張麗娟　陶仕英　趙丕文　冒湘琳

(北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京，100029)

實(shí)驗(yàn)研究

順鉑建立大鼠卵巢早衰模型的實(shí)驗(yàn)研究

張麗娟陶仕英趙丕文冒湘琳

(北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京，100029)

目的：探討采用臨床常用藥物順鉑建立化療性損傷卵巢早衰動(dòng)物模型的方法。方法：通過觀察陰道脫落細(xì)胞選取有正常動(dòng)情周期的雌性SD大鼠60只隨機(jī)分為正常組，低劑量組和高劑量組。按4 mg/kg和6 mg/kg分別給予低、高劑量組腹腔注射順鉑注射液，每周1次，連續(xù)2周。每天觀察大鼠一般情況，體重，動(dòng)情周期。取材后測(cè)定血清中E2、FSH、LH和Pro含量，光鏡下觀察卵巢病理組織形態(tài)變化。結(jié)果：體重下降，動(dòng)情周期紊亂，動(dòng)情間期延長。與正常比較，高、低劑量組E2水平不同程度降低，F(xiàn)SH、LH水平升高(P<0.05)。孕酮含量各組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。卵泡計(jì)數(shù)減少。結(jié)論：化療藥物順鉑可致大鼠卵巢功能明顯衰退，卵泡發(fā)育障礙，生殖能力受損。為基礎(chǔ)研究建立穩(wěn)定的卵巢早衰動(dòng)物模型提供一種操作簡(jiǎn)單，成功率高，結(jié)果可靠的實(shí)驗(yàn)方法。

順鉑；卵巢早衰；大鼠；動(dòng)物模型

卵巢功能早衰(Premature Ovarian Failure，POF)是指婦女青春期發(fā)育后若在40歲前發(fā)生閉經(jīng)、卵巢萎縮、體內(nèi)雌激素水平低落、促性腺激素水平高達(dá)絕經(jīng)期水平的現(xiàn)象。是常見的婦科內(nèi)分泌疾病，近年來研究證實(shí)，由于卵巢早衰患者卵巢分泌的雌激素量減少，即可導(dǎo)致一些其他疾病，如骨質(zhì)疏松、泌尿生殖道萎縮、脂質(zhì)代謝紊亂、心血管類等疾病[1-4]。

順鉑是一種可以用來治療多種腫瘤的化療藥物，但又有一定的不良反應(yīng)，與卵巢的損害有直接關(guān)系[5-6]。有研究表明順鉑可誘導(dǎo)卵巢細(xì)胞凋亡，引起組織壞死，從而導(dǎo)致卵巢功能早衰[7-9]。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)這一原理建立化療性損傷卵巢早衰動(dòng)物模型。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雌性SD大鼠60只，體重190～210 g，均為清潔動(dòng)物，檢疫合格，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司提供。動(dòng)物飼養(yǎng)在室溫、自然光照的清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，食水充足。飼料為維通利華提供的普通大鼠飼料，飲水為去離子水。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑注射用順鉑(CDDP)，每支10 mg，由齊魯制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：H37021358。注射用順鉑用生理鹽水配制成0.5 mg/mL，按4 mg/kg、6 mg/kg腹腔注射。FSH批號(hào)：2014120；LH批號(hào)：20140120；Pro批號(hào)：1220，廠家：北京北方生物技術(shù)研究所。E2批號(hào)：0120，廠家：深圳拉爾文。亞甲基藍(lán)批號(hào)：A202031，國產(chǎn)。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象篩選適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，對(duì)大鼠進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞學(xué)涂片，連續(xù)7 d光鏡下觀察，篩選出動(dòng)情周期正常的60只健康雌性大鼠進(jìn)入正式實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分為正常組，低劑量組和高劑量組，每組20只。

2.2化療性損傷卵巢模型的建立低劑量組和高劑量組分別按4 mg/kg、6 mg/kg腹腔注射順鉑注射液，正常組腹腔注射1 mL生理鹽水。每周同一時(shí)間注射1次，連續(xù)2周。造模期間每天定時(shí)進(jìn)行陰道涂片實(shí)驗(yàn)，觀察動(dòng)情周期的變化，以確定造模成功。

2.3觀察大鼠情況每日觀察并記錄大鼠的進(jìn)食進(jìn)水情況，生命體征，行為活動(dòng)及體毛變化。每日上午9點(diǎn)進(jìn)行陰道涂片實(shí)驗(yàn)和體重測(cè)量。

2.4取材第2次注射7 d后，進(jìn)行取材。大鼠腹主動(dòng)脈取血，以3 000 r/min速度離心10 min，分離提取上層血清，存于-20 ℃冰箱待測(cè)。取大鼠雙側(cè)卵巢至于4%甲醛溶液中固定，經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋，進(jìn)行石蠟切片的制備。

2.5指標(biāo)檢測(cè)

2.5.1動(dòng)情周期檢測(cè)將棉簽蘸取少量生理鹽水徐徐插入大鼠陰道取少量分泌物，迅速在載玻片上朝單側(cè)轉(zhuǎn)動(dòng)，滴少量亞甲基藍(lán)溶液光鏡下觀察。

2.5.2激素水平檢測(cè)采用放免檢測(cè)FSH、E2、Pro和LH水平含量，實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑說明進(jìn)行試驗(yàn)。1)包被：用0.05 M PH9牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10 μg/mL。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1 mL，4 ℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，3 min/次。2)加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1 mL于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37 ℃孵育1 h。然后洗滌。(同時(shí)做空白孔對(duì)照)。3)加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1 mL。37 ℃孵育0.5～1 h，洗滌。4)加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1 mL，37 ℃10～30 min。5)終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05 mL。6)結(jié)果判定：在ELISA檢測(cè)儀上，于450 nm處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔值。

2.5.3HE染色觀察各級(jí)卵泡1)脫蠟：將石蠟切片至于二甲苯I、II、III中各10 min進(jìn)行脫蠟。2)復(fù)水：浸入梯度酒精和去離子水各3 min。3)染色：蘇木素溶液中5～10 min沖洗，鹽酸酒精分色3 s，沖水5～10 min反藍(lán)。伊紅溶液中1～3 min，蒸餾水洗2 s。4)脫水：95%乙醇I、II各5 s，無水乙醇I、II各5 min。5)固定：二甲苯I、II、III各5 min。6)封片：中性樹膠封片，靜置12 h。鏡下觀察各級(jí)卵泡。

3　結(jié)果

3.1大鼠一般情況正常組大鼠活動(dòng)、進(jìn)食正常，體毛光滑有光澤，有正常的動(dòng)情周期；不同劑量組大鼠給藥后體重均有不同程度下降，行動(dòng)緩慢，喜弓背、蜷縮，食欲下降，體毛晦暗無光澤，高劑量組更為明顯。正常組大鼠注射生理鹽水體重增加迅速且平穩(wěn)，不同劑量組注射順鉑4 d后較正常組體重均有不同程度的下降，而高劑量組在注射順鉑8 d體重較低劑量組明顯下降，各組大鼠體重變化(見圖1)。

圖1　各組大鼠體重變化對(duì)比柱狀圖

3.2不同劑量對(duì)大鼠動(dòng)情周期的影響正常大鼠動(dòng)情周期[10]4～5 d。分為四個(gè)階段，動(dòng)情前期：橢圓形有核上皮細(xì)胞占絕大多數(shù)，白細(xì)胞和角化上皮細(xì)胞很少。動(dòng)情期：角化上皮細(xì)胞占多大多數(shù)，由散在增至集塊，白細(xì)胞和有核上皮細(xì)胞很少。動(dòng)情后期：片狀角化上皮細(xì)胞，有核上皮細(xì)胞和白細(xì)胞3種都有，無太大差異。動(dòng)情間期：白細(xì)胞占絕大多數(shù)，有核上皮細(xì)胞和角化上皮細(xì)胞很少(見圖2)。低劑量組用藥后動(dòng)情周期紊亂，動(dòng)情間期延長，動(dòng)情縮短。但停用藥1周后部分大鼠動(dòng)情周期有所恢復(fù)。高劑量組大鼠動(dòng)情周期延長，甚至長期停留在動(dòng)情間期，不出現(xiàn)動(dòng)情期。停藥后1周動(dòng)情周期沒有恢復(fù)。

圖2　光鏡下40倍大鼠動(dòng)情周期陰道涂片

3.3大鼠血清中LH、FSH、E2及孕酮含量的變化從表1可以看出，高劑量組與正常組比較大鼠血的FSH值升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，卵泡對(duì)FSH敏感度降低是卵巢功能衰退的早期征象[5]。低劑量組血清中FSH較正常組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。順鉑對(duì)大鼠血清中孕酮含量的影響，給藥前后各組均無明顯差異。E2水平在給藥后2組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1　大鼠血清LH、FSH、E2及孕酮含量

3.4各大鼠卵巢形態(tài)學(xué)影響正常組大鼠卵巢增大，各級(jí)卵泡生長活躍，可見各級(jí)卵泡，且大多數(shù)為原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡和成熟卵泡，閉鎖卵泡很少。且卵泡顆粒細(xì)胞層較多，卵泡液豐富，黃體發(fā)育較好。而低劑量組原始卵泡和初級(jí)卵泡減少，閉鎖卵泡增加，黃體數(shù)量減少。高劑量組可見很少次級(jí)卵泡和成熟卵泡，大多數(shù)為閉鎖卵泡，卵泡顆粒細(xì)胞層明顯變薄，黃體明顯減少。(見圖3)

圖3　光鏡下40倍HE染色

4　討論

卵巢早衰是一種多病因所致的卵巢功能衰竭，但其具體發(fā)病機(jī)理仍不清楚，所以模型研究是深入探討疾病發(fā)生和發(fā)展的必要條件。有研究表明[11]順鉑對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的卵泡有不同程度的損傷，并可導(dǎo)致血清中相應(yīng)激素水平發(fā)生變化。因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)化療藥物順鉑建立大鼠卵巢早衰模型方法及可行性進(jìn)行探討。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出：大鼠在給予順鉑造模后[12-13]表現(xiàn)為弓背、蜷縮，行動(dòng)緩慢，食欲下降，體毛枯黃。陰道涂片顯示：低劑量組用藥后動(dòng)情，動(dòng)情周期延長，但停用藥一周后部分大鼠動(dòng)情周期有所恢復(fù)。高劑量組大鼠不僅長期停滯在動(dòng)情間期，且行陰道涂片時(shí)可感到陰道松弛，偶見血性分泌物。以上表現(xiàn)與臨床上婦女陰道成老年性改變相似。

FSH是檢測(cè)卵巢早衰的常用指標(biāo)，也用來判斷損傷程度[14-15]。卵泡對(duì)FSH敏感度降低是卵巢功能衰退的早期征象[16-17]，與臨床上血虛型閉經(jīng)相似[18]。本研究結(jié)果顯示低劑量組大鼠血清中FSH水平較正常組有所升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而高劑量組明顯高于正常組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。E2可促進(jìn)卵泡生長，改善卵巢功能，造模后血清中E2水平都有所降低，高劑量組更為明顯，自然導(dǎo)致卵泡發(fā)育，使卵巢受損。

卵巢功能完成的物質(zhì)基礎(chǔ)是初級(jí)卵泡的存在及發(fā)育，初級(jí)卵泡由原始卵泡發(fā)育而來，原始卵泡不能再生，他的破壞終將導(dǎo)致卵巢功能早衰[19-20]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果高劑量組可見原始卵泡，次級(jí)卵泡和成熟卵泡顯著減少，閉鎖卵泡明顯增加。提示：順鉑刺激了凋亡機(jī)制，導(dǎo)致大量卵泡停止發(fā)育繼而凋亡。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究給予大鼠不同劑量的順鉑注射后，卵巢功能出現(xiàn)不同程度的損傷，而高劑量組模型更為理想。本研究優(yōu)勢(shì)在于成功率高，模型穩(wěn)定，資源易得，費(fèi)用低廉，可作為探討卵巢早衰發(fā)病機(jī)制的動(dòng)物模型。

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(2014-09-28收稿責(zé)任編輯：張文婷)

Experimental study of Cisplatin in Establishment of Premature Ovarian Failure Model

Zhang Lijuan，Tao Shiying，Zhao Piwen，Mao Xianglin

(SchoolofBasicMedicalSciences,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective:To explore the method of establishing animal model with premature ovarian failure due to chemotherapy damage by using cisplatin clinical medicine. Methods:According to the observation of vaginal exfoliated cells, we divided 60 female SD rats with normal estrous cycle into normal group, low dose group and high dose group randomly. Low dose group were given 4 mg·kg-1intraperitoneal injection of Cisplatin and high dose group 6 mg·kg-1respectively. The injection was given once a week and lasting for two weeks. The general conditions, weight, estrous cycle of the rats were observed every day. The serum levels of E2, FSH, LH and progesterone levels were detected after ovarian. The pathological and morphological changes were also observed under optical microscope. Results: Weight loss, estrous cycle disorder, anestrus prolongation were observed. Compared with normal status, the E2levels of both high and low dose group decreased in different degree, while FSH, LH levels elevated.(P<0.05). No significant difference of progesterone was observed in both groups(P>0.05). Follicle also decreased. Conclusion: The declination of ovarian function of rats with cisplatin chemotherapy drugs is obvious, follicle development and reproductive capacity are impaired, which provides a simple, high success rated, and reliable method for animal model with premature ovarian failure.

Cisplatin; Premature ovary failure; Rat; Animal model

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81273887)；教育部大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：201310026056)；北京中醫(yī)藥大學(xué)自主選題項(xiàng)目(編號(hào)：2013-JYBZZ-JS-006)

張麗娟(1987—)，女，北京中醫(yī)藥大學(xué)2012級(jí)在讀研究生，研究方向：中醫(yī)婦科，E-mail：251197571@qq.com

陶仕英(1970—)，女，博士，副教授，研究方向：從事中西醫(yī)基礎(chǔ)研究，E-mail：taoshiying1970@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.10.029