李芳洪昆黃瓅蘇曉麗胡成平(.鄭州大學第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科　河南鄭州　450000;.岳陽職業(yè)技術(shù)學院　湖南岳陽　44000;.中南大學湘雅醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科　湖南長沙　40008)

氯化鈷化學乏氧對人肺癌A549細胞生長及侵襲、遷徙能力的影響

李芳1洪昆2黃瓅3蘇曉麗3胡成平3
(1.鄭州大學第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科河南鄭州450000;

2.岳陽職業(yè)技術(shù)學院湖南岳陽414000;
3.中南大學湘雅醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科湖南長沙410008)

【摘要】目的探討氯化鈷化學乏氧對人肺腺癌A549細胞生長及遷徙、侵襲能力的影響。方法采用氯化鈷(CoCl2)建立人肺腺癌A549細胞體外化學乏氧模型。首先通過倒置相差顯微鏡、電鏡、MTT法及流式細胞學觀察CoCl2對A549細胞形態(tài)、增殖及細胞周期的影響;進一步利用Transwell小室模型檢測CoCl2對A549細胞侵襲及遷徙能力的影響。結(jié)果與常氧對照組相比，200 μmol/L CoCl2化學乏氧組A549細胞光鏡下較稀疏，電鏡下出現(xiàn)線粒體腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張及自噬泡形成等微觀結(jié)構(gòu)改變，生長曲線低平、增殖緩慢，G1期細胞比例增多、S期細胞比例減少;遷徙及侵襲能力增強。結(jié)論CoCl2化學乏氧抑制人肺A549細胞的增殖，誘導(dǎo)G1/S周期阻滯，增強A549細胞的侵襲及遷徙能力。

【關(guān)鍵詞】氯化鈷;肺腺癌;增殖;侵襲;遷徙

肺癌是目前世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，并且是引起癌性死亡的首要原因，在男性和女性癌性死亡原因中分列第1位和第2位［1］。在常見的非小細胞肺癌的病理類型中，肺腺癌的發(fā)病率明顯增加［2］。然而，由于肺癌細胞具有惡性增殖及早期即遠處侵襲、轉(zhuǎn)移的生物學特點［3］，多數(shù)患者確診時已屬晚期，喪失手術(shù)機會，嚴重影響患者預(yù)后。近年來，研究發(fā)現(xiàn)實體性腫瘤普遍存在乏氧微環(huán)境，與腫瘤細胞的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。因此，本實驗以人肺腺癌A549細胞為研究對象，采用氯化鈷(CoCl2)建立體外A549細胞化學乏氧模型，觀察乏氧微環(huán)境對腫瘤細胞生長及侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學特性的影響，為進一步研究其機制奠定實驗基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1細胞及主要試劑人肺腺癌A549細胞株(中南大學湘雅醫(yī)學院細胞中心)，DMEM培養(yǎng)基(Gibico公司)，熱滅活胎牛血清(杭州四季青生物制品公司)，碘化吡啶(PI)、氯化鈷(CoCl2，分子量237.93，美國Sigma公司)，F(xiàn)N(美國Roche公司)，Transwell小室(美國Millipore公司)，溴化二甲基噻唑爾本四氮唑(MTT)(美國AMRESLO公司)，二甲基亞砜(DMSO，北京鼎國生物技術(shù)有限公司)。

1.2研究方法

1.2.1 A549細胞乏氧培養(yǎng)與分組A549細胞于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置37℃、50 ml/L CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱(美國Forma Scientific公司)中培養(yǎng)，80%匯合時換無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使其同步化后，吸棄原培養(yǎng)液，加入含終濃度為0、200 μmol/L CoCl2［4］的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，其中0 μmol/L CoCl2組為常氧組;200 μmol/L CoCl2組為乏氧組。

1.2.2 A549細胞的形態(tài)及結(jié)構(gòu)檢測常氧組及乏氧組A549細胞放置于37℃、50 ml/L CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，從培養(yǎng)箱中取出。

1.2.2.1倒置顯微光鏡下觀察各組A549細胞的形態(tài)將上述細胞放置在倒置顯微鏡(日本Olympus公司)物鏡下，按放大倍數(shù)，依次通過目鏡觀察A549細胞的形態(tài)。

1.2.2.2透射電鏡觀察各組A549細胞的微觀結(jié)構(gòu)將上述細胞給予1×D－Hank’s漂洗1～2次后，用0.25%的胰蛋白酶消化并吹打成均勻的細胞懸液后，加入1×PBS 5 ml，4℃條件下，1 000轉(zhuǎn)/min離心10 min后，吸棄上清液，加入2.5%的戊二醛溶液固定2 h后，再用1%鋨酸固定液固定2～3 h，1×PBS漂洗3次，4℃條件下，依次用50%、70%、90%、100%丙酮梯度脫水，然后用純丙酮+包埋液依次包埋過夜后，置入烘箱在不同溫度下固化，超薄切片機切片(50～60 nm)，3%醋酸鈾－硝酸鉛進行雙染，透射電鏡JEM－2000EX(日本JEOL公司)觀察、拍片。

1.2.3 A549細胞生長、增殖檢測常氧組及乏氧組A549細胞放置于37℃、50 ml/L CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞生長24、48、72、96 h，每孔加入20 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，予以1×DHank’s漂洗1～2次，再加入150 μl DMSO，將培養(yǎng)板放置在振動搖床上緩慢振蕩至甲瓚藍顆粒完全溶解后，將96孔培養(yǎng)板置入酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Bio－Rad公司)檢測盒中，于570 nm處測量各孔的吸光度值(OD)，再以O(shè)D值繪制細胞生長曲線。

1.2.4 A549細胞周期檢測常氧組及乏氧組A549細胞放置于37℃、50 ml/L CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用0.25%的胰蛋白酶消化細胞，4℃條件下，1 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，重懸細胞于0.6 ml的1×PBS液，再加入1.4 ml預(yù)冷的75%乙醇混勻后，4℃固定過夜，上機前離心收集細胞，將細胞重懸于1×PBS液中，50 μg/ml PI溶液37℃避光染色30 min，流式細胞儀(美國Beckman公司)進行細胞周期檢測。每組設(shè)3個平行管，并重復(fù)3次實驗。

1.2.5 A549細胞侵襲能力檢測

1.2.5.1制備條件培養(yǎng)基用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)A549細胞，在細胞長勢良好的情況下?lián)Q無血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集上清液，過濾除菌，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5.2侵襲能力檢測分別取50 μl 0.05/L FN，50 μl Matrigel膠均勻包被Transwell小室底部的反面和正面，室溫風干;各組細胞培養(yǎng)24 h后，常規(guī)消化細胞，將200 μl細胞懸液接種于上室，細胞終密度為1× 108/L;下室加入含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基及條件培養(yǎng)基各200 μl，將Transwell小室放入24孔培養(yǎng)板內(nèi)共同培養(yǎng)，每組設(shè)5個復(fù)孔;置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，取出Transwell小室;小心擦去微孔濾膜上層的細胞，固定、染色穿過微孔濾膜侵襲至下室的細胞;在200倍倒置顯微鏡下計數(shù)侵襲穿膜細胞數(shù)，每張膜隨機選取10個視野;取各組侵襲穿膜細胞數(shù)的平均值，最后按以下公式計算各組細胞的侵襲率:細胞侵襲率(%)=侵襲穿膜細胞數(shù)(實驗組)/侵襲穿膜細胞數(shù)(常氧組)×100%。

1.2.6 A549細胞遷徙能力檢測

1.2.6.1制備條件培養(yǎng)基同1.2.5.1。

1.2.6.2遷徙能力檢測［5］各組細胞培養(yǎng)24 h后，常規(guī)消化細胞，將200 μl細胞懸液接種于上室，另設(shè)空白組，只加200 μl細胞培養(yǎng)基而不加細胞懸液，細胞終密度為1×109/L;下室加入含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基及條件培養(yǎng)基各200 μl，將Transwell小室放入24孔培養(yǎng)板內(nèi)共同培養(yǎng)，每組設(shè)5個復(fù)孔;置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，取出Transwell小室，MTT法測各孔OD值;取各組OD值的平均值，按以下公式計算各組細胞的遷徙率:細胞遷徙率(%)=(實驗組OD值－空白組OD值)/(對照組OD值－空白組OD值)×100%。

1.3統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)錄入SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，定量資料采用均數(shù)±標準差(±s)表示，兩組之間的均數(shù)比較用t檢驗。每個實驗重復(fù)3次，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1 A549細胞微觀形態(tài)、結(jié)構(gòu)的變化光鏡下觀察A549細胞均貼壁良好，輪廓清晰，形態(tài)呈長梭形或圓形，部分細胞伸出偽足，與常氧組相比，乏氧組未見脫落A549細胞增多以及大片A549細胞脫壁的現(xiàn)象。見圖1。電鏡下觀察A549細胞微觀結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示:常氧組及乏氧組A549細胞切面均成類圓形，細胞膜外有不等量纖毛，細胞漿內(nèi)線粒體(↓)豐富;與常氧組相比，乏氧組A549細胞胞漿內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)()管腔明顯擴張，部分線粒體明顯腫脹，基質(zhì)疏松、嵴斷裂、模糊;可見自噬體()形成，未見明顯凋亡小體。見圖2。

2.2 A549細胞的生長、增殖A549細胞培養(yǎng)0、24、48、72、96 h后，MTT法檢測A549細胞的生長、增殖，結(jié)果顯示:常氧組A549細胞24 h后即成對數(shù)生長，96 h后進入生長平臺期，生長曲線成S型。乏氧組A549細胞48 h進入對數(shù)期生長，72 h后進入生長平臺期，生長曲線趨于低平。見表1、圖3。

表1　兩組A549細胞生長、增殖情況比較(±s)

注:與常氧組比較，aP＜0.05。

組別0 h　24 h　48 h　72 h　96 h常氧組　0.17±0.02 0.47±0.07 0.88±0.17 1.79±0.38　 1.83±0.44乏氧組　0.18±0.02 0.20±0.03a0.36±0.06a0.50±0.09a0.55±0.10a

2.3 A549細胞周期的影響A549細胞24 h后，流式細胞術(shù)檢測A549細胞周期分布，結(jié)果顯示:常氧組與乏氧組A549細胞均以G1期為主。但乏氧組A549細胞G1期比例較常氧組增多(P＜0.05); S期比例較常氧組減少(P＜0.05)，G2期比例差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表2、圖4。

2.4 A549細胞侵襲和遷徙能力的影響在腫瘤細胞轉(zhuǎn)移過程中，多種物質(zhì)可刺激腫瘤細胞發(fā)生定向趨化運動，本實驗應(yīng)用A549細胞自身分泌的上清液為趨化因子，通過直接計數(shù)侵襲穿膜細胞數(shù)及侵襲率、MTT比色法測定微孔濾膜進入含趨化因子的下室貼壁細胞OD間接計算各組A549細胞的遷徙率，探討CoCl2化學乏氧對A549細胞侵襲、遷徙能力的影響，結(jié)果顯示:乏氧組A549細胞侵襲率及遷徙率均較常氧組增加(P＜0.05)。見圖5、表3。

表2　A549細胞周期分布(±s，%)

注:與常氧組比較，bP＜0.05。

組別　n　G1期　S期　G2期常氧組3　 48.80±2.48　 36.86±2.13　 12.34±0.55乏氧組　3　 68.67±3.01b　15.67±1.76b14.38±2.39

3　討論

實體性腫瘤如肺癌、肝癌等常呈失控性生長，導(dǎo)致瘤內(nèi)低氧。研究表明幾乎所有的實體腫瘤中均有乏氧細胞存在，距離功能性血管100～150 μmol/L處即可發(fā)生［6］。目前建立乏氧細胞模型的方法主要有兩種:一種是在乏氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)實驗細胞，即物理乏氧;它可以真實的反映腫瘤細胞乏氧微環(huán)境，但是，乏氧培養(yǎng)箱價格昂貴，從而一定程度上限制其在乏氧實驗中的廣泛開展。另一種乏氧方法是常氧條件下，在細胞培養(yǎng)液中加入一些化學物質(zhì)，通過抑制氧信號的傳導(dǎo)達到乏氧，即化學乏氧。其中，CoCl2是在正常氧條件下通過細胞內(nèi)離子置換，導(dǎo)致亞鐵螯合酶失活，阻止線粒體產(chǎn)生ATP，使線粒體內(nèi)呼吸障礙，從而達到細胞乏氧的目的，與細胞物理乏氧刺激具有相同的氧感受、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機制，且具有經(jīng)濟、方便、無毒的特點，在低氧研究中被廣泛應(yīng)用［7－8］。

表3　 A549細胞的侵襲率及遷徙率(±s，%)

注:與常氧組比較，cP＜0.05。

組別　n 侵襲率　　遷徙率常氧組3100±0　100±0乏氧組　3　326±17c　298±42c

既往研究通過光鏡觀察缺氧時腫瘤細胞的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)缺氧可導(dǎo)致腫瘤細胞體積變小，形態(tài)趨向圓形，似消化過程中間的細胞形態(tài)，偽足少且短，折光率減弱、貼壁能力下降等改變［9］。然而，可能受細胞類型、CoCl2干預(yù)濃度及觀察時間的影響，本實驗化學乏氧組A549細胞在光鏡下與常氧對照組形態(tài)基本一致，貼壁良好，未見脫落細胞增多以及大片細胞脫壁等現(xiàn)象，但是電鏡下化學乏氧組A549細胞不僅出現(xiàn)線粒體腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，而且出現(xiàn)自噬體。近年來研究顯示，在缺氧等應(yīng)激存在時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)及細胞自噬對促進細胞生存、維持細胞自我穩(wěn)態(tài)具有雙重作用。一方面，二者同線粒體一樣，通過激活caspase－12、caspase－9、caspase－3等，切割多種蛋白質(zhì)底物，引起“瀑布式”的級聯(lián)反應(yīng)，形成凋亡小體，最終誘導(dǎo)細胞凋亡［10－11］;另一方面通過激活p38SAPK激酶，使腫瘤細胞處于長期休眠狀態(tài)［12］，或通過降解細胞內(nèi)受損的蛋白、細胞器，合成新的大分子和ATP，減少氧耗，維持乏氧條件下細胞的存活［13］。本實驗電鏡下乏氧組A549細胞內(nèi)未發(fā)現(xiàn)凋亡小體，可能與二者在低濃度(≤200 μmol/L)［14］CoCl2化學乏氧24 h條件下對A549細胞生存起促進作用有關(guān)和(或)是其他抗凋亡途徑激活。

除細胞結(jié)構(gòu)發(fā)生改變外，本實驗通過MTT方法觀察CoCl2化學乏氧對離體A549細胞的生長、增殖的影響，結(jié)果示常氧條件下A549細胞呈S型曲線迅速生長，倍增時間短，對數(shù)生長期長; CoCl2化學乏氧條件下，A549細胞生長曲線低平，對數(shù)生長期延遲且短暫，過早進入生長平臺期。細胞生長受細胞周期調(diào)控，細胞周期由G1期、S期和G2期3個階段構(gòu)成，其中G1和G2期的細胞屬于靜止狀態(tài)，而S期的細胞則屬于增殖狀態(tài)，因此S期的細胞比例多少可以反映細胞增殖的速度及生長的活力。本實驗通過流式細胞儀PI技術(shù)檢測乏氧對A549細胞周期分布的影響，結(jié)果示CoCl2化學乏氧24 h后，A549細胞G2期比例較常氧對照組無明顯差異;但是G1期細胞較常氧對照組細胞逐漸增多，S期細胞逐漸減少，同吳欣愛等在食管癌細胞研究相似［15］。以上研究結(jié)果提示CoCl2化學乏氧可能通過誘導(dǎo)G1/S期阻滯抑制A549細胞增殖。

侵襲性生長及遠處轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤區(qū)別良性腫瘤的重要特征。近年來研究發(fā)現(xiàn)腫瘤乏氧微環(huán)境是促使腫瘤細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的始動因素［16］。在腫瘤細胞轉(zhuǎn)移過程中，侵襲、遷徙是必不可少的環(huán)節(jié)。國內(nèi)學者景紹武、蔣富強等［17－18］研究發(fā)現(xiàn)乏氧條件下，食管癌Eca109細胞及乳腺癌MCF－7細胞的侵襲、遷徙能力較常氧組明顯增加。在腫瘤細胞轉(zhuǎn)移過程中，多種物質(zhì)可刺激腫瘤細胞發(fā)生定向趨化運動，本實驗應(yīng)用A549細胞自身分泌的上清液為趨化因子，通過直接計數(shù)侵襲穿膜細胞數(shù)及侵襲率、MTT比色法測定微孔濾膜進入含趨化因子的下室貼壁細胞OD值間接計算各組A549細胞的遷徙率，結(jié)果示乏氧組人肺腺癌A549細胞的侵襲能力及遷徙能力亦較常氧組增強，與胡振紅等［19］研究相似。

綜上所述，本實驗采用低濃度(≤200 μmol/L)CoCl2建立化學乏氧環(huán)境，電鏡下發(fā)現(xiàn)人肺腺癌A549細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，出現(xiàn)自噬體，其G1/S期阻滯，A549細胞生長、增殖受抑，但A549細胞侵襲能力及遷徙能力較常氧條件下明顯增強。而其具體機制將在后續(xù)實驗中進一步研究。

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·論著·

Effect of CoCl2induced chemical hypoxia on proliferation，invasion and migration in human lung adenocarcinoma A549 cells

Li Fang1，Hong Kun2，Huang Li3，Su Xiaoli3，Hu Chengping3
(1.Department of Respiratory and Critical Diseases，the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China;

2.Yueyang Vocational Technical College，Yueyang 414000，China;

3.Department of Respiratory and Critical Diseases，Xiangya Hospital，Central South University，Changsha 410007，China)

【Abstract】Objective To investigate the effect of CoCl2induced chemical hypoxia on proliferation，invasion and migration in human lung adenocarcinoma A549 cells.Methods CoCl2was utilized to establish chemical hypoxia model of human lung adenocarcinoma A549 cells.First，inverted light and electron microscope，MTT assay and flow cytometry were used to observe the effect of CoCl2on the morphology and structure，proliferation and cell cycle of A549 cells.Then，transwell booth model was used to detect the capability of cellular invasion and migration of A549 cells.Results Compared with control group，there were fewer cells and mitochondrial swelling，endoplasmic reticulum expansion and autophagic vacuoles in A549 cells of CoCl2group，with low and flat growth curve，more G1phase cells and less S phase cells，while the ability of migration and invasion were both increased.Conclusion CoCl2induced chemical hypoxia inhibited cell proliferation，induced G1/S arrest，and enhanced the ability of invasion and migration in human lung A549 cell.

【Key words】CoCl2; lung adenocarcinoma; proliferation; invasion; migration

(收稿日期:2015－03－16)

通訊作者:胡成平，E－mail: huchengp28@126.com。

doi:10.3969/j.issn.1004－437X.2015.06.001

【中圖分類號】R 734.2