郭家鵬，朱利峰

（1.河南省動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南　鄭州　450008；2.河南省畜牧獸醫(yī)服務(wù)中心）

瘋牛病檢測(cè)技術(shù)最新研究進(jìn)展

郭家鵬1，朱利峰2

（1.河南省動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南鄭州450008；2.河南省畜牧獸醫(yī)服務(wù)中心）

瘋牛?。˙SE）的流行給許多國(guó)家的畜牧業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并不斷威脅人類健康。對(duì)于瘋牛病的防制，有效的檢測(cè)技術(shù)起十分重要的作用。對(duì)近年瘋牛病檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展進(jìn)行總結(jié)和展望。

瘋牛??；朊病毒；畜牧業(yè)；檢測(cè)技術(shù)

傳染性海綿狀腦?。═SE）是一類引起人和動(dòng)物神經(jīng)組織退化的疾病，包括人的庫(kù)魯病、克-雅氏病、吉-斯綜合征、阿爾茨海默病以及動(dòng)物的瘋牛病、羊瘙癢病等。其中瘋牛病發(fā)現(xiàn)的最早，動(dòng)物采食含有朊病毒的肉骨粉可能引起該病的發(fā)生［1］。該病對(duì)養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展和人類健康構(gòu)成巨大威脅，并有“東擴(kuò)”蔓延的趨勢(shì)，已成為國(guó)際獸醫(yī)學(xué)界和醫(yī)學(xué)界共同關(guān)注的熱點(diǎn)問題。

1　瘋牛病流行狀況及其檢測(cè)技術(shù)研究的重要性

1.1瘋牛病的病原

瘋牛病的學(xué)名為牛海綿狀腦病（BSE），病原為朊病毒，是一種無(wú)核酸的蛋白性侵染顆粒，屬慢性進(jìn)行性致死性神經(jīng)系統(tǒng)疾病。目前認(rèn)為BSE的病原為癢病相關(guān)纖維（SAF），這種纖維源自非常規(guī)變異蛋白（PrPsc），它的存在是BSE的一大特征。發(fā)生變異的蛋白引發(fā)人和動(dòng)物的腦組織形成海綿狀空洞，腦神經(jīng)會(huì)漸漸變得像疏松的海綿體，腦功能出現(xiàn)退化，行動(dòng)失去控制，四處盲目沖撞直至死亡。這就是瘋牛病及其與人類相關(guān)的克-雅氏癥等疾病的病因?？茖W(xué)家經(jīng)過多年的研究還發(fā)現(xiàn)，老年癡呆癥的病變蛋白與其有驚人的相似，它們?cè)诨瘜W(xué)致病機(jī)制上有許多類似性。

1.2瘋牛病的流行狀況

1986年，英國(guó)首先發(fā)現(xiàn)并報(bào)道該病，1987年正式命名為牛的海綿狀腦病，并且在世界上公開報(bào)道。1986年，英國(guó)首先發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了14個(gè)病例，以后發(fā)病趨勢(shì)加快，至1993年達(dá)到了高峰，病牛達(dá)到了3.7萬(wàn)多頭。到1999年7月，英國(guó)確認(rèn)的病例有17萬(wàn)多頭。最新統(tǒng)計(jì)全球共有瘋病牛20多萬(wàn)頭，其中英國(guó)占180 376頭，歐洲是重災(zāi)區(qū)［2］。除英國(guó)大規(guī)模的暴發(fā)外，美國(guó)、法國(guó)、德國(guó)、日本、荷蘭、葡萄牙、西班牙、意大利、愛爾蘭、瑞士、比利時(shí)、盧森堡、丹麥等20多個(gè)國(guó)家和地區(qū)發(fā)生了瘋牛?。?］。但是這些國(guó)家基本上是散發(fā)性的，只有英國(guó)是大規(guī)模流行。瘋牛病近年出現(xiàn)了東擴(kuò)的趨勢(shì)，日本已證實(shí)了瘋牛病的發(fā)生，并且流行趨勢(shì)相當(dāng)嚴(yán)峻，不斷有新病例發(fā)生的報(bào)道［4］。

1.3瘋牛病檢測(cè)研究的重要意義

瘋牛病潛伏期比較長(zhǎng)，一般為4至5年，而且機(jī)體不能對(duì)其產(chǎn)生免疫反應(yīng)，對(duì)人類和動(dòng)物都有極大的威脅性。強(qiáng)調(diào)瘋牛病的嚴(yán)重性，不僅是因?yàn)榀偱２魅窘o人后會(huì)使人患上克-雅氏癥，更因?yàn)槿祟惸壳皩?duì)瘋牛病還沒有有效的防治和治療措施，所以檢測(cè)和診斷就顯得尤為重要。

2　目前瘋牛病檢測(cè)技術(shù)的研究水平

目前，世界各國(guó)對(duì)瘋牛病的檢測(cè)尚無(wú)經(jīng)濟(jì)實(shí)用、簡(jiǎn)便高效的方法。對(duì)瘋牛病的檢測(cè)步驟一般為：先根據(jù)臨床特征和流行病學(xué)資料做出初步診斷，再根據(jù)病理組織學(xué)變化、免疫學(xué)以及分子生物學(xué)檢測(cè)等方法確診。隨著生物學(xué)及生物學(xué)相關(guān)邊緣科學(xué)的發(fā)展，出現(xiàn)了許多新的檢測(cè)方法。

2.1病理組織檢測(cè)方法

可疑BSE病例被屠宰后，首要的診斷方法是病理組織學(xué)檢查，當(dāng)發(fā)現(xiàn)BSE特征性病變即海綿狀空洞即可確診。BSE病牛具體病理組織學(xué)變化是：腦兩側(cè)灰質(zhì)神經(jīng)叢對(duì)稱性海綿樣病變和腦干神經(jīng)核神經(jīng)元空泡化，以腦組織中淀粉樣核心周圍有由海綿樣變性形成的“花瓣”組成的雛菊花樣病理斑為特征。

2.2生物鑒定方法

通過被檢標(biāo)本勻漿（腦、脊髓、脾等）接種小鼠或倉(cāng)鼠，接種動(dòng)物3 d檢查1次，瀕死撲殺取腦組織做病理學(xué)檢查。最后根據(jù)動(dòng)物發(fā)病和死亡數(shù)計(jì)算終點(diǎn)滴度。倉(cāng)鼠觀察期為7～8個(gè)月，小鼠為12～36個(gè)月，而且代價(jià)高昂，臨床不常采用［1，5］。

2.3免疫學(xué)檢測(cè)方法

BSE診斷的實(shí)際應(yīng)用需要更加快速并且可同時(shí)檢測(cè)大量樣本的方法，目前有多種免疫診斷技術(shù)可區(qū)分正常和異常的朊病毒蛋白，其中有些能精確確定朊病毒蛋白含量水平。

2.3.1免疫細(xì)胞化學(xué)法（ICC）

ICC試驗(yàn)利用抗原直接在組織切片上檢查PrPsc。試驗(yàn)從每個(gè)腦組織上分別取延髓、腦橋、中腦、丘腦、大腦皮質(zhì)、小腦組織做成切片，在切片上滴加第一抗體（如鼠抗PrP單克隆抗體FH11），第二抗體為標(biāo)記有生物素的馬血清。若病理組織切片中有PrPsc，就會(huì)與第一抗體結(jié)合，隨后與第二抗體結(jié)合。再加入ABC（Avidin+ Biotin-peroxidase complex）試劑，后者可結(jié)合到第二抗體上。之后再加入底物（H2O2），即可出現(xiàn)反應(yīng)。最后用蘇木素復(fù)染，PrPsc呈紅褐色。陽(yáng)性對(duì)照切片是羊癢病腦組織切片，從而鑒定樣品中有無(wú)瘋牛病病原［6］。

2.3.2免疫組織化學(xué)法

免疫組化是利用標(biāo)記的特異性抗體來(lái)顯示組織切片上的PrPsc。其基本步驟是：將甲醛固定或石蠟包埋的組織標(biāo)本經(jīng)一系列預(yù)處理后，依次與特異性抗體和酶標(biāo)記二抗反應(yīng)，最后加底物顯色，顯微鏡下觀察。用該方法檢測(cè)靈敏度、特異性都很高，且具有高度的解剖學(xué)分辨率，已成為傳染性海綿狀腦病的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)法［7-8］。有關(guān)專家利用該方法對(duì)英國(guó)和意大利的瘋牛病的檢測(cè)進(jìn)行比較得到了相同的檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)一步說明了該方法的可靠性。法國(guó)食品公共衛(wèi)生部研究出的石蠟包埋斑點(diǎn)法（PET-blot）也可以用來(lái)檢測(cè)受感染的腦組織。

2.3.3免疫印跡法

瑞士Prionics公司是瘋牛病和羊癢病等朊病毒疾病早期診斷的全球領(lǐng)先企業(yè)。Pronics公司開發(fā)的免疫印跡法采用Westernblot法檢測(cè)朊病毒蛋白，需要6 h就能出檢測(cè)結(jié)果，這種方法現(xiàn)在被瑞士政府和英國(guó)授權(quán)用于牛的瘋牛病管理，并可用于對(duì)潛伏期動(dòng)物進(jìn)行檢測(cè)。目前，歐洲委員會(huì)建議，在歐盟監(jiān)管項(xiàng)目的瘋牛病檢測(cè)中采用新型Prionics（R-Check LIA）法，LIA專門設(shè)計(jì)用來(lái)進(jìn)行BSE檢測(cè)，具有很高的精確性和可靠性。歐委會(huì)瘋牛病專家的評(píng)估顯示出百分之百的敏感性和特異性［9］。

2.3.4ELISA法

愛爾蘭Enfer Scientific公司的ELISA法采用了新的抽取技術(shù)，利用化學(xué)熒光和多細(xì)胞抗-PrP抗體進(jìn)行檢測(cè)，約24 h出結(jié)果。這種檢測(cè)方法已被愛爾蘭政府應(yīng)用于感染BSE的牛監(jiān)測(cè)。法國(guó)和英國(guó)的Bio-Rad公司開發(fā)的Platelia試驗(yàn)和TeSeE試驗(yàn)采用夾心免疫法，約4 h出結(jié)果，該方法使用兩個(gè)單克隆抗體，第一個(gè)抗體在固相中被免疫，而第二個(gè)抗體用共價(jià)酶做標(biāo)記，PrP通過測(cè)量這種酶的活性來(lái)檢測(cè)。該方法尤其適用于有大量樣本的情況，與傳統(tǒng)接種動(dòng)物的方法平行對(duì)比，檢測(cè)感染BSE牛腦組織稀釋樣本，準(zhǔn)確性好，并有可能用于檢測(cè)處于潛伏期的標(biāo)本。日本東京Fujirebio公司研發(fā)的一步法ELISA試驗(yàn)將牛腦組織制備成勻漿懸液后，先用DNAse I和膠原酶（Collagense）處理，再用蛋白酶消化。之后，依次經(jīng)過蛋白沉淀，耐受蛋白酶蛋白水解折疊，水浴超聲懸浮，將懸浮物加到包被有特異單克隆抗體的微孔板，再加入HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，TMB顯色等試驗(yàn)步驟后，用酶標(biāo)儀讀取結(jié)果，顯示出了很高的檢測(cè)準(zhǔn)確性。

2.3.5構(gòu)象依賴性免疫測(cè)定法

美國(guó)加州大學(xué)舊金山分校（UCSF）的研究人員開發(fā)出的構(gòu)象依賴性免疫測(cè)定方法（CDI），比現(xiàn)在應(yīng)用的普通免疫測(cè)定方法能檢測(cè)出更微量的prion蛋白，而且5 h即可出結(jié)果。該方法將可用于檢測(cè)活動(dòng)物而且準(zhǔn)確性相當(dāng)高，對(duì)西班牙、德國(guó)和英國(guó)的11 000頭屠宰牛檢測(cè)結(jié)果完全與現(xiàn)在應(yīng)用的方法相符，而且在實(shí)驗(yàn)室和臨床試驗(yàn)中，還沒有發(fā)現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果。另外，該方法的另一突出優(yōu)點(diǎn)是自動(dòng)化，因此可以用于大量動(dòng)物的篩選［10］。

2.3.6免疫熒光法

EGG Wallac的基于免疫熒光方法的Delfia試劑，敏感性比較高，該方法檢測(cè)是使用兩個(gè)單克隆靶PrP的非競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)方法，英國(guó)的農(nóng)漁食品部（MAFF）已同意將其用于檢測(cè)英國(guó)的牲畜。德國(guó)學(xué)者研制出利用熒光相關(guān)光譜檢測(cè)瘋牛病的方法，可以不用蛋白激酶K進(jìn)行消化，這對(duì)于潛伏期動(dòng)物的診斷有很大的優(yōu)勢(shì)。

2.3.7高效色譜免疫分析法

高效色譜免疫分析法于2004年被歐盟委員會(huì)接受用于瘋牛病的檢測(cè)，巴薩羅那大學(xué)研究的Prionics-Check PrioSTRIP是一種針對(duì)瘋牛病開發(fā)的高效色譜免疫分析法，也有很高的可靠性。

2.3.8雞卵黃抗體檢測(cè)

日本廣島大學(xué)、國(guó)家動(dòng)物健康研究所和廣島科技研究所的研究人員重組了一種可以檢測(cè)瘋牛病的雞卵黃抗體（IgY），這種抗體的可變區(qū)包括Ab3-15和Ab4-19兩個(gè)抗哺乳動(dòng)物朊病毒蛋白的區(qū)域，從而能敏感的識(shí)別PrPsc蛋白準(zhǔn)確檢測(cè)瘋牛病。

2.4分子生物學(xué)檢測(cè)方法

2.4.1Westernblotting檢測(cè)法

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家動(dòng)物海綿狀腦病實(shí)驗(yàn)室的王輝暖、趙德明等于2007年以朊蛋白單抗AH6和堿性磷酸酶標(biāo)記的馬抗鼠酶標(biāo)二抗建立了瘋牛病和羊癢病的Western blotting檢測(cè)方法。其敏感性為100%，特異性為99.4%，與進(jìn)口試劑盒無(wú)顯著差異，這為國(guó)產(chǎn)試劑盒研制提供了條件［11］。國(guó)家瘋牛病參考實(shí)驗(yàn)室利用小鼠骨髓瘤細(xì)胞和經(jīng)過重組魯西黃牛PrP或重組小尾寒羊PrP免疫的脾細(xì)胞建立了5個(gè)雜交瘤細(xì)胞系。經(jīng)過Western blot反應(yīng)，其中有4組可以識(shí)別牛和羊的re-PrP、PrPc和PrPsc，兩組只能識(shí)別羊的re-PrP和PrPsc，對(duì)牛和羊的PrPc都不能識(shí)別，利用此方法可以進(jìn)行瘋牛病的監(jiān)測(cè)。荷蘭動(dòng)物疾病中心利用咽喉淋巴結(jié)進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，不但能檢測(cè)瘋牛病而且可以區(qū)分瘋牛病和羊癢病。

2.4.2瘋牛病特殊風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)熒光RT-PCR檢測(cè)法

北京出入境檢驗(yàn)檢疫局的史喜菊等人建立了檢測(cè)牛肉中瘋牛病特殊風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)（主要是中樞神經(jīng)組織）標(biāo)記物膠原纖維酸性蛋白（GFAP）mRNA的熒光RT-PCR檢測(cè)技術(shù)。能從牛源和羊源的中樞神經(jīng)組織中檢測(cè)到GFAP［12］。

2.4.3利用紅細(xì)胞分化相關(guān)因子（EDRF）檢測(cè)法

英國(guó)的中洛錫安群羅斯林研究所的Gino Miele等人利用cDNA的差異顯示分析，來(lái)鑒定在朊蛋白疾病中具有異常表達(dá)的EDRF轉(zhuǎn)錄物。朊病毒侵入大腦前首先在脾臟復(fù)制，由此他們推測(cè)朊病毒可能會(huì)影響基因表達(dá)，于是他們分析了來(lái)自正常小鼠脾臟和BSE感染小鼠脾臟的RNA轉(zhuǎn)錄物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在感染小鼠的脾臟中，EDRF的轉(zhuǎn)錄水平下降，不僅如此，受感染小鼠的血液和骨髓也存在EDRF的減少，在羊癢病患羊和BSE患牛的骨髓中，EDRF的水平同樣低于正常。由此判斷不論EDRF是否參與致病，它可能會(huì)成為很好的診斷標(biāo)記物。

2.4.4利用標(biāo)記核糖核酸檢測(cè)法

2004年德國(guó)吉森獸醫(yī)與食品研究所米夏埃爾·比爾特教授等開發(fā)出利用核糖核酸（RNA）作為標(biāo)記物的檢測(cè)方法。動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含有膠質(zhì)纖維酸性蛋白，而合成這種蛋白質(zhì)的過程中會(huì)產(chǎn)生信使RNA，通過實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)，就能找到信使RNA的痕跡，進(jìn)而判斷肉類食品中是否摻入了含有瘋牛病病毒粒子的腦或脊髓組織［13］。

2.5其他檢測(cè)方法

2001年，美國(guó)和英國(guó)合作研制出通過檢測(cè)尿液診斷瘋牛病的方法?？蓹z測(cè)到病牛尿液中的瘋牛病因子，而且特異性很好［14］。俄羅斯科學(xué)家用人工方法合成了瘋牛病的普里昂蛋白質(zhì)，并培育出有彩色標(biāo)記、能攻擊正常的普里昂蛋白質(zhì)的抗體。檢測(cè)前先向腦組織中注入一種酶，這種酶只能與正常的普里昂融合在一起。由于人工抗體帶有彩色標(biāo)記，故顯微鏡下所有普里昂蛋白質(zhì)周圍都會(huì)出現(xiàn)彩色亮點(diǎn)。通過觀察這些蛋白質(zhì)是否與特殊酶發(fā)生融合，便可以分辨出是否有變異普里昂蛋白質(zhì)（未與特殊酶融合的）存在，從而可以斷定被測(cè)的牛是否患上BSE［15］。

2003年，英國(guó)根據(jù)瘋牛病感染牛出現(xiàn)異常的腦電圖的現(xiàn)象，將其作為瘋牛病的生前診斷，英國(guó)腦電圖診斷法作為法定的診斷方法［16］。同年，英國(guó)四家機(jī)構(gòu)的神經(jīng)學(xué)家和輻射學(xué)家稱，利用磁共振影像，以高功率將焦點(diǎn)集中于大腦的中央部位的尾丘腦。瘋牛癥典型特征的腦細(xì)胞喪失的形狀，就會(huì)在影像的黑斑中顯示出來(lái)，因此，也可利用此法進(jìn)行瘋牛病的診斷［17］。

2004年，美國(guó)北達(dá)科他州立大學(xué)（NDSU）科研人員研究出使用無(wú)線射頻識(shí)別技術(shù)（RFID）來(lái)檢測(cè)瘋牛病的方法［18］。

2005年，日本九州大學(xué)研究出對(duì)異常普里昂蛋白質(zhì)有特殊捕捉能力的有機(jī)分子和電化學(xué)顯色劑相結(jié)合的電極裝置檢測(cè)法，該方法不但精確度高，節(jié)約檢測(cè)時(shí)間，而且可以用于20個(gè)月以下小牛的檢測(cè)［19］。

2007年，德國(guó)科學(xué)計(jì)算跨學(xué)科中心和Heidelberg大學(xué)研究利用紅外光譜特征檢測(cè)活牛血清來(lái)診斷牛是否染上瘋牛病。同年，多位科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)構(gòu)成朊蛋白基因（PRNP）的多態(tài)性和瘋牛病的發(fā)生有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，通過該項(xiàng)檢測(cè)也可以間接確定瘋牛病的發(fā)生。

3　瘋牛病檢測(cè)技術(shù)研究發(fā)展方向

瘋牛病活體檢測(cè)是當(dāng)前和今后一段時(shí)間內(nèi)瘋牛病研究的難點(diǎn)和重點(diǎn)。目前已取得了一些進(jìn)展：除了前面所提到的尿液診斷法、腦電圖診斷法、磁共振影像法、無(wú)線射頻識(shí)別法、紅外光譜特征檢測(cè)活牛血清法、血纖維蛋白溶酶原早期檢測(cè)法。其他的方法還有：荷蘭研究的活體動(dòng)物采血檢測(cè)法；英國(guó)曼徹斯特大學(xué)利用心電圖來(lái)監(jiān)測(cè)在感染BSE的早期階段的心率變異信號(hào)，從而來(lái)檢測(cè)瘋牛病以及診斷人類變異克雅氏??；德國(guó)哥廷根大學(xué)開發(fā)出一種在活牛身上檢測(cè)瘋牛病的血液檢測(cè)法［20］。

我國(guó)目前沒有發(fā)現(xiàn)瘋牛病，但從其發(fā)病機(jī)理和我們與國(guó)外在畜牧業(yè)方面的貿(mào)易往來(lái)史看，仍然不能放松警惕。在歐洲真正認(rèn)識(shí)瘋牛病之前，我們從英國(guó)等歐洲國(guó)家引進(jìn)種羊和種牛的同時(shí)就有可能埋下了隱患。國(guó)內(nèi)基層對(duì)瘋牛病認(rèn)識(shí)不足，缺乏有效、快速的檢測(cè)手段，瘋牛病可能隨著經(jīng)濟(jì)交往和人員交流而形成全球化。所以目前當(dāng)務(wù)之急就是找到一種特異性高、簡(jiǎn)便、非創(chuàng)傷性和有早期診斷意義的檢測(cè)方法。鑒于目前對(duì)瘋牛病檢測(cè)試驗(yàn)需要的迫切性，相信這些問題很快會(huì)得到解決。

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