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大型生物制藥廠的病毒雞胚培養(yǎng)

2015-03-22 14:20:36孫愛(ài)喜上海海利生物技術(shù)股份有限公司201403
關(guān)鍵詞:尿囊氣室種蛋

孫愛(ài)喜 上海海利生物技術(shù)股份有限公司201403

大型生物制藥廠的病毒雞胚培養(yǎng)

孫愛(ài)喜 上海海利生物技術(shù)股份有限公司201403

雞胚培養(yǎng)是培養(yǎng)某些病毒的常用方法,可用于某些病毒的分離、增殖、毒力滴定、中和試驗(yàn)及生產(chǎn)疫苗等?,F(xiàn)代化大型生物制品廠采用尿囊腔接種法培養(yǎng)病毒液用于生產(chǎn)疫苗,生產(chǎn)實(shí)踐早已證明,種蛋的質(zhì)量、抗原生產(chǎn)工藝對(duì)生成尿囊液量及其效價(jià)高低起決定作用,直接影響產(chǎn)品質(zhì)量和雞免疫后的抗體水平。本文結(jié)合某些大型獸用生物制品企業(yè)生產(chǎn)案例,對(duì)病毒雞胚培養(yǎng)進(jìn)行闡述。

疫苗生產(chǎn);雞胚培養(yǎng)法;尿囊液量;病毒含量

近年來(lái)滅活苗的應(yīng)用越來(lái)越廣泛,對(duì)禽病的防制也起著越來(lái)越重要的作用。雖然組織培養(yǎng)和生物工程技術(shù)的發(fā)展很快,但是雞胚培養(yǎng)技術(shù)仍因其來(lái)源充足、操作簡(jiǎn)單和投入少等優(yōu)點(diǎn)被廣泛地用于病毒的分離、鑒定和抗原制備,尤其是獸醫(yī)生物制品的制造。幾種主要禽用疫苗如雞新城疫(ND)、禽流感(AI)和傳染性支氣管炎(IB)等疫苗病毒液的生產(chǎn)均采用雞胚培養(yǎng)的方法。

1 病毒雞胚培養(yǎng)

雞胚(包括鴨胚)是正在發(fā)育中的機(jī)體,多種動(dòng)物病毒能在雞胚中增殖和傳代,并可用雞胚制備某些病毒抗原、疫苗和卵黃抗體等。

(1)雞胚培養(yǎng)法的優(yōu)點(diǎn)。胚體通常無(wú)菌,對(duì)接種的病毒不產(chǎn)生抗體,易于病毒增殖。雞胚來(lái)源充足,可選擇不同的日齡和接種途徑,設(shè)備和操作簡(jiǎn)便。感染病毒的組織和尿囊液中含有大量病毒,容易采集和處理。

(2)雞胚培養(yǎng)法的缺點(diǎn)。雞胚用量巨大,生產(chǎn)過(guò)程中需要大量人力進(jìn)行雞胚接種和收獲操作。卵黃含有因母雞免疫而產(chǎn)生的母源抗體,影響同種病毒的增殖。容易導(dǎo)致外源污染,細(xì)菌如沙門(mén)氏菌等,經(jīng)母雞垂直傳遞的病毒,如禽白血病病毒及新城疫、禽腦脊髓炎和Rous肉瘤病毒等。

(3)雞胚培養(yǎng)接種方法及途徑。雞胚培養(yǎng)病毒根據(jù)接種途徑主要有絨毛尿囊腔接種、絨毛尿囊膜接種、卵黃囊接種和羊膜腔接種方法,根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)耐緩健D蚰仪唤臃N主要用于正粘病毒和副粘病毒,例如流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒,減蛋綜合征病毒分離和增殖。病毒液接種于10~11日齡尿囊腔,每胚0.1mL。絨毛尿囊膜接種主要用于痘病毒和皰疹病毒的分離和增殖。選用10~12日齡雞胚制造“人工氣室”,用注射器滴2~3滴種毒液于絨毛尿囊膜,用透明膠紙覆蓋卵窗,周?chē)恳匀刍炦M(jìn)行密封,氣室小孔亦用石蠟密封。所有雞胚接種完成后人工氣室向上橫放,置于孵化箱中,期間禁止翻動(dòng)。卵黃囊接種主要用于蟲(chóng)媒披膜病毒及鸚鵡熱衣原體和立克次氏體等的分離和增殖。選用6~8日齡雞胚,氣室向上垂直放置,用碘酊和酒精消毒氣室端,氣室頂端中央打孔,用滅菌注射器吸取含病毒懸液,沿氣室端小孔剌入約3cm,注入0.1~0.5mL種毒液于卵黃囊內(nèi)。石蠟封孔后置孵箱內(nèi)繼續(xù)孵育。羊膜腔接種主要用于正粘病毒和副粘病毒的分離和增殖。病料初次分離病毒時(shí),羊膜腔接種法比尿囊腔接種法敏感。選用11~12日齡的雞胚,按絨毛尿囊膜接種法造“人工氣室”,撕去卵殼,并剌破絨毛尿囊膜血管較少的部位,用鈍端鑷子沿此破孔插入,夾起羊膜囊,注入0.1~0.2mL種毒液。

2 大型生物制藥廠的雞胚培養(yǎng)

目前,國(guó)內(nèi)大型生物制品廠的病毒雞胚培養(yǎng),生產(chǎn)批次3~10萬(wàn)枚/批,均采用全自動(dòng)設(shè)備進(jìn)行雞胚接種和抗原收獲取代人工操作,生產(chǎn)效率得以大幅提高。雞胚尿囊液收獲量及其病毒含量的多少直接影響疫苗的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益,決定生物制品的質(zhì)量。因此,做好雞胚的質(zhì)量、種毒篩選和生產(chǎn)過(guò)程關(guān)鍵點(diǎn)控制非常必要,如種蛋選擇、儲(chǔ)存及孵化前處理,雞胚孵化過(guò)程和生產(chǎn)工藝等。

(1)種蛋選擇。雞胚的質(zhì)量主要取決于種蛋質(zhì)量,要想得到效價(jià)和產(chǎn)量高的病毒液,首先要選擇優(yōu)質(zhì)種蛋,SPF種蛋最為理想。根據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求選用SPF蛋最佳,即來(lái)自不含雞22種病原體的雞群產(chǎn)的蛋,適用于生產(chǎn)各種雞用疫苗。但SPF蛋受價(jià)格高、供應(yīng)量不足、禽滅活苗抗原用量大,成品苗價(jià)格不高等因素影響,禽滅活苗用非免疫種蛋生產(chǎn)。非免疫種蛋指來(lái)自于未接受特種病原體免疫和未感染此種病原體的雞群,即種蛋不含特定病原的母源抗體。大小均勻,蛋重55~65g。種蛋孵化至10日齡胚的有效率達(dá)90%以上。蛋殼表面較光滑,無(wú)糞便污染。蛋殼鈣質(zhì)均勻,無(wú)破殼、薄殼和花殼蛋。選擇不含特定病原母源抗體的非免疫種蛋,卵黃抗體水平符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

(2)種蛋儲(chǔ)存。用于疫苗生產(chǎn)的種蛋13~18℃保存期在1周以?xún)?nèi)。胚胎發(fā)育的臨界溫度是23.9℃。高于這個(gè)溫度胚胎就會(huì)發(fā)育,低于這個(gè)溫度胚胎就會(huì)停止發(fā)育。但決不能認(rèn)為種蛋儲(chǔ)存只要低于23.9℃就行,因?yàn)榕咛ピ诘陀?3.9℃的某一溫度范圍內(nèi),胚胎的生理代謝仍然存在,在這種條件下儲(chǔ)存的種蛋活力就會(huì)降低,當(dāng)轉(zhuǎn)入正常孵化時(shí)胚胎衰弱,死亡增加,影響孵化效率。所以種蛋儲(chǔ)存時(shí),要使胚胎的生理代謝降到最低程度,同時(shí)又不能使種蛋受凍(不得低于5℃)。

種蛋保存時(shí)間在產(chǎn)后1周內(nèi)為宜,最好控制在3~5天。種蛋保存1周以?xún)?nèi)可不翻蛋,如保存期超過(guò)1周以上每天翻蛋1~2次,可防止胚胎與蛋殼膜粘連,有利于提高種蛋孵化率。種蛋儲(chǔ)存間溫度控制在13~18℃。根據(jù)各地區(qū)氣溫高低和儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)短而異,種蛋保存時(shí)間短,溫度控制的高些,保存時(shí)間長(zhǎng),溫度適當(dāng)?shù)托?。保存期越長(zhǎng),孵化效果不佳,即使在最適宜的環(huán)境下,保存期也不宜超過(guò)10天。儲(chǔ)蛋庫(kù)的相對(duì)濕度控制在70%~80%。種蛋在儲(chǔ)存期間,蛋內(nèi)水分通過(guò)蛋殼蒸發(fā),濕度低水分蒸發(fā)快,反之水分蒸發(fā)慢。種蛋進(jìn)入種蛋庫(kù)前應(yīng)及時(shí)消毒,并對(duì)接觸種蛋的蛋箱、蛋托和蛋架等用福爾馬林或過(guò)氧乙酸熏蒸消毒。儲(chǔ)存前不能用水洗刷種蛋,否則會(huì)導(dǎo)致蛋殼上的膠質(zhì)膜破壞,降低種蛋品質(zhì)使孵化率降低。做好通風(fēng),使種蛋庫(kù)內(nèi)空氣新鮮不能有異味,防止產(chǎn)生臭蛋和霉蛋。

(3)種蛋孵化前的處理。入室孵化前除去種蛋表面污物,并進(jìn)行消毒處理。用挑選和磨砂處理的方法去除表面有污物的種蛋。經(jīng)選擇的種蛋按28mL/m3福爾馬林、14g高錳酸鉀密閉熏蒸半小時(shí),可殺滅蛋殼上95%~98.5%的病原體。種蛋入孵前用0.1%新潔爾滅浸泡消毒,可以防止霉菌及病原微生物增殖而污染種蛋。種蛋大頭向上置于蛋盤(pán)內(nèi),裝蛋車(chē)推入孵箱開(kāi)始孵化。

(4)雞胚孵化過(guò)程控制。高質(zhì)量雞胚需要適宜的孵化條件,包括溫度、濕度、翻蛋和通風(fēng)。孵化過(guò)程中,溫度是最重要的影響因素,關(guān)系到種蛋孵化率的高低和雞胚品質(zhì)的好壞。前孵溫度設(shè)置為37.8±0.5℃,后孵溫度為37.0±0.5℃。溫度偏高導(dǎo)致雞胚發(fā)育過(guò)快,收獲時(shí)尿囊液量少;溫度偏低胚胎發(fā)育慢,10~11日齡的雞胚血管網(wǎng)發(fā)育不到胚蛋的小頭,種蛋蛋白不能被吸收轉(zhuǎn)化成尿囊液,收獲量也會(huì)減少。濕度前、后孵化均設(shè)置為65±5%,濕度過(guò)大,超過(guò)70%會(huì)妨礙蛋內(nèi)水分蒸發(fā)和胚胎發(fā)育;濕度過(guò)低,蛋內(nèi)水分大量蒸發(fā),胚胎同樣發(fā)育不良且接種后尿囊液減少,影響抗原產(chǎn)量。翻蛋2小時(shí)/次,翻蛋的角度要達(dá)到左右各45°。翻蛋是胚胎正常發(fā)育不可缺少的條件之一。有報(bào)道稱(chēng)翻蛋對(duì)胚胎的發(fā)育和生理學(xué)有積極作用,可保持胚外囊(尿囊、羊膜囊、蛋白囊和卵黃囊)的正常方位和胚胎的水平衡,有利于胚外囊的生長(zhǎng)和胚胎營(yíng)養(yǎng)的吸收。通風(fēng)換氣直接影響胚胎正常新陳代謝和孵化效果。隨著雞胚胚齡的增長(zhǎng),其代謝能力增強(qiáng),氧氣的需求量增多,如不及時(shí)排出污濁氣體、換入新鮮空氣,胚胎發(fā)育會(huì)受到嚴(yán)重影響,嚴(yán)重時(shí)可造成雞胚死亡率升高。

(5)生產(chǎn)工藝。生產(chǎn)工藝的影響因素包括接種和收獲時(shí)雞胚的日齡、病毒種類(lèi)及接毒劑量、接種收獲設(shè)備穩(wěn)定性和接種胚收獲前冰蛋處理。接種9~11齡雞胚,13~14日齡收獲時(shí)的雞胚尿囊液量最多。種毒效價(jià)必須符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求,高質(zhì)量的種毒才能生產(chǎn)出合格的抗原。不同類(lèi)型病毒在雞胚內(nèi)繁殖規(guī)律及對(duì)雞胚發(fā)育的影響不同,不同抗原制造執(zhí)行各自的生產(chǎn)工藝。接種開(kāi)始前接種設(shè)備的管道、接種針和種毒瓶等物品滅菌處理,避免污染引起雞胚死亡。根據(jù)胚蛋大小調(diào)節(jié)接種針的進(jìn)針深度,既要保證種毒接進(jìn)尿囊腔內(nèi),又要避面進(jìn)針過(guò)深扎死雞胚。觀察接種針是否有彎曲和倒刺,刺破或刮斷血管造成接種胚的死亡率增加。后孵化結(jié)束后雞胚做冰蛋處理,目的是讓雞胚血管收縮,防止收獲時(shí)血管破裂紅細(xì)胞進(jìn)入抗原,影響抗原質(zhì)量。-20℃冷庫(kù)2~4小時(shí)或2~8℃冷藏過(guò)夜,冰蛋時(shí)間視胚蛋總量和冷庫(kù)制冷量靈活把控。-20℃條件下控制好時(shí)間防止凍結(jié),解凍后收獲尿囊液收獲量會(huì)減少10%~20%;2~8℃冷藏氣室向上直立4~24小時(shí),冷藏時(shí)間過(guò)長(zhǎng)收獲量也會(huì)減少。冷卻的雞胚取出,用消毒劑消毒氣室部位。剝除氣室部蛋殼,穿破卵殼膜和絨毛尿囊膜,通過(guò)負(fù)壓真空收取尿囊液并存放于滅菌容器內(nèi)。收獲頭的高度,真空壓力適宜,避免收獲頭過(guò)低壓破蛋黃影響抗原質(zhì)量。收獲頭過(guò)高或真空壓力過(guò)低,尿囊液收取不凈影響收獲總量。

綜上所述,病毒雞胚培養(yǎng)應(yīng)用廣泛和成熟,給予適宜病毒繁殖擴(kuò)增的生理生化條件,選用優(yōu)質(zhì)雞胚,控制好孵化溫濕度,按照工藝規(guī)程和崗位操作SOP組織生產(chǎn),能得到高質(zhì)量的抗原用于制備優(yōu)質(zhì)疫苗,并獲得良好的經(jīng)濟(jì)效益。

[1]徐秀臣,王麗男.影響病毒在雞胚中增殖的因素.畜牧獸醫(yī)科技信息,2003.8.

[2]江興華.影響雞新城疫(LaSota株)活疫苗抗原病毒含量因素的探討.福建畜牧獸醫(yī),第33卷第4期2011年.

[3]丁常春.濕度對(duì)雞胚發(fā)育的影響及實(shí)際應(yīng)用,農(nóng)村科技,2000年06期.

[4]劉宇卓.雞胚培養(yǎng)技術(shù)中影響雞胚質(zhì)量的幾個(gè)問(wèn)題,中國(guó)禽業(yè)導(dǎo)刊,1999年第6期.

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