龍海鋒，梁肖云，顧曉瓊△，張 喆，張 媛，尹玉萍

（1.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心臨床檢驗部，廣東 510623；2：廣州醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州 510182）

低氧血癥新生兒循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量的變化及其臨床意義＊

龍海鋒1，梁肖云1，顧曉瓊1△，張 喆1，張 媛1，尹玉萍2

（1.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心臨床檢驗部，廣東 510623；2：廣州醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州 510182）

目的探討低氧血癥新生兒外周血循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞（CECs）水平變化及其臨床意義。方法采用Hladovec計數(shù)法測定40例不同程度缺氧的低氧血癥患兒（低氧血癥組）及20例血氧分壓正常的健康新生兒（對照組）外周血CECs數(shù)量。結(jié)果低氧血癥組CECs為（0.910±0.422）×106/L與對照組比較，高于對照組的（0.180±0.100）×106/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝7.539，P＜0.05）；中度低氧血癥組CECs為（1.140±0.135）×106/L，高于輕度低氧血癥組的（0.540±0.127）×106/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝13.43，P＜0.05）；重度低氧血癥組CECs為（1.660±0.114）×106/L，高于中度低氧血癥組的（1.140±0.135）×106/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝7.698，P＜0.05）。結(jié)論外周血CECs數(shù)量可反映低氧血癥患兒缺氧嚴(yán)重程度，可作為低氧血癥的早期診斷指標(biāo)，為臨床早期診斷、病情判斷及療效評估提供新的判斷依據(jù)。

循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞； 低氧血癥； 新生兒

新生兒期是指自胎兒娩出后臍帶結(jié)扎時開始至出生后28 d之前。在此期間，胎兒身體各器官發(fā)育尚不成熟，適應(yīng)外界環(huán)境能力差，極易患各種疾病，病死率高；低氧血癥則是其中最常見的病理表現(xiàn)之一。低氧血癥是指由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾患及支氣管、肺病變等通氣和（或）換氣功能障礙，而引起的血液中含氧不足，動脈血氧分壓（PaO2）低于同齡人正常下限時的病理狀態(tài)，主要表現(xiàn)為血氧分壓與血氧飽和度下降。由于腦細(xì)胞對缺氧極其敏感，持續(xù)的缺氧可對大腦產(chǎn)生不可逆損傷，因此早期診斷低氧血癥，對于臨床搶救危重癥患兒，尤其是早產(chǎn)兒、極低出生體質(zhì)量兒具有重要意義［1］。本研究旨在通過計數(shù)40例不同缺氧程度的低氧血癥患兒外周血中循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞（CECs）數(shù)量，初步探討低氧血癥新生兒外周血中CECs水平與缺氧程度的聯(lián)系及其臨床意義，從而為新生兒缺氧的有效診斷、治療及預(yù)后判斷提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年7～10月于廣州市婦女兒童醫(yī)療中心珠江新城院區(qū)新生兒科就診的低氧血癥新生兒40例，其中男24例，女16例，年齡為1～25d。參考急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）柏林定義，將患兒按氧合指數(shù)（PaO2/FiO2）分輕度低氧血癥組（輕度組，n＝20）、中度低氧血癥組（中度組，n＝15）和重度低氧血癥組（重度組，n＝5），各組PaO2/FiO2水平分別為200～300mm Hg、100～＜200mm Hg、＜100mm Hg［2］。另外選取本院同期血氧分壓正常（PaO2/FiO2＞300 mm Hg）的健康新生兒20例作為對照組，其中男11例，女9例，年齡為1～23d。低氧血癥組與對照組在年齡及性別方面的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。用紫頭采血管（含EDTAK2）采集各受試者靜脈血5mL，排除存在溶血、渾濁等影響因素的標(biāo)本。

1.2 主要試劑 二磷酸腺苷（ADP）購自普利生公司，山羊血清購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司，兔抗人CD34抗體購自上海滬尚生物科技有限公司。

1.3 方法 Hladovec計數(shù)法計數(shù)外周血CECs。（1）內(nèi)皮細(xì)胞的分離：將采集的抗凝血標(biāo)本離心20min（3 150r/min），收集上清液；將0.1%ADP溶液0.2mL加入上清液中，振蕩2 min；離心20min（3 150r/min），將離心后所獲之上清液以4 450r/min離心10min，棄上清液，收集的沉淀物即為CECs；將0.1mL生理鹽水加入沉淀物中，振蕩重懸后備檢［3］。（2）計數(shù)CECs：將重懸液充分混勻，取1滴加入血細(xì)胞計數(shù)池內(nèi)，光學(xué)顯微鏡下計數(shù)9個大方格中的CECs數(shù)量。同一標(biāo)本計數(shù)4次，取其平均值作為CECs檢測結(jié)果，CECs＝9個大方格的細(xì)胞數(shù)/0.9μL［3］。（3）內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定：采用免疫組化的方法檢測CD34抗體相關(guān)抗原［4］。將分離好的內(nèi)皮細(xì)胞均勻涂布于一潔凈玻片上，用95%酒精固定15min，晾干待檢。PBS漂洗3次，經(jīng)0.1%Triton破膜10min，用PBS洗3次，濃度為50 mmol/L甘氨酸淬滅20min；PBS洗3次，山羊血清封閉1h，PBS洗3次，然后加入稀釋（1∶200）CD34抗體，4℃濕盒過夜；用PBS洗3次。滴加二抗，室溫孵育1h，PBS洗3次。加入DAPI，反應(yīng)15～20min；PBS洗3次。在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用Pearson相關(guān)分析進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1 CECs免疫熒光染色鑒定結(jié)果 免疫熒光染色結(jié)果顯示，未加一抗的實(shí)驗對照組未發(fā)現(xiàn)熒光染色細(xì)胞；熒光染色實(shí)驗組鏡下可見熒光染色細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞CD34抗體相關(guān)抗原呈陽性反應(yīng)，細(xì)胞胞漿中有黃綠色的熒光著色，整個細(xì)胞輪廓清楚。確定分離得到的細(xì)胞為CECs，見附圖1（見《國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”）。

2.2 低氧血癥組與對照組CECs比較 統(tǒng)計學(xué)分析顯示，低氧血癥組CECs數(shù)量多于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.3 各低氧血癥亞組CECs數(shù)量的比較 中度低氧血癥組CECs數(shù)量多于輕度低氧血癥組，重度低氧血癥組多于中度低氧血癥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。Pearson相關(guān)分析顯示，低氧血癥患兒CECs數(shù)量與缺氧程度呈正相關(guān)（r＝0.954，P＜0.05）。

3 討 論

目前臨床上用于評價血管損傷的方法主要分為有創(chuàng)和無創(chuàng)兩大類，有創(chuàng)的檢測方法包括冠狀動脈造影，即觀察冠狀動脈對乙酰膽堿所誘發(fā)的內(nèi)徑變化，這種方法創(chuàng)傷性大，不適于疾病早期階段觀察，且儀器要求較高。無創(chuàng)的檢測方法包括血管超聲檢測肱動脈血流介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能（FMD）、頸動脈中膜厚度（IMT）、臂踝脈搏波傳導(dǎo)速度（baPWV）、踝臂指數(shù)（ABI）、中心動脈壓（CAP）、增強(qiáng)指數(shù)（AI）、大動脈彈性指數(shù)（C1）和小動脈彈性指數(shù)（C2）等。這些方法雖具有安全、實(shí)時、無創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)，但對設(shè)備要求高。因此，探尋一種新的無創(chuàng)性血管損傷評價標(biāo)志物迫在眉睫［5］。本課題采用的外周血CECs計數(shù)具有無創(chuàng)傷性、取材方便、操作簡便、靈敏度高、結(jié)果直觀等特點(diǎn)，為病理情況下非創(chuàng)傷性評價血管內(nèi)皮情況開辟了新的路徑。

CECs由受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞脫落于外周血形成，在健康人外周血中數(shù)量極少。當(dāng)機(jī)體發(fā)生缺氧時，血流動力學(xué)會發(fā)生明顯變化，使得機(jī)體某些臟器出現(xiàn)相應(yīng)病理改變，導(dǎo)致血管內(nèi)皮受損，進(jìn)而引起一系列級聯(lián)反應(yīng)，如組織因子表達(dá)增加，上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子，白細(xì)胞黏附、移行，血管內(nèi)皮細(xì)胞變性、壞死，并脫落進(jìn)入血循環(huán)，進(jìn)而形成CECs［6］。多項研究表明，在炎癥、免疫應(yīng)答、心血管疾病等情況下，CECs數(shù)量明顯增加，且由于決定CECs水平的因素較為單一，基本只受血管內(nèi)皮損傷的影響［5］，因此可作為敏感、特異的指標(biāo)直接反映血管內(nèi)皮的損傷程度［7］。目前，CECs被認(rèn)為是唯一一種直接研究活體血管內(nèi)皮損傷的非創(chuàng)傷性指標(biāo)，其在探索活體血管內(nèi)皮的特性和功能、協(xié)助診斷相關(guān)疾病、判斷病情以及療效評估等方面的應(yīng)用受到越來越廣泛的關(guān)注。

本研究采用了Hladovec法對血漿中的CECs進(jìn)行分離，其原理是利用血液中各細(xì)胞成分的不同比重，用不同的離心力從血漿中分離出CECs。本法的優(yōu)勢在于對實(shí)驗室條件要求簡單，僅需離心機(jī)、血細(xì)胞計數(shù)板、ADP等簡單的器材和試劑，在一般實(shí)驗室均可完成，從某種程度上極大地促進(jìn)和推動了CECs研究在臨床上的應(yīng)用。

免疫熒光檢測是鑒定CECs的最可靠的方法［8］。CECs表現(xiàn)為CD34＋［9］。實(shí)驗中為證實(shí)本研究檢測到的是CECs。本研究對涂片中的細(xì)胞進(jìn)行了間接免疫熒光檢測，熒光染色結(jié)果顯示內(nèi)皮細(xì)胞的黃綠色特異性熒光位于細(xì)胞的膜和胞漿，表明所觀察到的免疫熒光細(xì)胞是CECs。

本研究通過計數(shù)40例不同缺氧程度的低氧血癥新生兒外周血CECs數(shù)量發(fā)現(xiàn)，健康新生兒外周血中僅存在極少量CECs，而低氧血癥患兒外周血CECs水平顯著高于健康新生兒，且CECs水平隨缺氧程度的加重而顯著增加，表明外周血CECs增多可作為血管內(nèi)皮損傷的重要病理學(xué)特征。本研究結(jié)果提示，新生兒外周血CECs檢測可能作為低氧血癥的早期診斷指標(biāo)，為臨床早期診斷、病情判斷及療效評估提供新的科學(xué)依據(jù)。

本次研究收集的重度低氧血癥患兒樣本數(shù)較少，下一步本課題組將擴(kuò)大樣本量，針對低氧血癥患兒進(jìn)行跟蹤隨訪，對CECs與缺氧程度的相關(guān)性進(jìn)行更深入的研究。隨著對CECs研究的逐漸深入，它在內(nèi)皮損傷的非侵襲性研究及臨床應(yīng)用方面將會顯現(xiàn)出更大的價值。

［1］ 張偉群.新生兒缺氧缺血性腦病多器官損傷及預(yù)后影響因素分析［J］.實(shí)用心腦肺血管病雜志，2009，17（2）：89－90.

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［3］ 周雅娟.川崎病外周血循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞水平變化與冠狀動脈損傷關(guān)系的探討［D］.沈陽：中國醫(yī)科大學(xué)，2010：7－8.

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Number changes of circulating endothelial cells in neonatal hypoxemia and its clinical significance＊

Long Haifeng1，Liang Xiaoyun1，Gu Xiaoqiong1△，Zhang Zhe1，Zhang Yuan1，Yin Yuping2
（1.Department of Clinical Laboratory，Guangzhou Women and Children′s Medical Center，Guangzhou，Guangdong510623，China；2.Guangzhou Medical College，Guangzhou，Guangdong510182，China）

ObjectiveTo explore changes in circulating endothelial cells（CECs）numbers in neonatal hypoxemia and its clinical significance.MethodsHladovec method was used to measure the quantity of CECs in 40cases of neonatus with different degree of hypoxemia（hypoxemia group），and 20matched healthy newborns were enrolled as control group.ResultsThe numbers of CECs in hypoxemia group were much more than those in control group，and the difference was statistically significant.Meanwhile，there were significant differences in CECs numbers between moderate group and mild group（t＝13.43，P＜0.05），as well as moderate group and severe group（t＝7.698，P＜0.05）.ConclusionThe quantity of circulating ECEs in hypoxic neonatus is correlated with the hypoxic severity，which may be used as early diagnostic indicator for hypoxemia，and could provide new scientific evidences for early diagnosis，illness judgment and curative effect evaluation.

circulating endothelial cells； hypoxemia； neonatus

10.3969/j.issn.1673－4130.2015.03.003

A

1673－4130（2015）03－0294－02

2014－09－15）

廣東省自然科學(xué)基金項目資助（S2013010012520）。 作者簡介：龍海鋒，男，檢驗技師，主要從事臨床檢驗基礎(chǔ)的研究。△

，E－mail：guxiaoqiong＠163.com。