6～500 ng/mL,孔間差和板間差均不大于3.5%,平均回收率為101.8%,并且該法檢測(cè)結(jié)果與高效液相色譜法檢測(cè)結(jié)果一致。結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)為葛根質(zhì)量控制以及含葛根藥材的中藥復(fù)方中葛根素的含量測(cè)定提供了一種新技術(shù)方法。

間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析法; 葛根素; 葛根; 含量測(cè)定

葛根為豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.) Ohwi的干燥根[1],具有解肌退熱、透發(fā)麻疹、生津止渴、升陽(yáng)止瀉的作用[2]。葛根素屬于異黃酮類(lèi),是葛根的質(zhì)量控制成分[1],已被廣泛地應(yīng)用于治療臨床多種疾病[3-5]。

葛根素的含量測(cè)定主要采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)[6-8]。近年來(lái),基于小分子單克隆抗體[9-14]建立的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析法(indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay,ic-ELISA)具有特異性強(qiáng),靈敏度高,重復(fù)性好,簡(jiǎn)便快捷,前處理簡(jiǎn)單,經(jīng)濟(jì)無(wú)污染[15]等特點(diǎn),特別適用于微量基質(zhì)生物樣品中小分子含量的分析。在ic-ELISA基礎(chǔ)上建立的膠體金快速檢測(cè)試紙可實(shí)現(xiàn)中藥材的現(xiàn)場(chǎng)快檢,更是引起了藥品監(jiān)管部門(mén)的關(guān)注。

本研究利用實(shí)驗(yàn)室制備的抗葛根素單克隆抗體[16],建立了葛根素ic-ELISA法,準(zhǔn)確測(cè)定了葛根中葛根素的含量,為微量基質(zhì)生物樣品中葛根素的含量分析及葛根素膠體金快速檢測(cè)試紙的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

葛根素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,含量96%,批號(hào):110752-200912),不同批次(3批)葛根飲片均購(gòu)于同仁堂藥店。

高效液相色譜儀(Agilent Technologies 1260 Infinity),甲醇(色譜純,fisher),雙蒸水(娃哈哈), ELISA分析及其他相關(guān)藥品如磷酸鹽和Tween-20等均為國(guó)產(chǎn)分析純。酶標(biāo)二抗(HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG,GeneScript公司),四甲基聯(lián)苯胺(TMB)(美國(guó)Amercso公司),96孔酶標(biāo)板,酶標(biāo)儀(Themo MK3型酶聯(lián)檢測(cè)儀)。

2 方法與結(jié)果

2.1 葛根素單克隆抗體的制備

本實(shí)驗(yàn)室采用高碘酸鈉法[17]成功合成了葛根素的人工抗原,并成功篩選出能夠分泌抗葛根素單克隆抗體的細(xì)胞株AA9,通過(guò)腹水生產(chǎn)法制備出葛根素單克隆抗體[16]。具體過(guò)程為:取6～8周齡的雄性 BALB/C小鼠腹腔注射弗氏不完全佐劑0.2 mL/只;5天后,接種細(xì)胞株AA9;接種10天后,待小鼠腹部明顯膨大,收集腹水,3000 rmp離心20分鐘,離心后收集上清,分裝,于-20℃凍存。

2.2 葛根素單克隆抗體最佳工作濃度的確定

葛根素單克隆抗體以PBS(0.01 mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液)分別稀釋為1∶2000,1∶4000, 1∶8000,1∶16000,1∶32000之后,以每孔100μL加入到已預(yù)先包被并封閉好的酶標(biāo)板中。按照常規(guī)ic-ELISA法測(cè)定A450值,恒溫培養(yǎng)箱37℃孵育1小時(shí),PBST洗板3次;辣根過(guò)氧化氫酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG用磷酸鹽緩沖液1∶20000倍稀釋后,以100μL/孔加入,恒溫培養(yǎng)箱37℃孵育1小時(shí),PBST洗板3次;TMB顯色液100μL/孔加入,恒溫培養(yǎng)箱37℃孵育30分鐘,以50μL/孔加入終止液(2 mol/L硫酸)后立即放入酶標(biāo)儀,檢測(cè)450 nm處的吸光值。選定葛根素單克隆抗體的最佳工作濃度。

結(jié)果測(cè)得上述由1∶2000至1∶32000的5個(gè)稀釋比的A450值分別為1.43,1.28,1.02,0.83, 0.63。因酶標(biāo)儀測(cè)定A值的敏感范圍在1.00左右,為保證測(cè)定結(jié)果的靈敏可靠,抗體稀釋比可選擇為1∶8000。因此,選取葛根素單克隆抗體最佳稀釋比為1∶8000。

2.3 Ic-ELISA方法學(xué)考察

2.3.1線(xiàn)性關(guān)系 (1)包被:96孔酶標(biāo)板加入經(jīng)0.01 mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)1∶4000稀釋的包被原,孵育1小時(shí)后,用洗滌緩沖液(PBS with Tween-20,PBST)洗板3次;(2)封閉:以10%馬血清為封閉液,37℃封閉反應(yīng)1小時(shí);(3)加樣:不同質(zhì)量濃度梯度的葛根素對(duì)照品溶液(以水溶解稀釋)與葛根素單克隆抗體(1∶8000稀釋)的混合液(1∶1)加入酶標(biāo)板的測(cè)定孔中,孵育0.5小時(shí),洗板。以加有葛根素質(zhì)量濃度為0的混合液的測(cè)定孔為陽(yáng)性對(duì)照孔,以只加PBS溶劑的測(cè)定孔為空白對(duì)照孔;(4)加酶標(biāo)二抗:加入經(jīng)PBS 1∶10000稀釋的酶標(biāo)二抗,孵育0.5小時(shí),洗板;(5)顯色與測(cè)定:加入顯色液TMB,顯色15分鐘,以2 mol/L硫酸溶液終止反應(yīng),用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在波長(zhǎng)450 nm處的吸光度A值。以上孵育過(guò)程均在37℃恒溫孵育箱中完成。以葛根素對(duì)照品質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)(X)為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)計(jì)算所得的A/A0(A0為陽(yáng)性對(duì)照孔的吸光度)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),求得回歸方程為:Y=-0.159ln(x)+1.2145,R2=0.9921,以抑制率達(dá)到50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的葛根素質(zhì)量濃度為ic-ELISA的靈敏度IC50,結(jié)果顯示該單克隆抗體抗葛根素的靈敏度為89.5 ng/mL。該法檢測(cè)葛根素的線(xiàn)性范圍為15.6～500 ng/mL。見(jiàn)圖1。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取6個(gè)不同質(zhì)量濃度的葛根素對(duì)照品溶液,按照“2.3.1”項(xiàng)下ic-ELISA法進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行孔,每個(gè)樣品重復(fù)3次,分別測(cè)定孔間差和板間差,對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析可知,平行孔之間檢測(cè)值的RSD為0.1% ～3.3%,各酶標(biāo)板之間檢測(cè)值的RSD為0.5% ～3.5%。見(jiàn)表1。

2.3.3 回收率實(shí)驗(yàn) 精密吸取已知含量的(20 ng/mL)葛根素溶液共6份,分別加入等體積的葛根素對(duì)照品10、20、40、80、160、320 ng/mL,混勻后葛根素的質(zhì)量濃度為 15、20、30、50、90、170 ng/mL。按照本實(shí)驗(yàn)所建立的ic-ELISA法測(cè)定其在450 nm波長(zhǎng)處的吸收值。每個(gè)濃度平行測(cè)定6次,帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性方程計(jì)算,測(cè)得濃度分別為14.1、21.2、28.4、52.3、95.0、180.3 ng/mL?；厥章蕿?4.0%、106.0%、94.7%、104.6%、105.6%、106.1%,回收率均值為101.8%。

2.3.4 含量測(cè)定 不同批次的葛根飲片分別稱(chēng)取3 g,加6倍量水煎煮2次,每次2小時(shí),合并煎液,濾過(guò),濃縮,去離子水定容至50 mL,制備葛根供試品溶液[18]。分別采用本實(shí)驗(yàn)建立的ic-ELISA法和傳統(tǒng)HPLC對(duì)葛根中葛根素含量進(jìn)行測(cè)定,平行測(cè)定3次。Ic-ELISA測(cè)定:回歸方程為:Y=-0.159 ln (x)+1.2145,稀釋至適宜倍數(shù)后,按照“2.3.1”下方法檢測(cè)葛根提取液中葛根素的含量。HPLC測(cè)定:參考 2010年版中國(guó)藥典(一部),選用 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5μm),流動(dòng)相為甲醇與水(25∶75)(V∶V),檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm,進(jìn)樣量10μL(標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為Y=43.475x+ 0.4417)。兩種方法檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2,采用Excel軟件進(jìn)行t檢驗(yàn),P=0.478＞0.05,兩組數(shù)據(jù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此,ic-ELISA與HPLC檢測(cè)結(jié)果具有一致性,從而驗(yàn)證了所建立的ic-ELISA的準(zhǔn)確性。

表2 3批葛根飲片中葛根素的含量(±s,n=3)

含量測(cè)定(μg/mL)批次HPLC ic-ELISA 1 186±2.1 194±7.8 2 232±3.1 210±8.0 3 234±5.2 246±6.5

3 討論

本實(shí)驗(yàn)室合成了葛根素人工抗原,篩選出能穩(wěn)定分泌抗葛根素的特異性雜交瘤細(xì)胞系,制備出抗葛根素的單克隆抗體,檢測(cè)抗體效價(jià)大于128 000,檢測(cè)靈敏度為89.50 ng/mL,且對(duì)結(jié)構(gòu)類(lèi)似黃酮類(lèi)化合物顯示極低的交叉反應(yīng)(＜0.01%)(另文發(fā)表)。在此基礎(chǔ)上,本研究建立了葛根素ic-ELISA方法。

Ic-ELISA方法的建立會(huì)受到很多因素的影響,除了單克隆抗體的質(zhì)量因素外,還包括包被原的工作濃度、封閉液種類(lèi)、單抗的工作濃度等。按照常規(guī)ic-ELISA法測(cè)定,本實(shí)驗(yàn)最終確定:包被原最佳工作濃度為1∶4000,封閉液為10%馬血清,葛根素單抗最佳工作濃度為1∶8000。

Ic-ELISA法逐漸應(yīng)用于中藥現(xiàn)代化的化學(xué)成分檢測(cè)與質(zhì)量控制評(píng)估領(lǐng)域,成為儀器分析技術(shù)的補(bǔ)充。目前,對(duì)于葛根素的含量測(cè)定主要采用高效液相色譜法、薄層色譜法、毛細(xì)管電泳法等,其中高效液相色譜法最為常用。但是上述方法或樣品前處理過(guò)程復(fù)雜,或儀器昂貴、檢測(cè)成本高,或?qū)Σ僮魅藛T實(shí)驗(yàn)技能要求較高。Ic-ELISA法的優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在:(1)與常規(guī)理化分析技術(shù)相比,具有特異型強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn),甚至可檢測(cè)到飛摩爾或亞飛摩爾低濃度水平;(2)方便快捷,取樣量少,前處理簡(jiǎn)單,儀器化程度低,分析效率約為HPLC或GC的幾十倍。

本實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確測(cè)定了葛根中葛根素的含量,因此利用此技術(shù)的準(zhǔn)確性以及靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),可分析中藥復(fù)方中葛根素在血液、器官及組織樣品中的含量分析;甚至可以制成葛根素膠體金試紙條、試劑盒等,從而為中藥質(zhì)量控制以及中藥作用機(jī)制的闡明奠定基礎(chǔ)。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010.

[2] 陳文杰.葛根研究進(jìn)展[J].中國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育, 2009,7(1):6-8.

[3] 宋卉,李銀花,鄭暉,等.葛根素的藥理作用與臨床研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2011,27(19):2936-2937.

[4] 姚丹,丁選勝.葛根素藥理作用機(jī)制探討及臨床應(yīng)用[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2008,13(4):468-474.

[5] 白東義,佟春玲,韓慧,等.葛根素的藥理作用及其臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].江蘇中醫(yī)藥,2009,41(3):76-78.

[6] 王淑美,馮素香,梁生旺,等.腦脈通有效部位中葛根素的含量測(cè)定[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2007,30(2):121-123.

[7] 任亞?wèn)|,朱艷林.不同產(chǎn)地葛根中總黃酮和葛根素的含量測(cè)定[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2008,10(5):160-161.

[8] 畢何鋒,張婕,蔣東旭,等.HPLC法測(cè)定柴葛解肌湯中葛根素的含量[J].中國(guó)藥師,2014,17(1):161-162.

[9] 蘇歆,屈會(huì)化,趙琰,等.基于黃芩苷單克隆抗體的ELISA快速檢測(cè)方法的建立[J].藥物分析雜志,2013,33(6): 946-949.

[10] 張?jiān)?屈會(huì)化,吳婷婷,等.甘草酸單克隆抗體的制備與鑒定[J].藥物分析雜志,2013,33(5):770-774.

[11] ZHAO Y,KONG H,SUN Y,et al.Assessment of baicalin in mouse blood by monoclonal antibody-based icELISA[J]. Biomedical Chromatography,2014,28(12):1864-1868.

[12] 徐金森.芍藥苷單克隆抗體的特異性檢測(cè)[J].廈門(mén)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2008,47(22):45-48.

[13] TANAKA H,PUTALUN W,D-EKNAMKUL W,et al. Preparation of a Novel Monoclonal Antibody againstthe Antimalarial Drugs,Artemisinin and Artesunate[J].Planta Med,2007,73(10):1127-1132.

[14] ZHU S,SHIMOKAWA S,SHOYAMA Y,et al.A novel analytical ELISA-based methodology for pharmacologically active saikosaponins[J].Fitoterapia,2006,77(2):100-108.

[15] 屈會(huì)化,趙琰,王慶國(guó).基于中藥活性小分子單克隆抗體的復(fù)方配伍機(jī)理研究新思路[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志,2012,32 (10):1416-1419.

[16] QU HH,ZHANG GL,LIYF,et al.Development of an enzymelinked immunosorbent assay based on anti-puerarin monoclonal antibody and its applications[J].Journal of Chromatography B, 2014,953(5):120-125.

[17] 屈會(huì)化,張桂亮,趙琰,等.梔子苷人工抗原的合成與鑒定[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2013,36(6):387-392.

[18] 公衍玲,黃山,于慧榮.葛根提取方法的比較研究及其工藝條件優(yōu)化[J].青島科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2009,30(5): 415-417.

Content determ ination of puerarin in puerariae lobatae radix by ic-ELISA

SHANWen-chao,FENGHui-bin,ZHAO Yan,et al. The School of Chinese Medicine,Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102,China

QU Hui-hua,E-mail:quhuihua@gmail.com

Objective To detect the content of puerarin in puerariae lobatae radix by ic-ELISA. Methods Anti-Puerarin monoclonal antibodieswere used to establish ic-ELISAmethod for puerarin by investigating the linear relationship,the precision and the recovery.Results The linear range of thismethod was 15.6 ng/mL～500 ng/mL,the coefficients of variation for the intra-assay and the inter-assay are both less than 3.5%and the average recovery was 101.8%.The detection result of ic-ELISA method was consistentwith that of HPLC test.Conclusions The ic-ELISA method can be applied to the quality control of puerariae lobatae radix and the content determination of puerarin in Chinese herbal formula.

ic-ELISA; Puerarin; Puerariae lobatae radix; Content determination

R284.1

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.09.014

2014-11-27)

(本文編輯:蒲曉田)

國(guó)家自然科學(xué)基金(81274043)

100102 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院[單文超(碩士研究生)、馮會(huì)賓(碩士研究生)、曾文浩(碩士研究生)、賀娜娜(碩士研究生)],基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院[趙琰、趙妍(博士研究生)、孫曄(博士研究生)],科研實(shí)驗(yàn)中心(屈會(huì)化)

單文超(1990-),女,2013級(jí)在讀碩士研究生。研究方向:中藥化學(xué)。E-mail:shan0913bj@163.com

屈會(huì)化(1966-),博士,副研究員。研究方向:中藥免疫分析。E-mail:quhuihua@gmail.com