翟獻(xiàn)斌 吳方云

(山東省泰安市中醫(yī)醫(yī)院骨科，泰安，271000)

接骨丹介導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖促進(jìn)骨折愈合的觀察

翟獻(xiàn)斌 吳方云

(山東省泰安市中醫(yī)醫(yī)院骨科，泰安，271000)

目的：觀察接骨丹對(duì)新西蘭乳兔成骨細(xì)胞增殖的影響，探討接骨丹促進(jìn)骨折愈合的機(jī)制。方法：普通級(jí)新西蘭大白乳兔，耳緣靜脈空氣栓塞處死，無菌條件下取顱蓋骨，Ⅰ型膠原酶消化法獲取成骨細(xì)胞并進(jìn)行體外培養(yǎng)、鑒定及傳代。將鑒定后的第二代成骨細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組,正常對(duì)照組應(yīng)用正常兔血清培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用接骨丹含藥血清培養(yǎng),MTT法觀測(cè)2組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線；不同血清干預(yù)48 h后，倒置顯微鏡觀測(cè)接骨丹對(duì)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶及Ⅰ型膠原表達(dá)的影響，Elisa法觀測(cè)接骨丹對(duì)成骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液中骨鈣素表達(dá)的影響。結(jié)果：Ⅰ型膠原酶消化法成功獲取并建立成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，MTT觀測(cè)顯示實(shí)驗(yàn)組能夠顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的增值，倒置顯微鏡觀測(cè)實(shí)驗(yàn)組中堿性磷酸酶及Ⅰ型膠原的表達(dá)要優(yōu)于正常對(duì)照組，并能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌骨鈣素。結(jié)論：接骨丹能夠促進(jìn)骨折的愈合，其機(jī)制可能與促進(jìn)成骨細(xì)胞中堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原及骨鈣素的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化有關(guān)。

接骨丹；含藥血清；成骨細(xì)胞；骨折愈合

骨折是臨床最常見的多發(fā)病，具有極其復(fù)雜的修復(fù)過程，受諸多因素的影響，包括患者本身因素，醫(yī)源性因素等。從微觀來看還受內(nèi)分泌激素、生物化學(xué)和生物物理因子的調(diào)控和微量元素的影響。臨床流行病學(xué)最新調(diào)查顯示約5%～10%骨折可因各種原因發(fā)生骨折遲緩愈合和不愈合，因此臨床針對(duì)如何促進(jìn)骨折愈合、縮短愈合時(shí)間的研究方興未艾。骨折屬于中醫(yī)學(xué)“血瘀證”的范疇，而骨科疾病首載于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，認(rèn)為骨折耗損氣血，致其運(yùn)行不暢，瘀積不散，因此“活血化瘀”是治療骨折的核心治則。

接骨丹具有“祛瘀、生新、合骨”的作用，亦是治療骨折的基本方劑，前期不乏研究證實(shí)接骨丹對(duì)骨折的治療具有理想療效，但關(guān)于接骨丹促折愈合的機(jī)理研究仍未明了，使得臨床上應(yīng)用接骨丹缺乏實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)，因此本研究旨在觀察接骨丹對(duì)體外培養(yǎng)的新西蘭兔成骨細(xì)胞增殖分化的影響，從而為接骨丹治療骨折提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 10只普通級(jí)新西蘭大白乳兔，雌雄各半，體重4.1～5.4 kg，平均(4.8±0.8)kg，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物合格證號(hào)為No.SCXK-(軍)2007-004。

1.1.2 主要試劑 接骨丹(規(guī)格10 g/包，由山東省泰安市中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供)并加工成每毫升含生藥0.1 g的藥液，密封4 ℃保存?zhèn)溆?、DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；MTT(Sigma公司)；山羊抗小鼠IgG標(biāo)記二抗(Biosharp公司)；DMSO(Sigma公司)；ECL發(fā)光液(碧云天)；β-acting(博奧森)；胰酶(Biosharp公司)；堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原及BGP單克隆抗體(北京中杉)。

1.1.3 含藥血清的制備 換算人與動(dòng)物的藥物等效劑量[1]，人與新西蘭兔的折算系數(shù)(W)為6.25，接骨丹等效給藥劑量(g)=人體用藥劑量(g/kg)×W×新西蘭兔的體重(g)/1 000 g=(20 g/60 kg)×6.25×新西蘭兔體重(g)/1 000 g。新西蘭兔連續(xù)灌胃5 d，于最后一次灌胃后3 h腹主動(dòng)脈采血，2 500 r/min離心25 min，于56 ℃水浴滅活30 min，過濾、分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 主要儀器 超凈工作臺(tái)(蘇州安泰公司)；CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)；倒置顯微鏡(日本OLYMPUS)；酶標(biāo)定量測(cè)定儀(Thermo Multiskan AsCant公司)；低溫高速離心機(jī)(美國Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 成骨細(xì)胞分離、培養(yǎng)、純化、傳代 普通級(jí)新西蘭大白乳兔，耳緣靜脈空氣栓塞處死，無菌條件下取顱蓋骨后立即置于預(yù)冷的0.01MPBS溶液中，將結(jié)締組織剔除干凈后再次使用0.01MPBS溶液清洗3次，隨后將顱蓋骨置于盛有DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用無菌剪刀將顱蓋骨剪成大小約0.5 mm×0.5 mm的碎塊，再加入5 mL 0.25%的胰酶消化20 min，隨后加入5 mL完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清)終止消化，摒棄上清液后加入10 mLⅠ型膠原酶，置于37 ℃、5%CO2孵箱中孵育90 min，隨后離心1 000 r/min×3 min，棄去上清，再用0.01MPBS溶液清洗3次后利用200目濾網(wǎng)過濾顱蓋骨碎片，加入5 mL完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清)，用巴士吸管輕輕吹大，使細(xì)胞懸浮，接種于培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2孵箱中孵育，24 h換液，以后隔天換液1次，棄去沒貼壁的細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿瓶底80%以上時(shí)，以0.25%的胰酶消化傳代，取第2代以后的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 成骨細(xì)胞鑒定 細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后接種于干凈無菌蓋玻片上，正常培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合率達(dá)到50%～80%時(shí)棄去培養(yǎng)液，PBS清洗1遍，丙酮：甲醇(1∶1)室溫固定30 min，3%H2O2去離子水室溫孵育10 min，封閉用山羊血清室溫孵育30 min，滴加一抗4 ℃孵育過夜，滴加山羊抗小鼠IgG標(biāo)記二抗37 ℃孵育30 min，避光，隨后置于倒置顯微鏡下觀察。每部操作之間均用PBS洗3×5 min。

1.2.3 MTT法測(cè)細(xì)胞增殖情況 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞密度調(diào)整為2×104個(gè)/ mL，接種于24孔板，37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，將實(shí)驗(yàn)分為正常組及實(shí)驗(yàn)組，各組6個(gè)復(fù)孔，24 h后用培養(yǎng)基進(jìn)行同步消化24 h。正常對(duì)照組：給予不含藥DMEM完全培養(yǎng)液；實(shí)驗(yàn)組：含體積分?jǐn)?shù)為10%的接骨丹含藥血清的DMEM完全培養(yǎng)液。分別于加藥1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 d后，每孔加入20 μL 5 g/L MTT，繼續(xù)孵育4 h后，吸棄上清，每孔加入DMSO150 μL，振蕩10 min，酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處讀取OD值。

1.2.4 堿性磷酸酶及Ⅰ型膠原表達(dá)情況 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞密度調(diào)整為2×104個(gè)/ mL后制成細(xì)胞涂片，4%多聚甲醛40 ℃固定過夜，0.01M PBS充分沖洗、晾干，3%H2O2室溫孵育20 min，0.01M PBS沖洗，滴加30 μL/片羊血清封閉液，室溫30 min后傾去，滴加1∶100稀釋的一抗30 μL/片(0.01M PBS稀釋)，置濕盒內(nèi)4 ℃過夜，0.01M PBS洗(5 min×3)，滴加1∶200稀釋的生物素化二抗30 μL/片(0.01M PBS稀釋)，37 ℃濕盒內(nèi)溫育30 min，0.01M PBS洗(5 min×3)，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素30 μL/片，37 ℃孵育30 min，0.01M PBS洗(5 min×3)，DAB顯色，鏡下觀察顯色后充分水洗，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片，隨后置于倒置顯微鏡下觀察。

1.2.5 骨鈣素(BGP)的表達(dá)情況 干預(yù)成骨細(xì)胞48 h后，將收集的細(xì)胞在4 ℃條件下進(jìn)行3 000 g離心5 min后用高壓槍頭吸取離心后的上清液，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)進(jìn)行檢測(cè)，利用抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合原理進(jìn)行相關(guān)因子濃度的檢測(cè)，具體步驟如下：用0.05M pH9.6碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10 μg/mL。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1 mL，4 ℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3 min。加一定稀釋的待檢樣品0.1 mL于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37 ℃孵育1 h。然后洗滌。同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽性對(duì)照孔。隨后在各反應(yīng)孔中加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1 mL。37 ℃孵育0.5～1 h，洗滌。再于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1 mL，37 ℃10～30 min。于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05 mL。試劑盒由廣州達(dá)安基因股份有限公司提供，顯色后采用492 nm波長(zhǎng)，TMB反應(yīng)產(chǎn)物檢測(cè)需要450 nm波長(zhǎng)。檢測(cè)時(shí)一定要首先進(jìn)行空白孔系統(tǒng)調(diào)零，用測(cè)定標(biāo)本孔的吸收值與一組陰性標(biāo)本測(cè)定孔平均值的比值(P/N)表示。以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽性。操作過程全部按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 成骨細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定 分離的成骨細(xì)胞在培養(yǎng)24 h后，活細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，死細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)液中。培養(yǎng)第5天，骨膜成骨細(xì)胞成放射狀貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)多為梭形和多邊形，核內(nèi)可見兩三個(gè)核仁，輪廓清晰，飽滿透明，立體感強(qiáng)，培養(yǎng)10 d左右基本鋪滿整個(gè)瓶，見圖1。

圖1 第二代成骨細(xì)胞的鏡下形態(tài)

注：A：第二代成骨細(xì)胞(100倍)；B：第二代成骨細(xì)胞(200倍)

2.2 接骨丹含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響 MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：加入接骨丹含藥血清培養(yǎng)后對(duì)成骨細(xì)胞具有明顯的增殖作用，且呈現(xiàn)一定的時(shí)間依賴性，見圖2。

2.3 接骨丹含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞中Ⅰ型膠原表達(dá)的影響 免疫組化染色顯示，正常對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組中成骨細(xì)胞胞漿均呈棕黃色，其中可見黃褐色顆粒，細(xì)胞外也可見到棕黃色染色。與正常對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組中成骨細(xì)胞不僅數(shù)量增多，而且經(jīng)免疫組化染色后其陽性表達(dá)顏色變深，見圖3。

圖2 接骨丹對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響

圖3 Ⅰ型膠原免疫組化染色(200×)

注：(A)為實(shí)驗(yàn)組；(B)為正常對(duì)照組

2.4 接骨丹含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞中堿性磷酸酶表達(dá)的影響 免疫組化染色顯示，正常對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組中成骨細(xì)胞中均有灰黑至深黑色的顆粒狀或片狀沉淀。與正常對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組中成骨細(xì)胞不僅數(shù)量增多，而且經(jīng)免疫組化染色后其陽性表達(dá)顏色變深，見圖4。

圖4 堿性磷酸酶疫組化染色(200×)

注：(A)為實(shí)驗(yàn)組；(B)為正常對(duì)照組

圖5 48 h時(shí)各組成骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液中骨鈣素表達(dá)的比較

注：2為實(shí)驗(yàn)組成骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液中骨鈣素蛋白表達(dá)柱狀圖，與正常對(duì)照組比較aP<0.05。1：正常對(duì)照組；2：實(shí)驗(yàn)組

2.5 接骨丹含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞中BGP表達(dá)的影響 采用Elisa法檢測(cè)成骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液中骨鈣素的表達(dá)，研究結(jié)果表明2組細(xì)胞上清液中均有骨鈣素的表達(dá)，與正常對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的骨鈣素的表達(dá)明顯增高(P<0.05)，見圖5。

3 討論

自春秋戰(zhàn)國時(shí)期起已有中醫(yī)藥治療骨折的記載，中醫(yī)角度認(rèn)為骨折的愈合經(jīng)歷“瘀去、新生、骨合”三個(gè)環(huán)節(jié)，在整體觀和辨證論治的指導(dǎo)下中醫(yī)強(qiáng)調(diào)綜合運(yùn)用整復(fù)、外固定、練功及內(nèi)外用藥綜合運(yùn)用，此四大療法隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)進(jìn)步而不斷更新，其中內(nèi)外用藥已然成為各醫(yī)家研究的重點(diǎn)[2-3]。中醫(yī)理論認(rèn)為肝主筋，腎主骨生髓，骨的生長(zhǎng)愈合依賴精血的濡養(yǎng)，肝腎虧虛可導(dǎo)致骨生化無源，筋骨失養(yǎng)，而筋骨斷損容易傷及肝腎，補(bǔ)肝益腎是促進(jìn)骨折愈合的重點(diǎn)。接骨丹主要成分補(bǔ)碎骨、續(xù)斷及杜仲均是補(bǔ)肝益腎之良藥，共奏接骨續(xù)筋之功；龜甲、熟地黃滋陰降火，補(bǔ)腎健骨；自然銅接骨續(xù)筋；土鱉蟲、乳香、沒藥活血祛瘀止痛合為臣藥；云茯苓、白術(shù)、陳皮健脾和胃為佐使藥?，F(xiàn)代藥理檢測(cè)發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)具有促進(jìn)蛋白多糖合成的效應(yīng)，而蛋白多糖是促進(jìn)鈣化的主要因子，起通過加速鈣磷沉積促進(jìn)骨的生長(zhǎng)發(fā)育[4]；二氧化硫是自然銅的主要成分可加速骨痂形成及增強(qiáng)骨的抗撕力；有研究人員通過透射電鏡發(fā)現(xiàn)土鱉蟲提取物可以促進(jìn)組織血管新生，促進(jìn)骨周圍組織的血供，促進(jìn)肉芽組織的生長(zhǎng)[5]。接骨丹全方實(shí)現(xiàn)活血養(yǎng)血、接骨連筋通絡(luò)的功效。

近年來不少學(xué)者基于中醫(yī)理論體系，以現(xiàn)代科學(xué)檢測(cè)手段為媒介，從不同視角探討中醫(yī)藥促進(jìn)骨折愈合的機(jī)理[6-11]。以往不少報(bào)道從病理切片、影像學(xué)、血液流變學(xué)等宏觀角度探討干預(yù)手段促進(jìn)骨折愈合的機(jī)理，近些年，隨著分子生物學(xué)的日益發(fā)展，使從細(xì)胞水平探討接骨丹作用機(jī)理成為可能。我們以成骨細(xì)胞為研究對(duì)象，成骨細(xì)胞是一類具有多向分化能力的充質(zhì)干細(xì)胞，它的分化是骨形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨功能是治療骨折的基礎(chǔ)。我們采用MTT法檢測(cè)含有接骨丹血清對(duì)新西蘭兔成骨細(xì)胞增殖的影響發(fā)現(xiàn)加入接骨丹含藥血清培養(yǎng)后對(duì)成骨細(xì)胞具有明顯的增殖作用，且呈現(xiàn)一定的時(shí)間依賴性。再進(jìn)一步檢測(cè)成骨細(xì)胞分化功能中我們檢測(cè)了堿性磷酸酶在不同組別的表達(dá)，堿性磷酸酶是一種公認(rèn)的鑒定成骨細(xì)胞分化的重要表型之一，成骨細(xì)胞分泌堿性磷酸酶可促使無機(jī)磷酸鹽水解，從而減輕其對(duì)骨鹽形成抑制效應(yīng)，有利于骨形成。隨著成骨細(xì)胞的不斷分化堿性磷酸酶表達(dá)不斷增加，堿性磷酸酶的活性越強(qiáng)預(yù)示著成骨細(xì)胞骨形成狀況越理想[12-15]。研究中我們證實(shí)雖然不同組別均有堿性磷酸酶表達(dá)，但是經(jīng)過含有接骨丹血清培養(yǎng)后的細(xì)胞堿性磷酸酶表達(dá)更明顯，且Ⅰ型膠原表達(dá)越高，說明接骨丹可以通過促進(jìn)堿性磷酸酶的合成、Ⅰ型膠原表達(dá)的增加而發(fā)揮誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖分化。BGP是一種由成骨細(xì)胞合成和分泌的非膠原蛋白，其在調(diào)控軟骨礦化發(fā)揮重要作用，研究中我們還發(fā)現(xiàn)含接骨丹血清可上調(diào)成骨細(xì)胞BGP的濃度，說明接骨丹提高了成骨細(xì)胞的礦化能力，促使膠原鈣化，從而達(dá)到增加骨量的目的。

總之，接骨丹能夠促進(jìn)骨折的愈合，其機(jī)制可能與促進(jìn)成骨細(xì)胞中堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原及骨鈣素的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化有關(guān)。

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(2015-05-12收稿 責(zé)任編輯：徐穎)

The Observation of Bone-Joining Elixir Mediated Osteoblast Proliferation to Promote Fracture Healing

Zhai Xianbin, Wu Fangyun

(DepartmentofOrthopedics,TaianChineseMedicineHospital,Tai'an271000,China)

Objective: To observe the effect of Bone-Joining Elixir on New Zealand newborn rabbit osteoblast proliferation, and explore the promoting fracture healing mechanism of Bone-Joining Elixir. Methods: Conventional grade New Zealand big and white newborn rabbits were put to death by ear venous air embolism, the craniums were taken down in aseptic conditions, and the osteoblasts were gained by collagenase type Ⅰ digestion method for in vitro culture, identification and passages. After identification, the second generation of osteoblasts was randomly divided into normal control group and experimental group. And the normal control group was cultured in normal rabbit serum, the experimental group was cultured in Bone-Joining Elixir medicated serum, MTT method was taken to observe the cell growth curves of the two groups. After the intervention for 48 h, the two serums were observed to achieve the influence of Bone-Joining Elixir on the expression of osteoblast alkaline phosphatase and collagen typeⅠ under the inverted microscope, and to achieve the influence of Bone-Joining Elixir on the expression of osteocalcin in the supernate in the osteoblast culture by Elisa method.Results: The osteoblast culture system in vitro has been successfully obtained and established by the collagenase type Ⅰ digestion method, MTT observation indicated the experimental group show significant promotion on the proliferation of osteoblasts, and the inverted microscope indicated the expression of alkaline phosphatase and collagen type Ⅰ in the experimental group was superior to the normal control group, and the osteoblast was promoted to secrete osteocalcin. Conclusion: The Bone-Joining Elixir can promote the healing of fracture, the mechanism may be related to the promotion of the expression of alkaline phosphatase, collagen type Ⅰ and osteocalcin in osteoblasts to help osteoblasts proliferate and differentiate.

Bone-Joining Elixir; Medicated Serum; Osteoblast; Fracture Healing

山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2011-284)

翟獻(xiàn)斌(1970.2—)，男，漢族，山東泰安人，副主任醫(yī)師，本科學(xué)歷，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療脊柱病，E-mail：13853880212@163.com

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10.3969/j.issn.1673-7202.2015.10.033