虞一聰，馮 娜，閆飛虎，蓋微微，王鐵成，王化磊，3，鄭學(xué)星，3，趙永坤，3，黃 耕，楊松濤，高玉偉，夏咸柱，3，4*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130122；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院長(zhǎng)春獸醫(yī)研究所，長(zhǎng)春 130122；4.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009)

犬瘟熱病毒囊膜糖蛋白在桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)中的表達(dá)及鑒定

虞一聰1，2，馮 娜2，3*，閆飛虎2，蓋微微2，王鐵成2，王化磊2，3，鄭學(xué)星2，3，趙永坤2，3，黃 耕2，楊松濤2，高玉偉2，夏咸柱2，3，4*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130122；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院長(zhǎng)春獸醫(yī)研究所，長(zhǎng)春 130122；4.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009)

為表達(dá)具有天然構(gòu)象的犬瘟熱病毒(CDV)囊膜糖蛋白融合蛋白(F)和血凝素蛋白(H)，本研究擴(kuò)增小熊貓?jiān)碈DV馴化致弱株LP的F、H基因，克隆至pFastBacTM1載體中，測(cè)序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)化至DH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞，同源重組獲得穿梭質(zhì)粒rBacmid-F、rBacmid-H，將其分別轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞獲得重組桿狀病毒rpFB-F、rpFB-H，并將表達(dá)的重組融合蛋白(rF)和血凝素蛋白(rH)進(jìn)行IFA和Western blot鑒定。以犬抗CDV高免血清對(duì)重組桿狀病毒感染細(xì)胞進(jìn)行IFA鑒定，在感染細(xì)胞的細(xì)胞膜上可見(jiàn)特異性熒光反應(yīng)；以鼠抗F、H蛋白的主要抗原表位區(qū)多克隆抗體對(duì)重組桿狀病毒感染細(xì)胞進(jìn)行Western blot檢測(cè)，可見(jiàn)相對(duì)分子質(zhì)量為63和68 ku左右的條帶，分別為重組融合蛋白(rF)和血凝素蛋白(rH)，大小與預(yù)期相符。兩種囊膜糖蛋白在桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)中均成功表達(dá)，且具有良好的反應(yīng)原性。本研究為CDV病毒樣顆粒疫苗的開(kāi)發(fā)等工作奠定了基礎(chǔ)。

犬瘟熱病毒；融合蛋白；血凝素蛋白；桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)

犬瘟熱(canine distemper，CD)是由副黏病毒科麻疹病毒屬的犬瘟熱病毒(canine distemper virus，CDV)引起犬科動(dòng)物的一種高度傳染性、致死性疾病，全世界廣泛分布[1]。該病的傳染性強(qiáng)，發(fā)病率高，臨床癥狀多樣，容易繼發(fā)混合感染和二次感染[2]。近年來(lái)，CDV自然感染宿主不斷擴(kuò)大，除犬科動(dòng)物外，還可感染大熊貓、小熊貓和虎等珍稀野生動(dòng)物[3-5]，且已擴(kuò)大到非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物[6]，嚴(yán)重危害我國(guó)乃至世界養(yǎng)犬業(yè)、經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)和野生動(dòng)物保護(hù)業(yè)。目前對(duì) CD 尚無(wú)特效的治療藥物和方法，疫苗接種是唯一有效的防制措施[7]。

CDV為單股、負(fù)鏈、不分節(jié)段的RNA病毒。其主要結(jié)構(gòu)蛋白有核衣殼蛋白(N)、磷蛋白(P)、大蛋白(L)、基質(zhì)膜蛋白(M)、融合蛋白(F)、附著或血凝素蛋白(H)。負(fù)鏈RNA基因組被螺旋形衣殼包裹，形成核衣殼結(jié)構(gòu)，外面由雙層囊膜包裹。CDV囊膜上有1.3 nm的桿狀纖突，纖突由兩種囊膜糖蛋白F和H蛋白組成，纖突只含血凝素，而無(wú)神經(jīng)氨酸酶[8]。融合蛋白(F)和血凝素蛋白(H)是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒侵入宿主細(xì)胞的過(guò)程中共同介導(dǎo)細(xì)胞膜發(fā)生融合，同時(shí)也是誘導(dǎo)中和抗體的主要免疫原[9]。H蛋白使病毒趨向并接近敏感細(xì)胞，F(xiàn)蛋白是病毒和宿主細(xì)胞融合過(guò)程中所必需的，在病毒感染過(guò)程中，H和F蛋白兩者缺一不可。具有中和活性的抗H蛋白抗體和抑制細(xì)胞融合的抗F抗體，在抗犬瘟熱病毒的感染機(jī)制中也發(fā)揮了重要的作用[10]。本研究以實(shí)驗(yàn)室馴化致弱的小熊貓?jiān)碈DV LP毒株為模板擴(kuò)增F、H基因，并將目的基因克隆到表達(dá)載體pFastBacTM1，利用桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，并以犬抗CDV高免血清及鼠抗CDV F、H蛋白多克隆抗體對(duì)重組病毒蛋白質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)原性鑒定，為后期亞單位疫苗尤其是病毒樣顆粒疫苗的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Bac-to-Bac?Baculovirus Expression System)、Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑和Sf9細(xì)胞購(gòu)自Invitrogen 公司；ExTaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶購(gòu)自大連寶生物技術(shù)公司；質(zhì)粒快速提取試劑盒、DNA膠回收純化試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA biotek公司；基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自Axygen公司；Grace’s昆蟲(chóng)培養(yǎng)基購(gòu)自AppliChem 公司；BacPAKTMBaculovirus Rapid Titer Kit試劑盒購(gòu)自Clontech公司；His標(biāo)簽鎳離子蛋白純化柱(HisPurTMNi-NTA Spin Columns)和SuperSignal West Dura持久性化學(xué)發(fā)光底物購(gòu)自Thermo scientific公司；熒光素(FITC)標(biāo)記羊抗犬IgG 購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記兔抗鼠IgG購(gòu)自Bioworld公司。

CDV LP馴化致弱毒株F、H基因cDNA克隆質(zhì)粒pMD18-T-CDV-F、pMD18-T-CDV-H、感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α、BL21(DE3)、犬抗CDV高免血清均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所動(dòng)物病毒學(xué)與特種動(dòng)物疫病學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；6周齡BALB/c小鼠購(gòu)自長(zhǎng)春生物制品研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 目的基因的擴(kuò)增及純化

以pMD18-T-CDV-F和pMD18-T-CDV-H為模板，PCR擴(kuò)增F、H基因(CDV F For：5′-CGAGGATCCATGCACAACAAAATCCCCAAAATAT-CC-3′，CDV F Rev：5′-ATAGCGGCCGCTCAGA-GTGATCTTACATAGG-3′；CDV H For：5′-CGA-GGATCCATGCTCTCCTACCAAGA-3′，CDV H Rev：5′-ATAGCGGCCGCTCAAGGTTTTGAACGG-3′；下劃線部分為BamHⅠ、NotⅠ酶切位點(diǎn))。反應(yīng)體系：ExTaqDNA聚合酶(5 U·μL-1)0.5 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 8 μL，上、下游引物(20 μmol·L-1)各1 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1)4 μL，10× ExTaqBuffer 5 μL，加ddH2O補(bǔ)足至總體積50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增的目的片段膠回收純化后4 ℃保存。

1.3 重組供體質(zhì)粒的構(gòu)建

將目的片段和pFastBacTM1載體均分別用BamHⅠ、NotⅠ進(jìn)行雙酶切，37 ℃作用2 h，酶切片段和載體純化后在T4DNA連接酶作用下于16 ℃連接過(guò)夜。連接體系(20 μL)：載體4 μL，目的片段10 μL，10×緩沖液2 μL，T4DNA連接酶2 μL，用ddH2O補(bǔ)足至總體積20 μL。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α。提取陽(yáng)性重組質(zhì)粒pFastBacTM1-F和pFastBacTM1-H，經(jīng)PCR及雙酶切鑒定正確后送至長(zhǎng)春庫(kù)美生物公司測(cè)序。

1.4 重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建

參考Invitrogen公司Bac-to-Bac?Baculovirus Expression System操作手冊(cè)，分別將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pFastBacTM1-F和pFastBacTM1-H轉(zhuǎn)化至含桿狀病毒穿梭載體的感受態(tài)細(xì)胞DH10BacTM，37 ℃培養(yǎng)48 h，通過(guò)藍(lán)白斑篩選，挑取白色陽(yáng)性菌落，抽提純化重組桿狀病毒質(zhì)粒，并用M13通用引物和CDV FF/CDV FR、CDV HF/CDV HR同時(shí)進(jìn)行PCR鑒定，將鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒分別命名為rBacmid-F和rBacmid-H。

1.5 重組桿狀病毒的制備

利用脂質(zhì)體Lipofectamine?2000將rBacmid-F和rBacmid-H轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，于27 ℃培養(yǎng)96 h，待細(xì)胞出現(xiàn)病變后，收集細(xì)胞上清獲得重組桿狀病毒?；蚪MDNA提取試劑盒抽提病毒基因組DNA，分別用M13通用引物和特異性引物PCR驗(yàn)證CDVF和H基因在純化病毒中是否獲得穩(wěn)定重組，重組病毒分別命名為rpFB-F和rpFB-H。擴(kuò)增種毒至第3代，并按BacPAKTMBaculovirus Rapid Titer Kit試劑盒對(duì)種毒進(jìn)行滴定，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 間接免疫熒光

將上述rpFB-F和rpFB-H種毒液按1∶20體積比感染Sf9細(xì)胞，并以野生型桿狀病毒作為對(duì)照，于27 ℃培養(yǎng)48 h，棄細(xì)胞上清液，用PBS洗滌后用3%多聚甲醛室溫固定30 min。以1∶100倍稀釋的犬高免血清和犬陰性血清為一抗，室溫孵育1 h。PBST洗滌后加入1∶200倍稀釋的熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗犬二抗，室溫避光作用1 h，PBST洗滌后熒光顯微鏡(Olympus Corp，Tokyo，Japan)觀察結(jié)果。

1.7 F和H蛋白主要抗原表位區(qū)多克隆抗體的制備

1.7.1 F和H片段的原核表達(dá) 應(yīng)用在線生物分析軟件BepiPred分析CDV LP弱毒株F、H蛋白的氨基酸序列，預(yù)測(cè)F、H基因的主要抗原表位區(qū)片段，去除跨膜區(qū)和信號(hào)肽序列，結(jié)合pET-30a(+)表達(dá)載體，利用Primer Premier 5.0軟件，分別設(shè)計(jì)合成CDV-F-pET30-F 5′-GAATTCCAATCCAACCTCAATGC-3′(下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn))和CDV-F-pET30-R 5′-CTCGAGCCTAACCGT-CTCAAGG-3′(下劃線部分為XhoⅠ酶切位點(diǎn))為引物PCR擴(kuò)增F基因1 050 bp片段(第751—1 800 bp)；分別設(shè)計(jì)合成CDV-H-pET30-F 5′-GATATCATCTCAGACGGAGTGTAT-3′(下劃線部分為EcoRⅤ酶切位點(diǎn))和CDV-H-pET30-R 5′-CTCGAGGGTTGTAAAGTTGGTGATGT-3′(下劃線部分為XhoⅠ酶切位點(diǎn))為引物PCR擴(kuò)增H基因1 104 bp片段(第667—1 770 bp)。分別以pMD18-T-CDV-F和pMD18-T-CDV-H為模板PCR擴(kuò)增F、H蛋白胞外主要抗原表位區(qū)(體系同1.2)，克隆至pET-30a(+)表達(dá)載體，構(gòu)建成與His標(biāo)簽融合表達(dá)的重組質(zhì)粒pET-30a(+)-Fec、pET-30a(+)-Hec，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)表達(dá)菌株后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)融合蛋白質(zhì)表達(dá)。表達(dá)的目的蛋白質(zhì)經(jīng)His標(biāo)簽鎳離子蛋白質(zhì)純化柱(HisPurTMNi-NTA Spin Columns)純化后，進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.7.2 重組抗原免疫血清的制備 將純化的重組F、H蛋白與弗氏完全佐劑等體積乳化，肌肉注射免疫6周齡BALB/c小鼠，50 μg·只-1。2周后將重組蛋白質(zhì)與弗氏不完全佐劑等體積乳化進(jìn)行第2和第3次免疫，間隔2周。三免后2周眼球采血，分離血清。

1.8 Western blot

參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行[11]。將上述rpFB-F和rpFB-H種毒液按1∶10體積比感染正常Sf9細(xì)胞，72 h后3 000 r·min-1離心10 min收獲感染細(xì)胞，PBS離心洗滌，按原培養(yǎng)液10%體積加入PBS懸起細(xì)胞，反復(fù)凍融3次，離心后收獲上清，制備成細(xì)胞裂解抗原液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并電轉(zhuǎn)印至PVDF膜，封閉液室溫封閉2 h；分別以鼠抗CDV F、H蛋白主要抗原表位區(qū)多克隆抗體(1∶100倍稀釋)為一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；以辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記兔抗鼠IgG(1∶2 000倍稀釋)為二抗，室溫孵育1 h，加入SuperSignal West Dura持久性化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 含目的基因的重組Bacmid的篩選與鑒定

首先將CDV F和H基因亞克隆至pFastBacTM1，將鑒定正確的穿梭質(zhì)粒pFastBacTM1-F和pFastBacTM1-H轉(zhuǎn)化至DH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞后，經(jīng)含卡那霉素、四環(huán)素和慶大霉素的平板篩選，抽提質(zhì)粒分別進(jìn)行PCR鑒定，以M13F/M13R為引物PCR擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為4 289 bp和4 124 bp的特異產(chǎn)物，以CDV FF/CDV FR和CDV HF/CDV HR為引物獲得約為1 989 bp和1 824 bp的特異產(chǎn)物，與理論值相符(圖1)，表明重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒rBacmid-F和rBacmid-H構(gòu)建成功。

2.2 重組桿狀病毒的制備

將rBacmid-F和rBacmid-H分別轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf9細(xì)胞，27 ℃連續(xù)培養(yǎng)96 h，收獲P1代重組桿狀病毒，然后將重組桿狀病毒連續(xù)傳3代，感染Sf9細(xì)胞48 h后均可見(jiàn)細(xì)胞變大、變圓，細(xì)胞間隙增大，停止生長(zhǎng)，由貼壁變?yōu)槊撀淦?，感染末期?xì)胞溶解破裂等典型致細(xì)胞病變效應(yīng)。將擴(kuò)增的第三代種毒rpFB-F P3用BacPAKTMBaculovirus Rapid Titer Kit試劑盒對(duì)種毒進(jìn)行滴定，鏡下可見(jiàn)散在的染色斑點(diǎn)，結(jié)果顯示，rpFB-F滴度為8.0×107IFU·mL-1(圖2)，應(yīng)用同樣的方法測(cè)得rpFB-H P3滴度為8.4×107IFU·mL-1。

M1.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；M2.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.M13引物鑒定重組質(zhì)粒rBacmid-H；2.特異性引物鑒定重組質(zhì)粒rBacmid-H；3.M13引物鑒定Bacmid陰性對(duì)照；4.M13引物鑒定重組質(zhì)粒rBacmid-F；5.特異性引物鑒定重組質(zhì)粒rBacmid-FM1.λ-EcoT14 I digest DNA marker；M2.DL2000 DNA marker；1.PCR products from rBacmid-H with M13F/M13R；2.PCR products from rBacmid-H with CDV HF/HR；3.PCR products from Bacmid with M13F/F13R;4.PCR products from rBacmid-F with M13F/M13R；5.PCR products from rBacmid-F with CDV FF/FR圖1 重組質(zhì)粒rBacmid-F和rBacmid-H的鑒定Fig.1 Identification of rBacmid-F and rBacmid-H

2.3 重組桿狀病毒 IFA 鑒定

分別以rpFB-F和rpFB-H感染Sf9細(xì)胞48 h，棄細(xì)胞上清液，用3%多聚甲醛室溫固定30 min以犬抗CDV高免血清為一抗及FITC標(biāo)記羊抗犬IgG為二抗進(jìn)行免疫熒光染色。熒光顯微鏡觀察可見(jiàn)rpFB-F和rpFB-H感染Sf9細(xì)胞膜均顯示較強(qiáng)的陽(yáng)性熒光信號(hào)(圖3A和3B)，而野生型桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞(圖3C)和未感染病毒細(xì)胞的熒光信號(hào)均呈陰性(圖3D)。結(jié)果表明重組桿狀病毒能在昆蟲(chóng)細(xì)胞中高效表達(dá)CDV囊膜糖蛋白，且能夠被犬抗CDV高免血清特異性識(shí)別。

2.4 F和H蛋白主要抗原表位區(qū)的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備

將pET-30a(+)-Fec、pET-30a(+)-Hec分別轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后以鎳離子蛋白質(zhì)純化柱對(duì)目的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，SDS-PAGE可見(jiàn)單一的大小約為40和46 ku的目的片段(圖4)。將純化的重組F、H蛋白與弗氏佐劑乳化后，肌肉注射連續(xù)免疫3次，每次間隔2周，制備鼠多克隆抗體。

2.5 重組CDV F和H蛋白Western blot檢測(cè)

Western blot檢測(cè)桿狀病毒表達(dá)的重組融合蛋白(rF)和血凝素蛋白(rH)與鼠抗主要抗原表位區(qū)多克隆抗體的反應(yīng)性，結(jié)果顯示分別在63和68 ku左右處有清晰的特異的反應(yīng)條帶，大小與預(yù)期值相符(圖5)，表明獲得的兩種重組蛋白質(zhì)具有良好的反應(yīng)原性。

A.重組桿狀病毒103稀釋；B.重組桿狀病毒104稀釋；C.重組桿狀病毒105稀釋；D.陰性對(duì)照A.Dilutions of 103 of recombinant baculovirus；B.Dilutions of 104 of recombinant baculovirus；C.Dilutions of 105 of recombinant baculovirus；D.Negative control圖2 重組桿狀病毒rpFB-F滴定Fig.2 Titration of recombinant baculovirus rpFB-F

A.重組桿狀病毒rpFB-F感染的Sf9細(xì)胞；B.重組桿狀病毒rpFB-H感染的Sf9細(xì)胞；C.野生型桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞；D.正常Sf9細(xì)胞對(duì)照A.Sf9 cells infected with rpFB-F；B.Sf9 cells infected with rpFB-H；C.Sf9 cells infected with wild baculovirus；D.Normal Sf9 cells as control group圖3 IFA檢測(cè)重組蛋白質(zhì)rF和 rH的表達(dá)Fig.3 Identification of expressed rF and rH by IFA

M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.未純化F蛋白SDS-PAGE檢測(cè)；2.純化F蛋白SDS-PAGE檢測(cè)；3.未純化H蛋白SDS-PAGE檢測(cè)；4.純化H蛋白SDS-PAGE檢測(cè)M.Protein molecular weight marker；1.Detection of unpurified F protein by SDS-PAGE；2.Detection of purified F protein by SDS-PAGE；3.Detection of unpurified H protein by SDS-PAGE；4.Detection of purified H protein by SDS-PAGE圖4 原核表達(dá)F、H蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)Fig.4 Detection of prokaryotic expressed F and H protein by SDS-PAGE

M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.野生型桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞；2.重組桿狀病毒rpFB-F感染的Sf9細(xì)胞；3.野生型桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞；4.重組桿狀病毒rpFB-H感染的Sf9細(xì)胞M.Protein molecular weight marker；1.Sf9 cells infected with wild baculovirus；2.Sf9 cells infected with rpFB-F；3.Sf9 cells infected with wild baculovirus；4.Sf9 cells infected with rpFB-H圖5 重組蛋白質(zhì)rF和rH的Western blot檢測(cè)Fig.5 Detection of rF and rH by Western blot

3 討 論

犬瘟熱呈世界性分布，擁有廣泛的哺乳動(dòng)物宿主[12-13]。疫苗免疫在20世紀(jì)20年代已有研究和使用，滅活疫苗因誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體下降快，抗原性差且僅能誘導(dǎo)體液免疫，免疫時(shí)間短等缺點(diǎn)，現(xiàn)已很少使用[14]。國(guó)內(nèi)外對(duì)犬瘟熱的預(yù)防仍然主要依賴于弱毒疫苗，由于不同動(dòng)物對(duì)CDV 的敏感性存在差異，弱毒苗對(duì)野生食肉動(dòng)物和某些免疫缺陷幼犬的毒力過(guò)強(qiáng)、安全性差[15-16]，且在使用過(guò)程中存在熱穩(wěn)定差、易受母源抗體干擾等缺陷[17]。因此，亟需更安全有效的新型疫苗防控犬瘟熱的流行，其中基因工程疫苗是研究開(kāi)發(fā)的主要方向。

研究表明囊膜糖蛋白(F、H)是產(chǎn)生CDV中和抗體的主要保護(hù)性抗原，是基因工程亞單位疫苗主要候選抗原。犬瘟熱病毒對(duì)理化因素極為敏感，難以通過(guò)常規(guī)純化病毒的方法獲得主要保護(hù)性抗原，因此基因工程表達(dá)成了制備亞單位疫苗的有效技術(shù)手段。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外關(guān)于犬瘟熱結(jié)構(gòu)蛋白基因的表達(dá)，多是利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)截短蛋白序列，很少有全長(zhǎng)序列的報(bào)道，且表達(dá)產(chǎn)物易受空間構(gòu)象影響。桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是一個(gè)以昆蟲(chóng)桿狀病毒為外源基因載體，以昆蟲(chóng)細(xì)胞或昆蟲(chóng)為受體的表達(dá)系統(tǒng)，由于其操作簡(jiǎn)便、生產(chǎn)周期短，對(duì)人及其他哺乳動(dòng)物無(wú)危害，表達(dá)產(chǎn)物可被正確地加工修飾，形成天然構(gòu)象，具有完整的生物學(xué)功能，已被公認(rèn)為是當(dāng)今基因工程四大表達(dá)系統(tǒng)之一[18-21]。目前，已有多種利用該系統(tǒng)表達(dá)制備的亞單位疫苗通過(guò)批準(zhǔn)上市[22-23]。

國(guó)內(nèi)很多研究者都嘗試?yán)脳U狀病毒表達(dá)麻疹病毒屬成員囊膜糖蛋白。全傳松等[24]、隋修錕等[25]分別利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲(chóng)細(xì)胞中成功表達(dá)了CDV 和小反芻獸疫病毒(peste des petits ruminants virus，PPRV)H蛋白。目前尚未有CDV F蛋白在昆蟲(chóng)細(xì)胞成功表達(dá)的報(bào)道。馮佩平[26]分別構(gòu)建了表達(dá)犬瘟熱病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白N、F和H的重組桿狀病毒，通過(guò)Western blot、間接免疫熒光證明N蛋白和H蛋白獲得了成功表達(dá)，然而F基因僅在表達(dá)后的細(xì)胞液中測(cè)得，Western blot并沒(méi)有如期檢測(cè)到F蛋白。同樣，有研究認(rèn)為PPRV F蛋白在昆蟲(chóng)細(xì)胞中可以獲得轉(zhuǎn)錄卻無(wú)法翻譯，分析稱密碼子偏嗜性也許是影響多肽翻譯的因素之一[27]。病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)疫苗作為新型的亞單位疫苗既能激發(fā)體液免疫，又能激發(fā)細(xì)胞和黏膜免疫；且不含病毒核酸，不能復(fù)制，具有安全、高效的特點(diǎn)，是很有發(fā)展前景的候選疫苗。對(duì)同屬的PPRV病毒樣顆粒疫苗的研究表明，共表達(dá)基質(zhì)蛋白M與表面糖蛋白(F、H)所形成VLPs的大小與真實(shí)病毒粒子相似，同時(shí)又具有足夠的保護(hù)性抗原[28]。由此可見(jiàn)，重組桿狀病毒表達(dá)犬瘟熱病毒囊膜糖蛋白是制備犬瘟熱病毒樣顆粒疫苗的必要前提。

4 結(jié) 論

成功構(gòu)建表達(dá)CDV 囊膜糖蛋白F、H的重組桿狀病毒，IFA和Western bolt檢測(cè)結(jié)果表明F和H蛋白分別在感染昆蟲(chóng)細(xì)胞中得到成功表達(dá)，并且與犬抗CDV高免血清及鼠抗F、H蛋白主要抗原表位區(qū)的多克隆抗體均具有良好的反應(yīng)原性，這為后期利用重組桿狀病毒包裝犬瘟熱病毒樣顆粒，開(kāi)發(fā)安全、有效的亞單位疫苗尤其是病毒樣顆粒疫苗奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

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(編輯 白永平)

Expression and Identification of Glycoprotein of Canine Distemper Virus in the Baculovirus-Insect Cell System

YU Yi-cong1，2，F(xiàn)ENG Na2，3*，YAN Fei-hu2，GAI Wei-wei2，WANG Tie-cheng2，WANG Hua-lei2，3，ZHENG Xue-xing2，3，ZHAO Yong-kun2，3，HUANG Geng2，YANG Song-tao2，GAO Yu-wei2，XIA Xian-zhu2，3，4*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，JilinAgriculturalUniversity，Changchun130118，China；2.KeyLaboratoryofZoonosisPreventionandControlofJilinProvince，MilitaryVeterinaryInstituteoftheAcademyofMilitaryMedicalSciences，Changchun130122，China；3.ChangchunVeterinaryResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Changchun130122，China； 4.JiangsuCo-innovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseasesandZoonosis，Yangzhou225009，China)

The objectives of this study were to express the native structure of fusion protein (F) and hemagglutinin glycoprotein (H) of canine distemper virus (CDV).TheFandHgene of lesser panda attenuated strain were amplified by PCR and cloned into pFastBacTM1 vector.The recombinant plasmids were sequenced，and then were transformed into competent DH10BacTME.colicells to construct shuttle plasmids，rBacmid F and rBacmid H，by homologous recombination.The recombinant plasmids were then transfected into Sf9 cells to construct recombinant baculoviruses and the expression products of rF and rH were identified with IFA and Western blot.The expression of rF and rH in insect cells infected with recombinant baculoviruses were identified by IFA with dog anti-CDV hyperimmune serum and were detected by Western blot with mouse polyclonal antibody against F and H major epitopes of CDV.The molecular weight of expressed F and H protein were identified as 63 and 68 kD，which were consistent with the expected value.The results show that both envelope glycoproteins are successfully expressed in baculovirus-insect cell expression system and have a good immunoreactivity.Our study laid the foundation for the development of the CDV virus-like particle vaccine.

canine distemper virus；fusion protein；attachment glycoprotein；baculovirus-insect cell system

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.014

2014-09-28

國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303042)

虞一聰(1989-)，男，浙江慈溪人，碩士生，主要從事動(dòng)物分子病毒學(xué)研究，E-mail：jordanyuyicong@163.com

*通信作者：夏咸柱，E-mail：xiaxzh@cae.cn；馮 娜，E-mail：fengna0308@126.com

S852.659.5

A

0366-6964(2015)06-0981-08