黃繼紅，張龍飛，王文

（1.河南工業(yè)大學生物工程學院，河南 鄭州 450001；2.河南省食品工業(yè)科學研究所，河南 鄭州 450003）

右旋糖苷修飾胰蛋白酶條件優(yōu)化及性質研究

黃繼紅1，2，張龍飛1，王文1

（1.河南工業(yè)大學生物工程學院，河南 鄭州 450001；2.河南省食品工業(yè)科學研究所，河南 鄭州 450003）

由于天然酶其異源蛋白的抗原性、易受蛋白酶水解、酶活性較低、穩(wěn)定性差等原因，嚴重影響胰蛋白酶的應用范圍和效果。為了獲取理化性質更穩(wěn)定的胰蛋白酶，研究了右旋糖苷修飾胰蛋白酶的反應條件和胰蛋白酶修飾前后的酶學性質。結果表明右旋糖苷修飾胰蛋白酶的最優(yōu)反應條件為：右旋糖苷與胰蛋白酶的摩爾比為1∶2，修飾反應最適pH為8.0，最適反應溫度為35℃，最佳修飾時間為4 h，胰蛋白酶保留酶活力56.1%，修飾率為49.2%。修飾后的胰蛋白酶適合溫度、pH值范圍變大，熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性明顯的提高。因而右旋糖苷修飾胰蛋白酶能夠增強胰蛋白酶的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性，為胰蛋白酶的修飾提供理論參考并擴展蛋白酶的工業(yè)應用價值。

胰蛋白酶；右旋糖苷；化學修飾；酶學性質

胰蛋白酶（EC 3.4.21.4）是絲氨酸蛋白水解酶類中的一種重要類型。在眾多蛋白質水解酶中，胰蛋白酶的應用十分廣泛，需求量十分大，年消耗量就占到了酶制品市場的3%左右，被廣泛應用于食品業(yè)、醫(yī)藥業(yè)、紡織業(yè)和現(xiàn)代生物技術等領域［1-2］。但由于天然酶其異源蛋白的抗原性、易受蛋白酶水解、酶活性較低、穩(wěn)定性差等原因，嚴重影響胰蛋白酶的應用范圍和效果。通過化學修飾技術可以對酶分子的結構進行改造，彌補自然酶的不足，使酶發(fā)揮出更高的催化效能，以滿足工業(yè)中對酶的各種需求。通過對酶蛋白分子主鏈或側鏈上的基團進行改造，引入或除去某些化學基團，使酶蛋白的結構發(fā)生變化，以此改善酶的性質。目前應用最廣泛的酶化學修飾技術就是大分子結合修飾技術，可獲得具有工業(yè)應用價值的酶［3］。多糖類大分子在酶化學修飾中的應用十分廣泛，常見的大分子修飾劑有右旋糖苷、蔗糖、肝素、環(huán)糊精及其衍生物［4］。蛋白酶的穩(wěn)定性主要依賴于疏水相互作用以及熱力學原理，在酶分子中引入多個共價鍵可強化蛋白質的構象，通過大分子遮蔽減少酶分子表面非極性基團增加其穩(wěn)定性［5-6］，多糖類大分子修飾劑最常用的活化方法是高碘酸鈉氧化法［7-12］。用化學修飾技術增強酶的耐受性，改善酶的催化效能已成為國際上一個重要的研究熱點［13］。國內在胰蛋白酶的固定技術和大分子修飾等方面做的研究比較多，尤其是隨著新型材料的開發(fā)，這些研究技術也會越來越完善［14］。因此，進一步探索對提高工業(yè)生產用酶催化效能的化學修飾技術有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

北京北分瑞利分析儀器；冷凍干燥機（FD—1），北京博醫(yī)康實驗儀器；可見分光光度計(723N)，上海精密科學儀器有限公司；胰蛋白酶（250 U/mg），北京鼎國昌盛生物；右旋糖苷（Aw 40000），Aladdin Industrial Corporation；酪蛋白（生物試劑），上?；瘜W試劑；高碘酸鈉、亞硫酸氫鈉、鹽酸羥胺、硼酸、L-賴氨酸等均為分析純試劑。

1.2 實驗方法

右旋糖苷的活化：稱取右旋糖苷及等摩爾（相對于右旋糖苷分子上的小分子葡萄糖單位）的高碘酸鈉適量，用蒸餾水溶解，避光，42℃水浴加熱，振蕩至黃色液體生成，滴加5%的NaHSO3溶液還原溶液中過量的NaIO4，繼續(xù)震蕩10 min，以純化水為介質，以截留分子量為8 000～14 000的透析袋4℃透析4 h，得活化右旋糖酐溶液。

活化右旋糖苷化學修飾胰蛋白酶：在5.0 mg/ mL的酶液（用硼酸或磷酸緩沖液配制）中加入一定量活化的右旋糖苷，同時按質量濃度1 mg/L加入酪蛋白底物，在一定的條件下進行修飾反應，然后滴加1.0 mL NaBH4（50mg/mL）終止反應，水透析4 h，冷凍干燥既得修飾的胰蛋白酶。

活化右旋糖苷的醛基含量測定：精密稱取一定量的活化右旋糖苷，加入并溶解于25mL 0.25 mol/L的鹽酸羥胺溶液中（含甲基橙0.05%），室溫下放置3 h，以標準氫氧化鈉溶液（0.1mol/L）滴定，直至紅色變?yōu)辄S色，并作空白校正。一分子活化右旋糖苷含醛基的數(shù)量即為1 mol活化右旋糖苷含有的醛基摩爾數(shù)，公式為：

醛基數(shù)=(V1-V0)×N×M w/1 000W

式中：V1為樣品液消耗氫氧化鈉液的體積（L）；V0為空白液消耗氫氧化鈉液的體積（L）；N為氫氧化鈉的摩爾濃度；M w為葡聚糖鏈上葡萄糖單位的重量（160）；W為葡聚糖的質量（g）。

胰蛋白酶修飾酶的酶活測定及修飾率的測定：

1）酶活的測定：設置溫度為37℃，取2 mL酶液，加入5 mL 2%酪蛋白溶液，反應15 min后加入2mL 10%三氯乙酸溶液終止水解反應，靜置10min后離心，取上清液稀釋，測量280 nm處的吸光度。將每分鐘催化酪蛋白水解生成1μg酪氨酸的量定義為一個活力單位［16］。修飾酶的殘留酶活力：以未修飾自然酶的酶活力為100%，計算各修飾酶的殘留酶活力（100%）。

殘留酶活=修飾酶酶活/自然酶酶活×100%

2）修飾酶修飾率的測定：采用2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）法測定胰蛋白酶的氨基修飾率。2，4，6-三硝基苯磺酸能夠與胰蛋白酶表面的賴氨酸ε-氨基發(fā)生反應。該反應生成的三硝基苯衍生物在420 nm有特征吸收峰，通過該反應可以計算出胰蛋白酶的自由氨基數(shù)目?？瞻捉M：取2.0 mL TNBS至3.0 mL雙蒸水中，混合均勻后，室溫放置40min，再加入1 mol/L的鹽酸0.5mL；自然酶組：取2.0 mL TNBS至3.0 mL自然酶中，混合均勻后，室溫放置40 min，再加入1mol/L的鹽酸0.5 mL終止反應，420 nm處測定吸光度值A0；修飾酶組：取2.0 mL TNBS至3.0mL修飾酶中，混合均勻后，室溫放置40 min，再加入1 mol/L的鹽酸0.5mL終止反應，420 nm處測定吸光度值A1修飾率=(A0-A1)/A0×100%

右旋糖苷對胰蛋白酶修飾條件的優(yōu)化：

1）修飾劑與胰蛋白酶的摩爾比例：在37℃、pH 7.0的條件下，按照3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4的摩爾比例加入胰蛋白酶和活化右旋糖苷，同時按質量濃度為1mg/L的標準加入酪蛋白底物，反應3 h，然后滴加1.0 m L NaBH4（50 mg/mL）終止反應，水透析4 h，測定胰蛋白酶殘留酶活和氨基修飾率。

2）pH值對修飾結果的影響：在37℃、pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的條件下，按照上述實驗所得的最優(yōu)比例加入胰蛋白酶和活化右旋糖苷，同時按質量濃度為1mg/L加入酪蛋白底物，反應3 h，然后滴加1.0mLNaBH4（50mg/mL）終止反應，水透析4 h，測定并計算不同pH條件反應下的胰蛋白酶殘留酶活和氨基修飾率。

3）修飾溫度對修飾結果的影響：按照1）和2）所得的最佳修飾反應條件設置反應pH和加入胰蛋白酶與活化右旋糖苷，設置反應溫度分別為25、30、35、40、45、50℃，同時按質量濃度為1mg/L加入酪蛋白底物，修飾3 h，然后滴加1.0mLNaBH4（50 mg/mL）終止反應，水透析4 h，測定并計算各溫度條件下的胰蛋白酶殘留酶活和氨基修飾率。

4）修飾時間對修飾結果的影響：平行取六組胰蛋白酶和活化右旋糖苷，按照實驗1）、2）和3）所得的最佳修飾反應條件設置胰蛋白酶與活化右旋糖苷的比例、反應pH、溫度，同時按質量濃度1 mg/L加入酪蛋白底物，反應時間分別為1、2、3、4、5、6 h，然后滴加1.0 mLNaBH4（50mg/mL）終止反應，水透析4 h，測定并計算各時間段胰蛋白酶的殘留酶活和氨基修飾率。

1.3 胰蛋白酶修飾前后的性質研究

1）胰蛋白酶修飾前后最適反應溫度的測定比較：設置22、26、30、34、38、42、46、50℃8個溫度梯度，在各溫度下將底物酪蛋白溶液保溫5min后，分別加入胰蛋白酶與修飾酶（酶液pH為8.0），反應15 min，TCA沉淀未水解蛋白，然后在650 nm下測吸光度。定義各自最高的胰蛋白酶活力為100%，計算出不同溫度條件下各自胰蛋白酶的相對活性，即剩余酶活占最高酶活力的百分比。

2）胰蛋白酶修飾前后最適pH范圍的測定比較：設置6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10共8個pH梯度，取天然酶和修飾酶，以酪蛋白為底物，最適溫度下，反應15min，TCA沉淀未水解蛋白，然后在650 nm下測吸光度。定義各自最高的酶活力為100%，計算出不同pH條件下各自胰蛋白酶的相對活性，即酶活占最高酶活力的百分比。

3）胰蛋白酶修飾前后熱穩(wěn)定性的比較：取適量胰蛋白酶天然酶和修飾酶，在80℃保溫，取不同保溫時間的胰蛋白酶，以酪蛋白為底物測定其胰蛋白酶活性。定義各自最初的酶活力為100%，計算不同保溫時間的胰蛋白酶的相對活性，即酶活占最高酶活力的百分比。

4）胰蛋白酶修飾前后酸堿穩(wěn)定性的比較：在25℃下，設定4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0共8個pH梯度，將胰蛋白酶天然酶與修飾酶分別在各pH條件保存30 min，以酪蛋白為底物測定其胰蛋白酶活性。定義各自最高的酶活力為100%，計算各pH條件下胰蛋白酶的相對活性，即酶活占最高酶活力的百分比。

2 結果與分析

2.1 胰蛋白酶修飾條件優(yōu)化

修飾劑與胰蛋白酶最佳摩爾比例的確定：隨著修飾劑與胰蛋白酶摩爾比例的降低，胰蛋白酶修飾后的殘留酶活逐漸降低，胰蛋白酶的修飾率逐漸增加，當修飾劑與胰蛋白酶的比例小于1∶2時，胰蛋白酶的修飾率基本保持穩(wěn)定，所以修飾劑與胰蛋白酶的最佳摩爾比例為1∶2，見圖1。

圖1 修飾劑與胰蛋白酶的比例對酶修飾的影響

修飾反應最佳pH值的確定：由圖2可知，修飾反應的pH對修飾結果具有一定的影響，當pH 8.0時，胰蛋白酶具有較好的殘留酶活和修飾率。因此在pH 8.0時，胰蛋白酶和活化右旋糖酐更容易發(fā)生連接反應。

圖2 pH對酶修飾的影響

修飾反應最適溫度的確定：由圖3可知，隨著反應溫度的增加，修飾后的胰蛋白酶殘留酶活逐漸降低，在35℃時，胰蛋白酶具有較高的修飾率。因此認為35℃為胰蛋白酶與活化右旋糖苷最優(yōu)反應溫度。

圖3 溫度對酶修飾的影響

修飾反應最佳時間的確定：圖4顯示隨著修飾時間的延長，胰蛋白酶的殘留酶活降低，氨基修飾率都逐漸升高，修飾時間為4 h時，胰蛋白酶的修飾率基本保持穩(wěn)定。因此認為4 h為最佳反應時長。

圖4 修飾時間對酶修飾的影響

綜合以上因素實驗結果，確定右旋糖酐修飾胰蛋白酶的最優(yōu)反應條件為：右旋糖苷與胰蛋白酶的摩爾比為1∶2，pH 8.0，溫度為35℃，修飾時間為4 h。在以上條件下，修飾后的胰蛋白酶保留酶活力56.1%，修飾率為49.2%。

2.2 胰蛋白酶修飾前后性質分析

胰蛋白酶修飾前后最適溫度：由圖5可知，以酪蛋白為底物時，胰蛋白酶的最適溫度為38℃，經過活化右旋糖苷修飾后的胰蛋白酶修飾酶的最適溫度未改變。由此可知，右旋糖酐修飾胰蛋白酶后，并沒有引起胰蛋白酶的活化能發(fā)生變化。

圖5 胰蛋白酶修飾前后適應溫度比較

胰蛋白酶修飾前后最適pH范圍：由圖6可知，以酪蛋白為水解底物時，胰蛋白酶自然酶的最適pH范圍為7.5～8.5，經過活化右旋糖苷修飾后的修飾酶的最適pH范圍為8～9.5。這可能是因為右旋糖苷與胰蛋白酶表面的堿性氨基酸殘基的側鏈氨基發(fā)生共價結合反應，右旋糖苷的引入導致胰蛋白酶分子表面的電荷分布發(fā)生變化，從而影響胰蛋白酶的最適pH范圍。

圖6 胰蛋白酶修飾前后適應pH比較

胰蛋白酶修飾前后的熱穩(wěn)定性：由圖7可知，隨著熱處理時間的增加，胰蛋白酶自然酶與修飾酶的酶活力均呈下降趨勢。但是修飾酶的下降幅度較小，自然酶的下降幅度較大。保溫30min后，胰蛋白酶自然酶與修飾酶的殘留酶活分別為39.6%和60.4%，說明修飾酶的熱穩(wěn)定性比自然酶有明顯提高。當酶受熱時，酶分子內基團之間的相互作用會發(fā)生變化，原本的的平衡被破壞，酶分子的天然構象就向熱力學上熵值高的方向變化，即從緊密有序趨于隨機松散，折疊結構打開，最終導致了酶活性的降低甚至失活。而修飾劑含有多個活性反應基團，能夠與酶形成多點交聯(lián)，使酶的天然構象產生“剛性”，從而增強了酶的熱穩(wěn)定性。這表明氧化右旋糖苷修飾胰蛋白酶對提高胰蛋白酶的熱穩(wěn)定性有較為突出的作用。

圖7 胰蛋白酶修飾前后熱穩(wěn)定性

胰蛋白酶修飾前后的酸堿穩(wěn)定性：由圖8可以看出，胰蛋白酶自然酶與修飾酶的變化趨勢大致相同。胰蛋白酶自然酶在pH 7～8.5范圍內比較穩(wěn)定，胰蛋白酶修飾酶在pH 7～10范圍內比較穩(wěn)定，殘留酶活保持在90%以上，可見修飾酶保留較高酶活的pH范圍明顯比自然酶大；當pH高于10時，自然酶的酶活下降幅度比較大，而修飾酶的酶活下降趨勢較平緩。這說明用右旋糖苷修飾胰蛋白酶對提高胰蛋白酶的酸堿穩(wěn)定性有明顯的作用。

圖8 胰蛋白酶修飾前后酶酸堿穩(wěn)定性

3 討論

蛋白酶經過化學修飾其各種酶學性質通常會發(fā)生一定改變，本實驗以高碘酸鈉活化的右旋糖苷T-40對胰蛋白酶進行化學修飾后，胰蛋白酶最適溫度沒有改變，最適pH值、熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性都有了較明顯的提高。

大多胰蛋白酶經修飾后，其生物活性有一定程度的降低。影響因素有很多，主要取決于氨基修飾率及修飾胰蛋白酶構象和電荷的影響。本實驗處于起步階段，研究相對膚淺，修飾率也不高，下一步需要繼續(xù)優(yōu)化修飾條件，并通過電泳和紅外掃描，驗證修飾后的胰蛋白酶分子量和基團的變化。

［1］黎春怡，黃卓烈.化學修飾法在酶分子改造中的應用［J］.生物技術通報，2011(9)：39-43.

［2］李秀娟.胭脂魚胰蛋白酶的分離純化與化學修飾研究［D］.重慶：重慶師范大學，2010.

［3］凌輝生.化學修飾血紅素改良血紅蛋白特性的研究［D］.廣東：暨南大學，2011.

［4］熊亞紅，吳巧兒，蘇健鴻.化學修飾木瓜蛋白酶的酶學性質研究［J］.分子催化，2010(6)：529-536.

［5］劉建忠，宋海燕，翁麗萍，等.化學修飾改進酶的催化特性研究進展［J］.分子催化，2002，16(6)：475-480.

［6］翟嬋嬋，蘇忠亮，程江峰.酶化學修飾的研究進展［J］.山東化工，2014，43(1)：52-53.

［7］HAFSA K E，吳梧桐，劉景晶，等.右旋糖苷及PEG-2對大腸桿菌L-天冬酰胺酶的化學修飾［J］.藥物生物技術，1997，4(2)：118-121.

［8］朱怡然.右旋糖酐修飾Savings蛋白酶及用于羊毛防氈縮整理［D］.無錫：江南大學，2012.

［9］陳忍忍.蛋白酶的化學修飾及其在羊毛防氈縮整理中的應用［D］.無錫：江南大學，2012.

［10］TREETHARNMATHUROT B，OVATLARNPORN C，WUNGSINTHAWEEKUL J，et al.Chemicalmodification and thermal stability study ofβ-cyclodextrin-and PAMAM-trypsin conjugates［C］.4th IEEE International Conference，2009：954-959.

［11］DORMANTM，CHERIA，LACK I，et al.Stabilization of apsychotropic in aqueous organic solvents by chemical modification with organic acid hydroxides［J］.Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic，2009，59(1/3)：153-157.

［12］劉軍平.聚乙二醇修飾對去折疊胰蛋白酶的影響［D］.南昌：南昌大學，2012.

［20］朱怡然，范雪榮，王強，等.右旋糖酐對Savinase蛋白酶的化學修飾及酶學性質研究［J］.中國生物工程雜志，2011，31 (10)：45-49.

［13］張建萍，劉恩岐.右旋糖苷對生姜蛋白酶的化學修飾及其酶學性質影響［J］.食品科學，2013，34(9)：228-233.

［14］ELSNER C，GRAHN S，BAUER S，et al.Effects of chemical modification of lysine residues in trypsin［J］.Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic，2000，8(4/6)：193-200.

（責任編輯：朱小惠）

Optim ization and characteristics of trypsin modified by dextran

HUANG Jihong1，2，ZHANG Longfei1，WANGWen1
(1.College of Biological Engineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China；2.Henan Institute of Food Industry Science，Zhengzhou 450003，China)

The application ofwild trypsin is severely limited due to the antigenicity of heterologous protein，degradation by protease，low activity and poor stability.In order to obtain a trypsin with stable physical and chemical properties，themodification conditions of the trypsin by dextran and its enzymatic characteristics before and after modification were studied in this paper.The results showed that the optimal modification conditions of the trypsin by dextran were as follows：the molar ratio of dextran and trypsin 1∶2，pH 8.0，temperature 35℃，reaction time 4 h.Under the optimized conditions，the trypsin retained 56.1%of its activity.The range of optimum temperature and pH of the modified trypsin became wider and the heat stability and acid stability were significantly improved.These results indicated that thermal stability and pH stability of the trypsin modified by dextran can be improved，which provides theoretical basis for the modification of trypsin and expands its industrial application.

trypsin；dextran；chemicalmodification；enzymatic properties

Q814

A

1674-2214(2015)04-0001-05

2015-05-31

2015年河南省國際科技合作與交流項目（152102410032）；鄭州市國際科技合作與交流項目（141PGJHZ546）

黃繼紅（1965—），女，河南鄲城人，教授級高級工程師，博士，主要研究方向為發(fā)酵工程，E-mail：huangjih1216@126.com.