石教啟，張繼華

（陽新縣人民醫(yī)院檢驗科，湖北陽新 435200）

急性蕁麻疹患者外周血Th17細胞數(shù)量和功能的變化

石教啟，張繼華

（陽新縣人民醫(yī)院檢驗科，湖北陽新 435200）

目的分析急性蕁麻疹患者外周血輔助性T細胞17（Th17）細胞數(shù)量和功能的變化，探討Th17細胞在急性蕁麻疹免疫致病機制中的作用。方法收集50例急性蕁麻疹患者和50例健康體檢者外周血標(biāo)本，流式細胞術(shù)分析其外周血Th17細胞數(shù)量，實時熒光定量PCR（qPCR）法分析其轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)孤兒素受體γt（RORγt）mRNA水平，酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法分析其外周血Th17細胞相關(guān)細胞因子轉(zhuǎn)化生長因子－β（TGF－β）、白細胞介素（IL）－6、IL－17A、IL－17F和IL－23水平。結(jié)果急性蕁麻疹患者Th17細胞數(shù)量（t＝36.634 1，P＜0.05）和RORγt m RNA水平（t＝23.840 1，P＜0.05）明顯高于對照組，Th17細胞相關(guān)細胞因子TGF－β（t＝15.521 1，P＜0.05）、IL－6（t＝7.247 3，P＜0.05）、IL－17A（t＝15.415 3，P＜0.05）和IL－17F（t＝13.032 1，P＜0.05）水平均明顯高于對照組。結(jié)論Th17細胞可能通過分泌IL－17A、IL－17F和IL－6等炎癥因子在急性蕁麻疹發(fā)病過程中發(fā)揮作用。

急性蕁麻疹； 輔助性T細胞17； 維甲酸相關(guān)孤兒素受體γt； 白細胞介素

蕁麻疹是一種常見的、嚴重的過敏性疾病，是由皮膚、黏膜小血管擴張和通透性增加而導(dǎo)致的一種局限性水腫反應(yīng)，臨床主要表現(xiàn)為風(fēng)團和紅斑，亦可伴發(fā)腹痛腹瀉，嚴重者可喉頭水腫甚至休克［1］。輔助性T細胞17（Th17）是一群重要的介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的細胞，分泌白細胞介素（IL）－17等促炎癥因子，其免疫反應(yīng)失調(diào)和多種免疫性疾病密切相關(guān)［2－3］，但Th17是否參與蕁麻疹免疫致病機制目前尚不清楚。因此，本研究擬分析急性蕁麻疹患者外周血Th17細胞數(shù)量及其相關(guān)細胞因子水平，探討外周血Th17細胞數(shù)量和功能變化與急性蕁麻疹的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年8月至2011年11月來本院皮膚性病科就診的急性蕁麻疹患者50例（急性蕁麻疹組），男23例、女27例，平均年齡41.3歲（33～52歲）。50例同時期于本院體檢者，排除免疫性疾病，作為對照組，男26例、女24例，平均年齡39.6歲（28～48歲）。急性蕁麻疹診斷標(biāo)準(zhǔn)見文獻［4］。

1.2 儀器與試劑 小鼠抗人CD4、IL－17熒光抗體和同型對照試劑購自美國eBioscience公司；莫能霉素、依諾霉素、十二豆蔻佛波醇乙醋（PMA）和皂素均購自Sigma公司；淋巴細胞分離液購自深圳達科為生物技術(shù)有限公司；Dynal磁珠mRNA抽提試劑購自北京思爾成生物技術(shù)有限公司；一步法實時熒光定量PCR（qPCR）通用試劑盒購自北京博奧生物有限公司；維甲酸相關(guān)孤兒素受體（RORγt）引物和熒光探針由上海生工生物工程有限公司設(shè)計和合成；TGF－β、IL－6、IL－17A、IL－17F和IL－23酶聯(lián)免疫法試劑購自美國DRG公司；FACS Calibur型流式細胞儀為美國BD公司產(chǎn)品；Thermo Multiskan MK3型酶標(biāo)儀為美國賽默飛世爾公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 外周血Th17細胞數(shù)量測定 無菌取研究對象肝素抗凝靜脈血2 m L，充分混勻。取1 m L全血和1 m L含10%小牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液于12孔培養(yǎng)板中。加入依諾霉素、PMA和莫能霉素（終濃度分別為2μmol/L、8 nmol/L、2μmol/L），37℃、5%CO2培養(yǎng)4 h。收集培養(yǎng)物，800×103r/min離心5 min去上清，加入0.85%NH4Cl溶液溶解紅細胞，PBS緩沖液洗滌兩次。加入10μL CD4－FITC單抗或小鼠抗人IgGFITC，4℃混勻避光30 min，800×g離心5 min去上清。加入200μL皂素，室溫20 min，PBS緩沖液洗滌兩次。加入10μL IL－17－PE單抗或小鼠抗人IgG－PE，4℃混勻避光30 min，加入400μL 0.5%多聚甲醛固定，上流式細胞儀檢測，以CD4－FITC設(shè)門，檢測Th17（CD4＋IL－17＋）細胞百分率。

1.3.2 外周血Th17細胞轉(zhuǎn)錄因子測定 取研究對象EDTANa2抗凝靜脈血4 m L，淋巴細胞分離液梯度離心法分離研究對象外周血單個核細胞，嚴格按試劑盒說明書抽提純化mRNA，然后采用qPCR檢測RORγt m RNA。

1.3.3 外周血Th17細胞相關(guān)細胞因子測定 取研究對象外周非抗凝血2 m L，分離血清，嚴格按試劑盒說明書檢測誘導(dǎo)因子TGF－β和IL－6水平，以及效應(yīng)因子IL－17A和IL－17F水平

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS14.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)。計量資料以表示，兩組間比較采用成組設(shè)計t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。。

2 結(jié) 果

2.1 急性蕁麻疹患者外周血Th17細胞數(shù)量和轉(zhuǎn)錄因子RORγt m RNA水平 急性蕁麻疹患者外周血Th17細胞百分率（t＝36.634 1，P＜0.05）和RORγt m RNA水平（t＝23.840 1，P＜0.05）均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1、圖1。

2.2 急性蕁麻疹患者外周血Th17細胞相關(guān)細胞因子水平急性蕁麻疹患者外周血Th17細胞誘導(dǎo)因子TGF－β（t＝15.521 1，P＜0.05）、IL－6（t＝7.247 3，P＜0.05）和Th17細胞效應(yīng)因子IL－17A（t＝15.415 3，P＜0.05）、IL－17F（t＝13.032 1，P＜0.05）水平均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

表1 急性蕁麻疹患者外周血Th17細胞百分率和RORγt m RNA水平（）

＊:P＜0.05，與對照組比較。

組別n Th17（%）RORγt mRNA （copies/m L）急性蕁麻疹組50 6.41±1.15＊2 680±624＊對照組50 0.45±0.03 537±121

表2 急性蕁麻疹患者外周血Th17細胞相關(guān)細胞因子水平（pg/m L，）

＊:P＜0.05，與對照組比較。

組別n誘導(dǎo)因子TGF－βIL－6效應(yīng)因子IL－17A IL－17F急性蕁麻疹組50 534.2±122.3＊230.1±99.3＊313.2±89.6＊323.5±108.3＊對照組50 220.8±73.5 100.3±78.6 97.1±42.4 100.3±54.2

3 討 論

蕁麻疹是一種變態(tài)反應(yīng)性疾病，其發(fā)病中心環(huán)節(jié)是皮膚或黏膜組織肥大細胞脫顆粒，釋放血管活性介質(zhì)如組胺等，新合成的、胞膜來源的介質(zhì)如白三烯、前列腺素等隨后釋放，造成平滑肌收縮、毛細血管擴張、通透性增加等，引起蕁麻疹的臨床表現(xiàn)［4］。

以往研究認為IgE介導(dǎo)的Ⅰ型超敏反應(yīng)是蕁麻疹發(fā)生的主要免疫機制，但近年來研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型超敏反應(yīng)并不能解釋所有的蕁麻疹，可能有更多的免疫功能紊亂狀況參與了蕁麻疹免疫發(fā)病機制［5－6］。研究發(fā)現(xiàn)以分泌炎癥因子IL－17為主要特征的Th17細胞與器官移植排斥反應(yīng)、腫瘤及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、哮喘等炎癥免疫性疾病有關(guān)，這些患者的血清和病變組織中都能檢測到IL－17分子［7－8］。急性哮喘患者外周血Th17細胞表達增加，并且與疾病的嚴重程度呈正相關(guān)［9］；同樣，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血Th17細胞也明顯增多，并且與病情活動性、腎臟損害程度及蛋白尿相關(guān)［10］；另有研究發(fā)現(xiàn)Th17功能亢進可能促進了急性胰腺炎的發(fā)生與惡化［11］。但Th17細胞是否參與蕁麻疹免疫致病機制目前少有報道，本研究發(fā)現(xiàn)急性蕁麻疹患者外周血Th17細胞數(shù)量明顯高于對照組，結(jié)果提示Th17細胞可能與急性蕁麻疹密切相關(guān)。

Th17細胞是一種效應(yīng)性、記憶性CD4＋T細胞，約占其總數(shù)的17.2%。Th17細胞的確切調(diào)控機制仍不十分清楚，可能受IL－23、IL－l2、IL－6、TGF－β、INF－γ等多種細胞因子以及轉(zhuǎn)錄因子RORγt的共同作用影響，具有獨特的分化和發(fā)育途徑［12－13］。體內(nèi)外實驗證實IL－6和TGF－β的共同刺激為誘導(dǎo)初始CD4＋T細胞表達IL－17和IL－17F的始動因素；同時IL－6 和TGF－β也是誘導(dǎo)Th17分化的關(guān)鍵細胞因子，單獨TGF－β存在條件下初始CD4＋T細胞被誘導(dǎo)分化成具有免疫抑制作用的Treg細胞，而TGF－β與IL－6共同存在時，初始CD4＋T細胞則誘導(dǎo)分化成T17細胞。TGF－β和IL－6的協(xié)同作用能誘導(dǎo)RORγt的產(chǎn)生，RORγt是Th17細胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子［14］，RORγt缺陷小鼠體內(nèi)Th17細胞數(shù)明顯降低，而過度表達RORγt可以促進Th17細胞的表達。本研究發(fā)現(xiàn)急性蕁麻疹患者外周血Th17細胞誘導(dǎo)因子TGF－β、IL－6和轉(zhuǎn)錄因子RORγt m RNA水平均明顯高于對照組；結(jié)果提示高水平的Th17細胞誘導(dǎo)因子TGF－β、IL－6和轉(zhuǎn)錄因子RORγt mRNA誘導(dǎo)了急性蕁麻疹患者外周血Th17細胞的分化和成熟。

Th17細胞能夠產(chǎn)生多種效應(yīng)分子，最主要的效應(yīng)分子是IL－17A和IL－17F［8］。IL－17A即通常所說的IL－17。IL－17生物學(xué)效應(yīng)廣泛，其最主要功能是作為炎癥介質(zhì)刺激IL－6、氧化亞氮和前列腺素E2的產(chǎn)生，同時IL－17可通過上調(diào)IL－1β、TNF－α、INF－γ等炎癥細胞因子基因的表達，促進局部炎癥進展和擴大化。IL－17F是Th17細胞分泌的另一效應(yīng)分子，和IL－17A有許多的相似性，IL－17F可能和IL－17A共享相同的受體，因而發(fā)揮與IL－17A相同的生物學(xué)效應(yīng)，參與疾病的進程。研究發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎患者肝組織中Th17細胞相關(guān)因子過表達，并且與肝臟炎癥和纖維化程度相關(guān)［15］。本研究發(fā)現(xiàn)急性蕁麻疹患者外周血Th17細胞效應(yīng)因子IL－17A和IL－17F水平均明顯高于對照組；結(jié)果提示Th17細胞可通過分泌IL－17A 和IL－17F等效應(yīng)分子參與急性蕁麻疹患者的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，外周血Th17細胞數(shù)量增高和炎癥因子分泌功能亢進與急性蕁麻疹患者的免疫發(fā)病機制密切相關(guān)。

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Changes in number and function of peripheral blood Th17 cells in acute urticaria patients

Shi Jiaoqi，Zhang Jihua
（Department of Clinical Laboratory，Yangxin People′s Hospital，Yangxin，Hubei 435200，China）

ObjectiveTo study the changes in number and function of peripheral blood T helper cell 17（Th17）in acute urticaria patients.MethodsThe percentages of Th17 in peripheral blood from 50 acute urticaria patients and 50 healthy persons were analyzed by immunofluorescence staining and bicolor flow cytometry（FCM）in vitro.Retinoic acid－related orphan nuclear receptorγt （RORγt）m RNA from the same research objects were detected by quantitative realtime PCR（qPCR）method.Peripheral blood transforming growth factor－β（TGF－β），interleukin（IL）－6，IL－17A and IL－17F were tested by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）from the same research objects.ResultsThe quantity of percentages of Th17（t＝36.634 1，P＜0.05）and levels of RORγt m RNA（t＝23.840 1，P＜0.05）in urticaria patients were higher than those in healthy persons obviously.Meanwhile，the levels of TGF－β（t＝15.521 1，P＜0.05），IL－6（t＝7.247 3，P＜0.05），IL－17A（t＝15.415 3，P＜0.05）and IL－17F（t＝13.032 1，P＜0.05）in urticaria patients were higher than those in healthy persons significantly.ConclusionDysfunction of Th17 in peripheral blood may involve in the immunopathogenesis of acute urticaria.

acute urticaria； T helper cell 17； retinoic acid－related orphan nuclear receptorγt； interleukin

10.3969/j.issn.1673－4130.2015.10.043

A

1673－4130（2015）10－1416－03

2015－02－12）

石教啟，男，主管檢驗技師，主要從事臨床免疫學(xué)與檢驗的研究。