孟剛，魏愛英，賈慧萍，馬風(fēng)勇，楊立鵬，李小剛

（寧夏伊品生物科技股份有限公司，寧夏銀川 750100）

大腸桿菌tdcD基因缺失株的構(gòu)建及其用于耐高糖L-色氨酸發(fā)酵的研究

孟剛，魏愛英，賈慧萍，馬風(fēng)勇，楊立鵬，李小剛

（寧夏伊品生物科技股份有限公司，寧夏銀川 750100）

發(fā)酵過程中產(chǎn)生的過量乙酸會(huì)嚴(yán)重影響色氨酸發(fā)酵的效率，通常采用嚴(yán)格控制發(fā)酵液中葡萄糖濃度來(lái)減少發(fā)酵過程中乙酸的積累。通過敲除乙酸代謝途徑中具有乙酸激酶活性的丙酸激酶編碼基因（tdcD）控制乙酸溢流，并分別研究在“微糖”及“高糖”控制條件下乙酸含量的變化及其對(duì)發(fā)酵的影響。結(jié)果顯示，在“高糖”控制條件下tdcD缺失菌株在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期保持較高的生長(zhǎng)速率和產(chǎn)酸效率，色氨酸產(chǎn)量最高為48.85 g/L，比對(duì)照菌提高了54.88%；而產(chǎn)生的乙酸為2.79 g/L，比對(duì)照菌降低了64.72%。tdcD缺失菌可以適應(yīng)更靈活的殘?zhí)强刂品秶?/p>

Red重組技術(shù)；tdcD基因；乙酸；微糖；高糖

在大腸桿菌色氨酸發(fā)酵過程中，如果發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛冗^高，會(huì)產(chǎn)生“反巴斯德效應(yīng)”，乙酰輔酶A積累，副產(chǎn)物開始生成，嚴(yán)重時(shí)15%～30%的糖會(huì)形成乙酸[1]，即出現(xiàn)所謂的“乙酸溢流”現(xiàn)象，并引起一系列的問題：如抑制菌體生長(zhǎng)[2]、抑制蛋白合成[3]、發(fā)酵過程pH控制難[4]等。因此，在大腸桿菌色氨酸發(fā)酵生產(chǎn)過程中，控制乙酸的形成是非常重要的。

在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)色氨酸過程中，為了控制發(fā)酵液中乙酸的含量，通常采用嚴(yán)格控制發(fā)酵液中殘余葡萄糖濃度的工藝，即“微”糖控制（控制在2 g/L以下）。但是這并不能從根本上解決問題，同時(shí)還增加了發(fā)酵過程控制的復(fù)雜性，降低了發(fā)酵的穩(wěn)定性。為了克服“乙酸溢流”造成的目標(biāo)產(chǎn)物合成障礙，對(duì)大腸桿菌乙酸代謝通路進(jìn)行干預(yù)，削弱乙酸的生物合成，減少乙酸對(duì)發(fā)酵造成的負(fù)面影響，使色氨酸發(fā)酵脫離“微”糖控制的制約，從而提高色氨酸發(fā)酵過程的穩(wěn)定性，降低控制的復(fù)雜性。

好氧條件下大腸桿菌產(chǎn)生乙酸的主要途徑是Pta-Ack途徑，即在磷酸轉(zhuǎn)乙?；负鸵宜峒っ傅淖饔孟聦⒁阴］o酶A轉(zhuǎn)化為乙酸，其中由pta基因編碼磷酸轉(zhuǎn)乙?；福宜峒っ傅木幋a基因有兩個(gè)：ackA基因和tdcD基因，這兩個(gè)基因?yàn)橥椿颍▓D1）。本文以E.coli YPTRP01為出發(fā)菌，利用Red重組技術(shù)敲除tdcD基因編碼區(qū)，構(gòu)建得到tdcD基因缺失菌株E.coli YPTRP01△tdcD，并比較研究了在不同殘?zhí)菨舛葪l件下tdcD缺失菌株及出發(fā)菌在菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)酸以及乙酸合成方面的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

色氨酸生產(chǎn)菌E.coli YPTRP01由寧夏伊品生物科技股份有限公司菌種中心提供；E.coli DH5，購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；質(zhì)粒pMD19-T vector購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；pKD46、pKD3、pcp20購(gòu)自Biovector。

1.1.2 引物

pKD3含有氯霉素抗性基因，且在抗性基因兩側(cè)有FRT位點(diǎn)，在Red重組系統(tǒng)中作為抗性標(biāo)記使用；根據(jù)NCBI提供的E.coli K-12 W3110基因序列信息，設(shè)計(jì)含有56 bp同源臂的一對(duì)引物P1、P2（劃線部分為同源臂），用于從質(zhì)粒pKD3 上PCR擴(kuò)增出含有氯霉素抗性及FRT位點(diǎn)的基因片段；在大腸桿菌染色體tdcD基因同源重組區(qū)域外側(cè)，設(shè)計(jì)引物P3、P4，用于檢測(cè)重組菌株。

1.1.3 主要試劑

Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、2 kb marker購(gòu)于大連寶生物工程有限公司；PCR引物由上海英俊生物工程有限公司合成；L-阿拉伯糖、IPTG、X-gal、溶菌酶、氨芐青霉素、氯霉素、四環(huán)素購(gòu)于北京索萊寶公司；DNA片段回收試劑盒、基因組DNA的提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)于北京天根生物科技有限公司；蛋白胨、酵母粉為Oxoid公司產(chǎn)品。

1.1.4 培養(yǎng)基及發(fā)酵控制條件

種子培養(yǎng)基（g/L）：K2HPO424，KH2PO49.6，（NH4）2SO45，MgSO41，酵母粉15.2，葡萄糖10，pH 7.0，121°C滅菌20 min。葡萄糖和其他成分滅菌后再混合。

固體培養(yǎng)基：種子培養(yǎng)基+1.5%瓊脂。

5 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：酵母粉1.5，檸檬酸2，葡萄糖10，MgSO42，（NH4）2SO41，KCl 5，（NH4）2HPO43，微量元素混合液1 mL，pH 7.0，121°C滅菌20 min。

發(fā)酵控制條件：溫度35°C，pH 7.0，罐壓0.03 MPa，控制補(bǔ)糖閥門的開度使溶氧保持在20%～30%之間，發(fā)酵周期36 h。

1.2 方法

1.2.1 葡萄糖測(cè)定方法

葡萄糖濃度采用SBA-40C葡萄糖生物傳感儀（山東省科學(xué)院生物研究所）分析。

1.2.2 發(fā)酵液樣品預(yù)處理

用體積分?jǐn)?shù)為5%的濃硫酸將發(fā)酵液樣品酸化，釋放由Ca（OH）2中和的有機(jī)酸，離心去除Ca-SO4沉淀后用等體積100 g/L的三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后用于高效液相色譜分析。

1.2.3 有機(jī)酸測(cè)定方法

有機(jī)酸含量用高效液相色譜進(jìn)行分析，檢測(cè)器為UV（210 nm）檢測(cè)器，色譜柱為SH1011 （Shodex），流動(dòng)相為0.01 mol/L H2SO4，流速為0.6 mL/min，柱溫50°C。

1.2.4 色氨酸含量檢測(cè)

色氨酸檢測(cè)方法見參考文獻(xiàn)[5]。

2 結(jié)果

2.1 大腸桿菌YPTRP01 tdcD基因缺失株的構(gòu)建

質(zhì)粒pKD3含有氯霉素抗性基因，且在抗性基因兩側(cè)有反轉(zhuǎn)酶結(jié)合位點(diǎn)（FRT），常在Red重組系統(tǒng)中作為抗性標(biāo)記使用。根據(jù)大腸桿菌W3100基因組中tdcD基因序列信息，設(shè)計(jì)含有56 bp同源臂的引物P1和P2，以質(zhì)粒pKD3為模板，PCR擴(kuò)增氯霉素抗性基因片段。將擴(kuò)增出的上游同源臂-氯霉素抗性基因-下游同源臂的片段電擊轉(zhuǎn)化含有輔助質(zhì)粒pKD46并經(jīng)2 mmol/L L-阿拉伯糖誘導(dǎo)的E.coli YPTRP01感受態(tài)細(xì)胞，37°C復(fù)蘇1～2 h，涂布于氯霉素抗性平板，使用鑒定引物P3、P4對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR，篩選獲得陽(yáng)性重組子E.coli YPTRP01（tdcD::cm），tdcD基因的長(zhǎng)度為1589 bp，而氯霉素抗性基因的長(zhǎng)度為1347 bp，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖2），兩片段長(zhǎng)度與預(yù)計(jì)相符，說明重組菌株染色體上的tdcD基因已經(jīng)被氯霉素基因替代。

質(zhì)粒pCP20含有溫度敏感型的復(fù)制起點(diǎn)，同時(shí)含有一個(gè)反轉(zhuǎn)重組酶（Flippase recombination enzyme，F(xiàn)LP）基因，F(xiàn)LP重組酶可以與FRT位點(diǎn)結(jié)合，使FRT位點(diǎn)自身發(fā)生同源重組，從而消除一個(gè)FRT位點(diǎn)及抗性基因。將質(zhì)粒pCP20電轉(zhuǎn)入含氯霉素抗性的重組子，37°C復(fù)蘇1～2 h，涂布于氨芐青霉素抗性平板上，使用鑒定引物P3、P4對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR，將篩選到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種于LB培養(yǎng)基中，42°C過夜培養(yǎng)，經(jīng)劃線分離，對(duì)每個(gè)單菌落進(jìn)行無(wú)抗及氯霉素的抗性檢測(cè)，挑選對(duì)氯霉素不生長(zhǎng)且在無(wú)抗平板上生長(zhǎng)的單克隆，得到消除質(zhì)粒pCP20的重組菌株E.coli YPTRP01△tdcD。結(jié)果表明，在463 bp處有目的條帶，如圖2所示。

將重組子E.coli YPTRP01△tdcD使用鑒定引物P3、P4擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物經(jīng)上海英俊公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAMAN軟件進(jìn)行序列對(duì)比，與理論一致，這表明已經(jīng)成功獲得E.coli YPTRP01△tdcD缺失株。

圖2 tdcD基因敲除轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定電泳圖

2.2 “微糖”控制條件下tdcD敲除對(duì)色氨酸發(fā)酵的影響

在5 L自動(dòng)控制發(fā)酵罐上進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵，發(fā)酵初始培養(yǎng)基1.5 L，接種量13%，采用補(bǔ)料分批發(fā)酵（補(bǔ)加60%葡萄糖，用氨水調(diào)pH）的方式進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度35°C，pH維持在7.0，殘?zhí)强刂圃?～2 g/L，溶解氧控制在20%～30%，發(fā)酵周期36 h。每隔2 h測(cè)定OD660、殘?zhí)呛?、L-色氨酸產(chǎn)量、乙酸含量，結(jié)果如圖3、4所示。

由圖3、4可知，在“微糖”控制發(fā)酵過程中，E.coli YPTRP01及其tdcD缺失株在整個(gè)生長(zhǎng)周期沒有明顯差異，均在6 h左右進(jìn)入生長(zhǎng)指數(shù)期，在24 h進(jìn)入穩(wěn)定期，30 h后開始衰老。整個(gè)過程的產(chǎn)酸確有差異，特別是進(jìn)入穩(wěn)定期后，E.coli YPTRP01△tdcD菌株的色氨酸增加量明顯高于出發(fā)菌株，最高可達(dá)48.98 g/L，比對(duì)照菌株高15%左右。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，通常乙酸含量在2 g/L以下不會(huì)影響細(xì)胞的正常代謝，但若高于5 g/L，就會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)。雖然在整個(gè)發(fā)酵過程中盡量控制殘?zhí)菨舛鹊陀? g/L，但是在發(fā)酵后期通常殘?zhí)菨舛群茈y控制在這個(gè)水平以下，乙酸會(huì)逐步加快積累。由測(cè)定結(jié)果可知，E.coli YPTRP01在發(fā)酵過程中不斷積累乙酸，在36 h達(dá)到最大4.89 g/ L，而采用tdcD敲除菌的發(fā)酵過程中，乙酸雖然有所積累，但增長(zhǎng)速度明顯減慢，且最終含量為2.01 g/L，比對(duì)照菌株降低了58%以上。發(fā)酵液中乙酸含量的降低除了可以減少對(duì)微生物細(xì)胞的破壞外，還有利于降低碳流的損失，增加色氨酸合成的碳源利用率。

圖3 YPTRP01及tdcD缺失菌在微糖控制條件下OD及色氨酸含量曲線

圖4 YPTRP01及tdcD缺失菌在微糖控制條件下殘?zhí)羌耙宜岷壳€

2.3 “高糖”控制條件下tdcD敲除對(duì)色氨酸發(fā)酵的影響

所謂“微糖”是指殘?zhí)呛吭? g/L以下，且發(fā)酵是可以正常運(yùn)行的，但是當(dāng)殘?zhí)呛扛哂? g/L時(shí)，發(fā)酵液容易出現(xiàn)發(fā)臭發(fā)黑的現(xiàn)象，導(dǎo)致發(fā)酵無(wú)法進(jìn)行。而所謂“高糖”是指在殘?zhí)呛窟_(dá)到5 g/L時(shí)發(fā)酵還可以正常運(yùn)行。具體發(fā)酵條件：在5 L自動(dòng)控制發(fā)酵罐上進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵，發(fā)酵初始培養(yǎng)基1.5 L，接種量13%，采用補(bǔ)料分批發(fā)酵（補(bǔ)加60%葡萄糖，用氨水調(diào)pH）的方式進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度35°C，pH維持在7.0，殘?zhí)强刂圃? g/L左右，溶解氧控制在20%～30%，發(fā)酵周期36 h。每隔2 h測(cè)定OD660、殘?zhí)呛?、L-色氨酸產(chǎn)量、乙酸含量，結(jié)果如圖5、6所示。

圖5 YPTRP01及tdcD缺失菌在高糖控制條件下OD及色氨酸含量曲線

圖6 YPTRP01及tdcD缺失菌在高糖控制條件下殘?zhí)羌耙宜岷壳€

由圖5、6可知，在“高糖”控制發(fā)酵過程中，E.coli YPTRP01及其tdcD缺失株在生長(zhǎng)前期沒有明顯差異，但是在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期差距明顯。E.coli YPTRP01△tdcD菌株增長(zhǎng)較快，產(chǎn)酸水平更高，發(fā)酵液顏色正常；而E.coli YPTRP01菌株在指數(shù)后期生長(zhǎng)緩慢，進(jìn)入穩(wěn)定期后OD偏低，同時(shí)產(chǎn)酸量增長(zhǎng)慢，放罐時(shí)色氨酸含量為31.5 g/L，乙酸含量高達(dá)7.93 g/L，且出現(xiàn)發(fā)酵液發(fā)黑發(fā)臭現(xiàn)象，發(fā)酵無(wú)法繼續(xù)。相比較而言，E.coli YPTRP01△tdcD菌株在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期保持較高的生長(zhǎng)速率和產(chǎn)酸效率，色氨酸含量最高為48.85 g/L，比對(duì)照菌株提高了42.23%，而乙酸含量最高為2.79 g/L，比對(duì)照菌株降低了62.48%。E.coli YPTRP01在發(fā)酵過程中出現(xiàn)發(fā)酵液發(fā)黑的現(xiàn)象，很可能是因?yàn)樵凇案咛恰笨刂茥l件下乙酸大量積累造成的，E.coli YPTRP01在放罐時(shí)乙酸含量接近8 g/L，已經(jīng)超過文獻(xiàn)報(bào)道的閾值，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)生顯著影響。

由上述結(jié)果可知，在不同的糖濃度控制條件下，E.coli YPTRP01△tdcD菌株的產(chǎn)酸及發(fā)酵過程中乙酸的積累量沒有明顯差異，且均要優(yōu)于對(duì)照菌株。這也說明tdcD基因的敲除確實(shí)顯著減弱了乙酸的積累，同時(shí)也使得發(fā)酵過程中所要求的殘?zhí)强刂品秶兴鶖U(kuò)大，降低了發(fā)酵控制的復(fù)雜性，增強(qiáng)了發(fā)酵的穩(wěn)定性。

3 討論

大腸桿菌產(chǎn)生乙酸的途徑主要有兩條：一是通過PoxB途徑由丙酮酸氧化酶直接作用丙酮酸產(chǎn)生乙酸，這主要發(fā)生在厭氧培養(yǎng)時(shí)；另一條是Pta-Ack途徑，在磷酸轉(zhuǎn)乙?；负鸵宜峒っ傅淖饔孟聦⒁阴oA轉(zhuǎn)化為乙酸，主要發(fā)生在好氧培養(yǎng)條件下，這也是大腸桿菌色氨酸發(fā)酵中產(chǎn)生乙酸的主要途徑。該途徑中有兩個(gè)基因編碼乙酸激酶：ackA、tdcD。采用大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)色氨酸的過程中，殘?zhí)呛康目刂剖前l(fā)酵過程控制的關(guān)鍵因素，如果殘?zhí)呛窟^高，會(huì)導(dǎo)致代謝流量發(fā)生遷移，大約15%～30%的糖會(huì)轉(zhuǎn)化形成乙酸，出現(xiàn)所謂的“乙酸溢流”現(xiàn)象。乙酸的積累量過高會(huì)影響整個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)及發(fā)酵性能，從而導(dǎo)致發(fā)酵過程難以控制。雖然過高的乙酸對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝具有抑制作用，但是乙酸作為一種中間代謝產(chǎn)物保持適量的存在對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)，其他物質(zhì)的代謝及一些酶的作用也是必不可少的，因此，也不宜將乙酸代謝途徑完全敲除。有文章報(bào)道[6]對(duì)乙酸代謝途徑中的pta基因進(jìn)行敲除同樣可以達(dá)到減少乙酸含量的目的，但是從代謝途徑上分析是阻斷了乙酸合成的代謝通路，使乙酸的合成量大量減少。本研究通過敲除大腸桿菌乙酸合作途徑中的關(guān)鍵基因之一（tdcD），弱化乙酸合成代謝途徑，減少乙酸生成的代謝流量來(lái)控制乙酸的生物合成，從而減少乙酸的積累量，使得乙酸在較寬的殘?zhí)强刂品秶鷥?nèi)仍能保持適量的存在，而不對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及目標(biāo)產(chǎn)物的生物合成產(chǎn)生不利的影響。

隨著基因工程、代謝工程及反應(yīng)器工程等學(xué)科的更新和發(fā)展，現(xiàn)代發(fā)酵工程已越來(lái)越強(qiáng)調(diào)多尺度研究的視角和策略。大腸桿菌的色氨酸發(fā)酵相較于谷氨酸、賴氨酸、蘇氨酸等產(chǎn)品的發(fā)酵而言更具難度，若要進(jìn)一步提高色氨酸發(fā)酵的效率和水平，迫切需要在基因尺度、細(xì)胞尺度、環(huán)境（或反應(yīng)器）尺度上多維度綜合研究，提出改進(jìn)策略和思路。殘?zhí)菨舛茸鳛橐环N環(huán)境參數(shù)，它的變化直接導(dǎo)致了基因水平上的異動(dòng)（乙酸溢流加強(qiáng)或減弱），進(jìn)而在細(xì)胞水平上影響細(xì)胞工廠的整體運(yùn)作，這些都可以通過發(fā)酵指標(biāo)的變化和發(fā)酵液顏色的改變獲得直觀的信息。也就是說，每一個(gè)維度的參數(shù)或信息都與另一維度有著千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系，各維度之間必須協(xié)調(diào)統(tǒng)一才能實(shí)現(xiàn)發(fā)酵控制的優(yōu)化，獲得最優(yōu)的發(fā)酵表現(xiàn)。本研究基于多尺度研究的改造理念和思路，通過基因水平的操作，使細(xì)胞代謝特性與環(huán)境尺度參數(shù)的變化相適應(yīng)，通過各維度參數(shù)的協(xié)調(diào)統(tǒng)一來(lái)實(shí)現(xiàn)色氨酸發(fā)酵水平和質(zhì)量的提升。本研究是多尺度發(fā)酵調(diào)控及菌種改造策略的一次嘗試，也為色氨酸發(fā)酵的進(jìn)一步優(yōu)化和提升積累了有益的經(jīng)驗(yàn)。

[1]DOELLE H W,EWINGS K N,HOLLYWOOD N W.Regulation of glucose metabolism in bacterial systems[M]//Microbial Reactions.Springer Berlin Heidelberg,1982:1-35.

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[3]JENSEN E B,CARLSEN S.Production of recombinant human growth hormone in Escherichia coli:expression of different precursors and physiological effects of glucose,acetate,and salts[J]. Biotechnology and Bioengineering,1990,36（1）:1-11.

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[5]黎景麗，文一彪.對(duì)氨基酸測(cè)定的研究（上）[J].中國(guó)調(diào)味品，2002（12）:34-37.

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（責(zé)任編輯：朱小惠）

Construction of a tdcD gene deletion strain of Escherichia coli and the study of its application in L-tryptophan fermentation process with high glucose tolerance

MENG Gang,WEI Aiying,JIA Huiping,MA Fengyong,YANG Lipeng,LI Xiaogang （Ningxia EPPEN Biotech Co.,Ltd.,Yinchuan 750100,China）

Excessive acetic acid is harmful to tryptophan fermentation,and thus the level of acetic acid is normally restricted through the regulation of glucose content in the broth.In this study,the tdcD gene in Escherichia coli was knocked out in order to reduce the accumulation of acetic acid during tryptophan fermentation.The acetic acid content variation was investigated under various glucose levels.It showed that under high glucose content,the tdcD deletion strain YPTRP01 had a higher growth rate and exhibited increased tryptophan production in late exponential phase.The tryptophan yield was increased by 54.88%to 48.85g/L and the acetic acid level was reduced by 62.8%to 2.79g/L.In conclusion,the tdcD mutant showed more flexibility in the control of glucose contents during the tryptophan fermentation.

Red recombination;tdcD gene;acetic acid;glucose content

TQ922.9

A

1674-2214（2015）02-0012-05

2015-01-09

孟剛（1976—），男，遼寧遼陽(yáng)人，碩士，研究方向?yàn)槲⑸镉N，E-mail:pufeel@163.com.