謝建山，張丹瑾，郭艷妮，范瑞文，許冬梅，楊玉靜，聶瑞強，于秀菊，段力升，朱芷葳，高文俊，赫曉燕，董常生*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，太谷 030801)

突觸融合蛋白4在不同毛色小鼠皮膚組織的差異表達

謝建山1#，張丹瑾1#，郭艷妮1，范瑞文1，許冬梅1，楊玉靜1，聶瑞強1，于秀菊1，段力升1，朱芷葳2，高文俊1，赫曉燕1，董常生1*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，太谷 030801)

旨在探討突觸融合蛋白4(Syntaxin4，STX4)在皮膚組織細胞中的表達與定位，確定其是否與毛色形成存在相關性。選擇白、灰、黑3種毛色皮膚組織樣品(6只昆明小鼠白毛色背部皮膚、6只C57BL/6小鼠灰毛色腹部皮膚和黑毛色背部皮膚)和體外培養(yǎng)小鼠黑色素細胞樣品，通過PCR擴增、Real-time PCR、免疫組化和Western blot 技術對STX4的表達情況進行定性和定量分析。結果表明：在3種毛色皮膚樣品和黑色素細胞樣品中均擴增出897 bp CDS區(qū)序列片段；Real-time PCR檢測顯示，STX4在白灰黑3種毛色皮膚樣品中均有表達，黑色皮膚表達量最高，灰色皮膚表達量次之，分別是白色皮膚的3.44倍和1.92倍；免疫組化結果表明，在白色和黑色皮膚表達于整個毛囊, 包括角化細胞；在體外培養(yǎng)黑色素細胞也顯示陽性表達； Western blot結果顯示，在白、灰、黑色皮膚和黑色素細胞樣品中均有STX4陽性條帶，表達量與熒光定量結果一致。綜上表明，STX4在小鼠皮膚組織、毛囊角化細胞、黑色素細胞有效表達，且表達量在白灰黑皮膚中呈遞增趨勢，推測STX4與小鼠毛色形成呈正相關性。

突觸融合蛋白4；差異表達；小鼠；不同毛色；毛囊

動物毛纖維是人類生產(chǎn)生活不可或缺的重要資源，主要毛用性狀有細度、長度和色彩[1]。毛色作為主要毛用性狀之一，由許多基因共同參與形成[2-3]。脊椎動物皮膚和毛發(fā)顏色具有多樣性，主要由皮膚和毛發(fā)中黑色素的含量所決定。黑色素可分為真黑素和褐黑素兩種類型[4]。黑色素顆粒由黑色素細胞合成，并向皮質(zhì)及角質(zhì)形成細胞轉(zhuǎn)運，最終沉積于毛干內(nèi)[4]。突觸融合蛋白4(Syntaxin4，STX4)屬于SNARE家族成員，可能參與黑色素細胞中黑色素小體向角化細胞的轉(zhuǎn)移[5]。STX4在心、脾、骨骼肌和腎中廣泛表達[6-8]。G.Scott 等在鼠永生黑色素細胞B10BR中鑒定了STX4轉(zhuǎn)錄本，也證實了在純化的黑色素小體中包含STX4蛋白[5]。Syntaxin 4并不像其他的Syntaxin蛋白可以參與細胞中幾乎所有的轉(zhuǎn)運途徑，它受限制的表達類型表明它參與更專門的膜轉(zhuǎn)運途徑[9]。Syntaxin 4的限制表達類型并不與已知的Rab蛋白家族之間有一一對應關系[9]。胰島β細胞分泌胰島素時需要有Syntaxin4的存在[10]；在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的長時間增強，門冬氨酸受體激發(fā)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體運輸?shù)酵挥|前膜和AMPA受體運輸?shù)酵挥|都需要Syntaxin 4參與[11]；同源重組產(chǎn)生Syntaxin 4敲除小鼠，純合基因的破壞導致早期胚胎死亡，而雜合的基因敲除小鼠(Syn4+/-)沒有顯著損傷，在生長、發(fā)育和繁殖中有正常的生命力，但是胰島素刺激這些小鼠GLUT4在骨骼肌易位顯著降低[12]；在海馬突觸，胞外分泌發(fā)生在質(zhì)膜t-SNARE syntaxin 4富集的微區(qū)，Syntaxin 4的缺損會削弱樹突棘胞外分泌和長時間增強作用[13]。迄今為止，有關Syntaxin 4在黑色素細胞中的分布規(guī)律及其作用機理仍未見具體報道，其是否與毛色生成具有相關性也尚無定論，本研究選取小鼠白、灰、黑3種皮膚組織和體外培養(yǎng)黑色素細胞進行試驗，以探討Syntaxin 4與小鼠毛色形成的相關性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

RIPA裂解液(碧云天)、山羊抗STX4多克隆抗體(Santa Cruz公司)、HRP-兔抗山羊IgG、兔抗β-actin單克隆抗體(康為世紀，北京)；HRP-山羊抗兔IgG； Trizol試劑(Invitrogen公司，美國)、反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒 (TaKaRa，大連)、黑素細胞培養(yǎng)基(ScienCell，美國)、高速低溫冷凍離心機(Sigma；德國)、超凈工作臺(型號：SW-CJ-CO，蘇州)、普通 PCR 儀(BioRAD，美國)、7500 Fast Real time PCR System(Life technologies，美國)、電泳槽(北京六一儀器廠)、紫外凝膠成像系統(tǒng)(型號：WV-BP330，Panasonic公司，日本)、核酸蛋白測定儀(型號：Nanodrop-1000，Thermo，美國)

1.2 白、灰、黑3種毛色皮膚樣本及細胞樣本采集

白色被毛皮膚采自白色昆明小鼠。C57BL/6小鼠背部毛色為純黑色，腹部毛色為灰色，選作黑色和灰色毛色樣品。隨機挑選白色雄性2月齡昆明小鼠6只，野生型雄性2月齡C57BL/6小鼠6只(購自山西醫(yī)科大學)，將白鼠的背部皮膚及野生型C57BL/6小鼠的黑毛色背部皮膚和灰毛色腹部皮膚，分別凈毛后取2 cm2左右的皮膚組織各3塊，每種毛色中取2塊迅速置于液氮中，用于后續(xù)RNA提取和蛋白提??；1塊用Bouin’s固定液固定，進行石蠟制作切片。黑色素細胞取自實驗室凍存第6代體外培養(yǎng)小鼠黑色素細胞。

1.3 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄合成

皮膚中的總RNA通過Trizol試劑盒提取。小鼠皮膚總RNA濃度由核酸蛋白測定儀測定。RNA的完整性用1%的瓊脂糖凝膠電泳初步判定。然后對總RNA進行反轉(zhuǎn)錄便于進行后續(xù)試驗，按照TaKaRa公司反應試劑盒方法來合成互補鏈cDNA。反轉(zhuǎn)錄的反應條件(20 μL反應體系)：Oligo dT Primer 1 μL、dNTP mixture 1 μL、Total RNA ≤5 μg、RNase Free dH2O 補充至10 μL，將以上的反應液置于65 ℃保溫5 min后，冰上迅速冷卻。然后加入5×PrimeScript II Buffer 4 μL、RNase Inhibitor(40 U·μL-1) 0.5 μL、PrimeScript II RTase 1 μL、RNase Free dH2O 補充至20 μL，漩渦混勻，進行反應：42 ℃ 45 min；70 ℃ 15 min。反應結束后用核酸蛋白測定儀測定其濃度，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設計及PCR反應

根據(jù)NCBI中小鼠的STX4的mRNA序列，采用NCBI在線引物設計軟件設計其引物，送華大基因(北京)合成。PCR反應體系：Taq MasterMix 5 μL、正、反向引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL， cDNA 1 μL，ddH2O 3.2 μL。反應條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，72 ℃ 5 min，35個循環(huán)。反應結束后瓊脂糖凝膠電泳，將含有目的條帶的凝膠切下，放到1.5 mLEP管中，進行膠回收，送北京華大基因生物公司進行測序。

1.5 實時熒光定量PCR(Real-time PCR)

將每種毛色的6個小鼠皮膚組織的cDNA樣品，作為Real-time PCR的模板，每個樣品重復3次試驗，最后取平均值。反應體系(10 μL)：SYBR Premix 5 μL；正反向引物各0.4 μL，DNA Template 0.5 μL、RNase Free H2O 3.7 μL。反應條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s；60 ℃ 30 s；延伸72 ℃ 10 s，40個循環(huán)；95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s。熒光信號收集于退火階段。

目的基因STX4的相對表達量采用△△CT法計算:△CT(白色背毛)= CT(STX4基因)-CT(β-Actin基因)、△CT(灰色腹部)= CT(STX4基因)-CT(β-Actin基因)、△CT(黑色背毛)= CT(STX4基因)-CT(β-Actin基因)、△△CT =△CT(白色背毛)/△CT(灰色腹部)-△CT(黑色背毛)，目的基因的相對表達水平=2-△△CT。用Excel對得出的數(shù)據(jù)進行計算，結果用“平均值±標準差(Means±SD)”表示，內(nèi)參基因β-Actin進行各基因表達量的校正。最后計算出的數(shù)據(jù)用SPSS軟件進行分析。

1.6 Western blot分析

皮膚組織的總蛋白用總蛋白提取試劑盒(碧云天，中國)進行提取。并取1 μL溶液用核酸蛋白儀測定濃度。進行 SDS-PAGE電泳，每孔上樣總蛋白300 ng，轉(zhuǎn)移至NC膜。NC膜用5% 脫脂奶粉封閉液于室溫封閉1 h。將NC膜放入抗體孵育盒中，加入山羊抗STX4多克隆抗體( TBST 1∶200 稀釋)，4 ℃過夜，37 ℃復溫0.5 h。用 TBST洗膜，5 min 3次，將膜放入抗體孵育盒內(nèi)，加入HRP-兔抗山羊IgG( TBST 1∶2 000 稀釋)，37 ℃反應1 h。取出NC膜，TBST洗膜5 min 3 次。按照發(fā)光試劑盒(康為公司)說明書配制發(fā)光液，在NC膜上涂上發(fā)光液后，室溫孵育3～5 min進行拍照。內(nèi)參蛋白抗體用兔抗β-Actin多克隆抗體，以1∶500比例稀釋使用。

對NC膜進行掃描后，用Quantity one對蛋白條帶進行灰度值分析，誤差校正=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值，β-Actin作為內(nèi)參，用SPSS17.0軟件對得到樣品STX4蛋白的相對含量進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

1.7 小鼠黑色素細胞復蘇、培養(yǎng)與檢測

將實驗室凍存第6代小鼠黑素細胞從液氮中取出，迅速置于37 ℃水浴鍋中進行解凍，在水中迅速搖動，直至全部溶解，接種于加有黑素細胞培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)板上，在37 ℃ 5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。通過轉(zhuǎn)染連接有小鼠黑色素細胞特異性TYPR2啟動子的GFP表達質(zhì)粒，對黑色素細胞進行檢測，收集細胞，提取RNA 和蛋白質(zhì)，制成細胞爬片后，進行免疫組化檢測。

1.8 免疫化學分析

1.8.1 皮膚組織的免疫組織化學分析 Bouin’s 固定液固定的小鼠皮膚組織，通過梯度酒精脫水、透明后，包埋成組織臘塊，以便進行組織切片，切成5 μm厚。將石蠟切片脫蠟，3% H2O2孵育10 min，PBS洗切片3 次(每次3 min)；滴加5%兔血清封閉液，在37 ℃下封閉20 min；甩干兔血清，滴加山羊抗STX4多克隆抗體(用PBS 1∶100稀釋)，4 ℃過夜；37 ℃孵育30 min，用PBS沖洗3 次(每次3 min)；滴加HRP-兔抗山羊IgG(用PBS 1∶150稀釋)，37 ℃孵育30 min，用PBS 緩沖溶液沖洗3 次(每次5 min)；用DAB顯色1～10 min，PBS 沖洗，蘇木素復染、脫水、透明，樹膠封片，陰性對照使用兔血清代替一抗。

1.8.2 小鼠黑色素細胞的免疫組織化學分析 將培養(yǎng)小鼠的黑色素細胞滴加到蓋玻片上，待細胞長滿后，用移液器吸去培養(yǎng)基，并用DPBS沖洗3 次，用4%的多聚甲醛在4 ℃固定30 min。用DPBS緩沖液沖洗3 次(每次2 min)，用3% H2O2在37 ℃孵育30 min，用DPBS緩沖溶液洗切片3 次( 每次2 min)。黑色素細胞的免疫組織化學分析同1.8.1。

2 結 果

2.1 小鼠皮膚中STX4的表達與定位

2.1.1 STX4在小鼠皮膚中表達的PCR檢測結果 通過提取3種毛色的小鼠皮膚總RNA，反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA，以此為模板對小鼠STX4 CDS區(qū)序列進行擴增，在3種毛色小鼠皮膚中均成功獲得了897 bp條帶，表明STX4在這3種毛色的小鼠皮膚中均有表達(圖1 )。

2.1.2 在不同毛色小鼠皮膚中STX4 轉(zhuǎn)錄本表達差異的Real-time PCR檢測 熒光定量結果顯示，STX4與內(nèi)參β-actin基因溶解曲線峰值單一，特異性良好，目的基因與內(nèi)參基因的峰值溫度分別是85和86 ℃。擴增曲線平滑，整體平穩(wěn)性較好，呈“S”形，曲線拐點清楚，基線平(圖2)。數(shù)據(jù)分析表明，STX4的轉(zhuǎn)錄本表達量在白色、灰色和黑色皮膚中呈遞增趨勢，在灰色皮膚中表達量是白色1.92倍，在黑色皮膚中表達量是白色的3.44倍(圖3)。實時PCR引物序列見表1。

M.DL2000 marker;4.STX4 CDS PCR產(chǎn)物;W.沒有加模板的PCR反應產(chǎn)物M.DL2000 marker;4.CDS product of STX4;W.PCR product of reaction had no templates圖1 STX4在小鼠皮膚中的表達Fig.1 The expression of STX4 in mice tissue

圖2 STX4與β-Actin熔解曲線和擴增動力學曲線Fig.2 PCR melting curve and amplification plot of STX4 and β-Actin genes

表1 引物序列

Table 1 Primes in this experiment

引物名稱Primer序列(5'-3')SequenceMice-STX4-CDS-FATGCGCGACAGGACCCACMice-STX4-CDS-RTTATCCAACGGTTATGGTGATGCMice-β-actin-RT-PCR-FTTTATCGGTATGGAGTCTGCGGMice-β-actin-RT-PCR-RTTGATCTTCATGGTGCTGGGAGMice-STX4-RT-PCR-FAGTGAGGTGTTTGTGTCTAATATMice-STX4-RT-PCR-RGGTTGATCATCTCCCCCTGC

數(shù)據(jù)用“平均值±SD”，t檢驗。*.P<0.05;**.P<0.01；***.P<0.001(黑色組為對照組)。圖6同Data are presented as “mean±SD”，and 2 group comparisons were done with a two-tailed Student’s t test.*.P<0.05;**.P<0.01；***.P<0.001 compared to back .The same as Fig.6圖3 STX4基因mRNA在不同毛色皮膚表達Fig.3 Real time PCR analysis of STX4 expression in different color of mice skin

2.1.3 在不同毛色小鼠皮膚中STX4 蛋白表達的免疫組化檢測 結果顯示STX4在白色、灰色和黑色皮膚中均有表達。皮膚的組織結構是由表皮、真皮和皮下組織組成。在皮膚的表皮，是由角質(zhì)形成細胞和非角質(zhì)形成細胞兩大類組成，角質(zhì)形成細胞占據(jù)了大部分區(qū)域，白、灰、黑3種毛色皮膚表皮都顯示陽性，表明小鼠表皮角質(zhì)形成細胞表達STX4蛋白(圖4 A1、B1和C1)。毛囊是包圍在毛發(fā)根部的囊狀組織，由表皮向真皮深入。毛囊的組織結構隨其所在生長周期的不同而呈周期性變化，毛囊下部隨著毛囊生長周期的變化而發(fā)生周期性消退和再生。成熟生長期毛囊可以分為縱向和橫向兩種?？v向分為上毛囊(漏斗部和管峽)、毛囊中部(包含隆凸部)、下毛囊(球根區(qū)和球上區(qū))；毛囊的橫向組成由外到內(nèi)包括結締組織鞘、外根鞘、內(nèi)根鞘、毛小皮、毛干皮質(zhì)、毛干髓質(zhì)。STX4表達于白色和黑色皮膚整個毛囊，在毛囊上段和中段著色更深，表達量高于下段(圖4 A2和C2)。在灰色皮膚毛囊橫切面觀察，STX4在毛囊的上皮根鞘呈陽性，該處結構是由角化細胞和黑色素細胞組成，且角化細胞占大多數(shù)，顯示STX4在角化細胞與黑色素細胞中有表達(圖4 B2)。

A1、B1和C1.STX4白色、灰色和黑色皮膚組織表皮陽性反應；A1’、B1’和C1’.對應陰性對照；A2、B2和C2.STX4白色、灰色和黑色皮膚組織毛囊陽性反應；A2’、B2’和C2’.對應陰性對照。箭頭示STX4在小鼠皮膚組織中的陽性表達A1，B1 and C1.STX4 protein positive reaction of white，grey and black mice skin epidermis in turn；A1’，B1’ and C1’.STX4 protein negative results corresponding to A1，B1 and C1 respectively；A2，B2 and C2.STX4 protein positive reaction of white，grey and black mice skin hair follicles in turn；A2’，B2’ and C2’.STX4 protein negative results corresponding to A2，B2 and C2 respectively.Aarrows indicate the positive reaction of mice skin tissue圖4 小鼠皮膚組織STX4的免疫組化染色 40×Fig.4 Expression of STX4 protein in mice skin tissue showed by immunohistochemical method 40×

2.1.4 Western blot檢測不同毛色小鼠皮膚中STX4 蛋白差異表達 白色、灰色和黑色皮膚組織蛋白Western blot結果顯示，均有STX4陽性條帶(圖5)；STX4蛋白分子量為35 ku左右，進行半定量分析結果顯示，STX4的蛋白表達量隨著毛色逐漸加深而不斷增加，白色組、灰色組、黑色組中的相對表達量分別為(0.695±0.066 1)、(0.846±0.031 6)、(1.024±0.062 6)，用SPSS軟件分析發(fā)現(xiàn)均為差異顯著(P<0.05)(圖6)。與熒光定量檢測結果一致。

圖5 Western blot檢測STX4 蛋白在小鼠不同毛色皮膚組織中的差異表達Fig.5 STX4 protein Expression level detected by Western blot

圖6 STX4在不同毛色小鼠皮膚組織中的平均蛋白表達量Fig.6 Western blot analysis of STX4 protein expression in different color of mice skin

2.2 在小鼠黑色素細胞中STX4的表達與定位

2.2.1 PCR檢測STX4 在小鼠黑色素細胞中的表達 通過提取體外培養(yǎng)小鼠黑色素細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，進行小鼠STX4 CDS區(qū)序列擴增，獲得897 bp條帶，顯示STX4在體外培養(yǎng)小鼠黑色素細胞中表達(圖7)。

M.DL2000 marker;4.STX4 CDS PCR產(chǎn)物;W.沒有加模板的PCR反應產(chǎn)物M.DL2000 marker;4.CDS product of STX4;W.PCR product of reaction had no templates圖7 黑色素細胞中STX4 mRNA CDS區(qū)的擴增Fig.7 PCR products of target gene STX4 gene in melanocytes

2.2.2 免疫組化檢測STX4在小鼠黑色素細胞中表達 體外培養(yǎng)小鼠黑色素細胞貼壁生長，形態(tài)呈樹突狀(圖8A)，通過轉(zhuǎn)染連接有小鼠黑素細胞特異的TYRP2啟動子的GFP表達質(zhì)粒，存在GFP表達(圖8B)。免疫組化結果顯示，STX4在小鼠黑色素細胞的細胞質(zhì)有陽性表達(圖8C)。

2.2.3 Western blot檢測STX4 在小鼠黑色素細胞中表達 提取體外培養(yǎng)原代小鼠黑色素細胞總蛋白進行Western blot檢測結果顯示有STX4陽性條帶，條帶大小正確(圖9)。

3 討 論

本研究中所用小鼠黑素細胞是實驗室成功分離凍存的，并通過含有小鼠黑素細胞特異的TYRP2啟動子的GFP 表達載體進行轉(zhuǎn)染，成功表達GFP，結合形態(tài)判斷[14]，對小鼠黑素細胞進行了驗證。G.Scott等研究表明，STX4 呈點狀表達在鼠永生黑色素細胞B10BR突起膜上，在體外培養(yǎng)的人永生角化細胞HaCat的質(zhì)膜上有表達[5]。本研究從組織和細胞兩個層次，普通PCR CDS區(qū)序列擴增、Real time PCR、免疫組化和免疫印跡4種方法，對STX4的表達進行檢測，在白、灰、黑3種毛色皮膚中，STX4在均有表達；相比較白色皮膚組織，在灰色和黑色組織中表達量較高。STX4在毛囊中表達于黑色素細胞和角化細胞，并在體外培養(yǎng)小鼠黑色素細胞中成功檢測到了STX4的表達，與G.Scott等[5]結果相同，可推測syntaxin 4與毛色形成有相關性。

A.小鼠黑素細胞光鏡圖 10×；B.圖A中細胞轉(zhuǎn)染連接有小鼠黑素細胞特異的TYRP2啟動子的GFP表達蛋白結果 10×；C.STX4 黑色素細胞陽性反應40×(箭頭所指為陽性)；D.黑色素細胞陰性反應 40×A.Light microscope photomicrograph of mice melanocyte(10×)；B.Figure A cell transfected GFP expression plasmid，the promoter was mice melanocyte specific TYRP2 promoter(10×)；C.STX4 protein positive reaction of mice skin melanocytes(40×)(arrows indicate positive reaction)；D.Control mice skin melanocytes(40×)圖8 小鼠黑色素細胞STX4的免疫組化染色Fig.8 Expression of STX4 protein in mouse melanocytes showed by immunohistochemical method

圖9 Western blot檢測STX4 蛋白在小鼠黑色素細胞中表達Fig.9 STX4 protein expression level in mice skin melanocytes detected by Western blot

本研究與文獻[5]報道均表明，syntaxin 4在黑色素小體、黑色素細胞質(zhì)膜、角化細胞質(zhì)膜均有表達，可能共同參與著黑色素小體向角化細胞轉(zhuǎn)移，共同參與黑色素小體結合黑色素細胞質(zhì)膜，轉(zhuǎn)出黑色素細胞，然后再與角化細胞質(zhì)膜融合，轉(zhuǎn)入角化細胞。有研究者通過使用大鼠腦部已知的syntaxin1A和1B的引物發(fā)現(xiàn)了syntaxin的亞型與syntaxin1A、1B有44%的氨基酸同源性，而被命名為syntaxin 4[15]。大鼠來源的Syntaxin家族蛋白之間具有23%～84%氨基酸的相似性[9]。syntaxin 4起作用的方式是形成SNARE復合物，D.Kioumourtzoglou報道syntaxin 4會與SNAP23和VAMP2結合[16]，Munc-18c抑制syntaxin 4和VAMP2結合[17]，K.J.Veale報道syntaxin 4會與SNAP23和VAMP3結合[18]，其活性的改變與被磷酸化有關，并有著絲點蛋白F等蛋白與其相互作用，調(diào)節(jié)其作用方式。同樣的syntaxin 4蛋白，分布在不同的位置，應該有不同的作用，同一條作用路線的不同區(qū)段，存在有同一種蛋白，這個蛋白在不同部位是如何來完成一個延續(xù)性的生物學活動，有待進一步的研究證實。

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(編輯 程金華)

Differential Expression of the Syntaxin 4 in Differential Coat Color Mice Skin

XIE Jian-shan1#，ZHANG Dan-jin1#，GUO Yan-ni1，F(xiàn)AN Rui-wen1，XU Dong-mei1，YANG Yu-jing1，NIE Rui-qiang1，YU Xiu-ju1，DUAN Li-sheng1，ZHU Zhi-wei2，GAO Wen-jun1，HE Xiao-yan1，DONG Chang-sheng1*

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China；2.CollegeofLifeScience，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China)

The aim of the present study was to determine whether STX4 is associated with coat color formation in mice. The expression and localization of STX4 in mice skins and melanocytes were investigated. Three different coat color skins, white, grey and black, were collected from the back of 6 white Kunming mice, the abdomen of 6 C57BL/6 mice and the back of 6 C57BL/6 mice, respectively. Melanocytes were cultured in vitro. The expression of STX4 in these skin and cell samples were analyzed by standard RT-PCR, quantitative real-time PCR, immunohistochemical staining and Western blot. The 897 bp sequence of STX4 CDS region was successfully amplified from 3 different coat color mice skins and melanocytes cultured in vitro by RT-PCR. Real-time PCR analysis revealed that STX4 was expressed in mice skins of all coat colors. STX4 showed the highest expression in black skin, which was 3.44 times higher than white skin. The expression of STX4 in grey skin was 1.92 times higher than white skin. Immunohistochemical analysis showed that STX4 was expressed in whole hair follicles in white and black skins including keratinocytes, as well as in melanocytes cultured in vitro. Western blot results showed positive STX4 bands in white, grey and black skin samples and melanocytes culturedinvitro. These results were consistent with the real-time PCR results. In conclusion, STX4 is expressed in mice skins, hair follicles, keratinocytes, and melanocytes, and the expression of STX4 increases as the coat color deepens. Therefore, it is speculated that STX4 is positively correlated to coat color formation in mice.

syntaxin 4(STX4)；differential expression；mouse；different coat color；hair follicle

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.011

2015-02-09

國家“863”計劃(2013AA102506)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303119)；農(nóng)業(yè)部“948”項目(2-11-Z33)；肉牛、肉羊標準化生產(chǎn)體系的建立-子項目-利用轉(zhuǎn)microRNA技術培育彩色轉(zhuǎn)基因細毛羊；山西省重點學科建設經(jīng)費；山西省基礎研究項目(青年科技研究基金)(2014021028-2)

謝建山(1981-)，男，山西朔州人，博士生，主要從事動物毛色形成機理研究，E-mail:xiejs@live.com；張丹瑾(1989-)，女，山西太原人，碩士，主要從事羊駝毛色的研究，E-mail: ellen7789@163.com；謝建山與張丹瑾為并列第一作者

*通信作者：董常生，教授，博士生導師，E-mail:cs_dong@sxau.edu.cn

S852

A

0366-6964(2015)06-0957-08