王丹妮 鄭春靜 江婷佳 劉 軍①

(1. 中國計量學院 杭州 310018; 2. 寧波市海洋與漁業(yè)研究院 寧波 315010)

Wap65蛋白(Warm temperature acclimation 65kDa protein)是血漿蛋白的一種, 最早發(fā)現(xiàn)于金魚、鯉魚體內(nèi)(Kikuchiet al, 1995)。實驗結(jié)果表明, 金魚和鯉魚在高溫誘導下, 有一種分子量為65kDa的蛋白大量存在于各組織中, 被命名為Wap65, 此蛋白與哺乳動物的血紅素結(jié)合蛋白高度同源(Altrudaet al, 1985;Nikkilaet al, 1991; Morganet al, 1993; Tolosanoet al,2002)。研究發(fā)現(xiàn), Wap65基因在不斷進化中, 由于受到串聯(lián)機制和全基因組重復的影響(Shaet al, 2008),產(chǎn)生了兩種不同的異構(gòu)體, 分化為兩種蛋白, 分別為Wap65-1和 Wap65-2。目前, 已經(jīng)在許多魚類發(fā)現(xiàn)了該基因, 包括青 鳉魚(Hirayamaet al, 2004)、藍鯰魚(Peatmanet al, 2008)、斑點叉尾(Shaet al, 2008)、劍尾魚(Alizaet al, 2008)、 紅鰭東方 鲀(Hirayamaet al,2003)、真裸南極魚(Clarket al, 2008)、香魚(Shiet al,2010)、鱸魚(Sarropoulouet al, 2010)、大鱗泥鰍(Choet al, 2012)等。

藍點馬鮫(Scomberomorus niphonius)屬于輻鰭亞綱、鱸形目、鯖亞目、鯖科、馬鮫屬, 廣泛分布于北太平洋西部, 在我國產(chǎn)于東海、黃海和渤海, 在南海以海南文昌鋪前附近海域最為著名。由于近年來人們對藍點馬鮫的肆意捕撈以及環(huán)境不斷惡化, 導致藍點馬鮫的產(chǎn)量急劇減少, 目前已經(jīng)在中國寧波象山建立了藍點馬鮫的保護基地。藍點馬鮫屬近海溫水性洄游魚類, 因此高溫是藍點馬鮫的生存及生產(chǎn)的重要因素之一。

在NCBI數(shù)據(jù)分析中發(fā)現(xiàn), 對藍點馬鮫Wap65的研究主要集中在微衛(wèi)星的研究上, 本研究通過克隆Wap65-1和Wap65-2的基因全長序列, 并表達相應(yīng)蛋白, 研究其功能, 以期為藍點馬鮫耐熱品種的培育提供資料。

1 材料與方法

1.1 材料

2014年 5月在浙江省寧波市象山港捕撈藍點馬鮫樣本12尾[平均重(750±5)g], 取頭、肌肉、肝臟、脾臟、頭腎這 5個組織迅速投入液氮中保存, 根據(jù)TRIzol?Plus RNA Purification Kit (Invitrogen)提取上述 5個組織的總 RNA(步驟見說明書), 并采用SuperScriptTMFist-Strand Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄為cDNA, 并保存于–20°C冰箱備用。熱誘導實驗所用的魚苗來自寧波市海灣苗種繁育中心, 共取24尾[平均重(1.0±0.2)g], 熱處理后, 保存于液氮中備用。

1.2 方法

1.2.1 Wap65-1和 Wap65-2基因全長的克隆 根據(jù) NCBI中黑棘鯛(Acanthopagrus schlegeli)、花鱸(Lateolabrax japonicus)、條石鯛(Oplegnathus fasciatus)的Wap65-1以及真裸南極魚(Harpagifer antarcticus)、花鱸(Lateolabrax japonicus)、魚(Miichthys miiuy)的Wap65-2氨基酸序列, 利用ClustalW對以上序列進行保守性分析并分別設(shè)計簡并性引物(見表1)。

以藍點馬鮫肝臟 cDNA為模板, 采用巣式 PCR(第一輪引物采用F1和R1, 第二輪引物采用F2和R2),克隆 Wap65-1和 Wap65-2的部分片段, 采用Platinum?PCR SuperMix High Fidelity酶(Invitrogen),進行兩輪PCR, 體系為25μL, 反應(yīng)條件均為: 94°C預變性 2min; 94°C 30s, 62°C 30s, 68°C 2min, 38 個循環(huán),產(chǎn)物保存于–20°C。

表1 實驗中所用到的引物序列Tab.1 The sequence of primers used in this study

然后根據(jù)已獲得的 Wap65-1和Wap65-2基因部分片段分別設(shè)計3′和5′RACE特異性引物(見表1), 利用Gene RACETMKit擴增得到cDNA全長。第一輪PCR反應(yīng)體系為12.5μL, 反應(yīng)條件: 94°C預變性2min;98°C 10s, 72°C 30s, 5個循環(huán); 98°C 10s, 70°C 30s, 5個循環(huán); 98°C 10s, 65°C 30s, 25個循環(huán); 最后, 68°C徹底延伸 5min。第二輪 PCR反應(yīng)體系 20μL, 反應(yīng)條件:94°C, 2min, 98°C 10s, 65°C 30s, 30個循環(huán); 最后68°C徹底延伸5min。PCR產(chǎn)物保存于–20°C。

上述所有 PCR產(chǎn)物與 pUCm-T載體連接, 轉(zhuǎn)化到E. coliDH5α感受態(tài)細胞中, 培養(yǎng)過夜, 每塊板隨機挑選 5個菌落, 然后進行菌落檢測, 選取陽性菌,送往上海生物工程有限公司進行測序。

序列拼接后, 得到 Wap65-1和 Wap65-2基因的cDNA 序列全長, 并設(shè)計引物, 進行全長克隆, 克隆所得的基因序列與拼接序列一致, 從而確定基因的序列。

1.2.2 生物信息學的分析 運用 NCBI中的BLASTN對Wap65-1和Wap65-2基因的同源性進行分析, 用MEGA 5軟件構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)進化樹, 并利用 PredictProtein軟件對 Wap65-1和Wap65-2蛋白序列進行功能位點分析, 采用DNAMAN軟件將藍點馬鮫的這兩種氨基酸序列和已知的其它魚類的氨基酸序列進行比對和分析, 采用Signal P 4.1工具進行蛋白信號肽分析。

1.2.3 藍點馬鮫幼體高溫脅迫及兩種基因的表達特征分析 將藍點馬鮫的幼體在 20°C、25°C、30°C、35°C的溫度下進行 1h的熱誘導, 然后提取總 RNA,并逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA, 用于熒光定量表達分析。根據(jù)Beacon Designer 7.0設(shè)計目的基因及內(nèi)參引物(見表1)。采用 Power SYBR?Green PCR Master Mix進行熒光定量 PCR(反應(yīng)體系及反應(yīng)條件見說明書)。采用2–ΔΔCT法計算 Wap65-1和 Wap65-2基因的表達量并進行分析, 并用SPSS11.0軟件進行顯著性分析。

1.2.4 藍點馬鮫Wap65-1和Wap65-2原核表達及E.coliBL21 (DE3)熱耐受性實驗 設(shè)計特異性引物(見表 1), 擴增兩個基因 ORF, 用EcoRⅠ和NdeⅠ對目的基因及 pCold TF載體分別雙酶切, 根據(jù)In-Fusion?HD Cloning Kit (Clontech)構(gòu)建重組質(zhì)粒并導入表達宿主菌E. coliBL21 (DE3), 37°C培養(yǎng)至OD值 0.4—0.6之間, 15°C 進行冷休克, 然后加入IPTG(至終濃度為0.5mmol/L), 15°C低溫誘導20 h。之后離心, 收集總蛋白, 剩下的菌液超聲破碎, 收集上清, 然后將總蛋白及上清進行 SDS-PAGE電泳分析。再取一部分樣品, SDS-PAGE電泳后, 用His-Tag Monoclonal Antibody一抗, 做Western blot分析, 經(jīng)過轉(zhuǎn)膜、雜交及顯色, 分析蛋白的表達情況。

在熱耐受性實驗中, 將帶有 pCold TF、Wap65-1-pCold TF、Wap65-2-pCold TF基因的E. coliBL21 (DE3)菌株, 接種后, 37°C擴大培養(yǎng)使其OD值在 0.5, 然后加入 IPTG(終濃度 0.5mmol/L)低溫誘導20h 后, 取出測其 OD值均在 0.6—0.7, 在保證菌液濃度一致的條件下, 分別取1mL的細菌轉(zhuǎn)移到45°C條件下, 熱處理 0、15、30、45和60min, 每個時間點的菌液濃度保持一致, 并在每個時間點取 50μL菌液, 然后稀釋50倍后, 取100μL涂板, 37°C過夜培養(yǎng),計算每個培養(yǎng)板的菌落數(shù)目。運用SPSS軟件進行分析, 并計算細菌生存率, 數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差表示。

2 結(jié)果

2.1 Wap65-1和Wap65-2基因全長cDNA序列分析

采用RACE的方法獲得Wap65-1和Wap65-2的cDNA序列全長。登錄號分別為: KT356862和KT356863。Wap65-1 基因長度為 1659bp, 其中 5′和 3′未參與編碼的堿基長度分別為71bp和307bp, 開放閱讀框(ORF)為 1281bp, 編碼區(qū)編碼 426個氨基酸, 預測分子量大小約為48.74kDa, 理論等電點為5.5, 3’端含有終止密碼子 TAA及一個 ploy(A)尾巴。運用Predictprotein分析藍點馬鮫的 Wap65-1蛋白功能位點, 發(fā)現(xiàn)具有多個功能位點的蛋白序列, 包括2個N-糖基化位點(67—70和179—182), 2個蛋白激酶C磷酸化位點(362—364和365—367); 8個酪蛋白磷酸化位點(40—43, 69—72, 93—96, 199—202, 286—289,293—296, 316—319及353—356); 5個酪氨酸激酶磷酸化位點(113—120, 155—162, 185—191, 211—219及 302—309); 3個 N-甲基化位點(62—67, 252—257及 420—425)。

Wap65-2基因長度為 1725bp, 其中, 5′和 3′的未參與編碼的堿基長度分別為83bp和331bp, 開放閱讀框(ORF)為 1311bp, 編碼區(qū)編碼 436個氨基酸, 預測分子量大小約為48.45kDa, 理論等電點為5.7, 3’端含有終止密碼子 TAA及一個 ploy(A)尾巴。運用Predictprotein分析藍點馬鮫的 Wap65-2蛋白序列的功能位點, 同樣發(fā)現(xiàn)具有多個功能位點的蛋白序列,包括3個N糖基化位點(78—81和208—211, 220—223), 7個蛋白激酶C磷酸化位點(80—82, 179—181,277—279, 290—292, 334—336, 373—375 和 411—413), 11個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(51—54, 80—83,144—147, 251—254, 257—260, 277—280, 290—293,296—299, 303—306, 316—329及334—337), 2個酪氨酸激酶磷酸化位點(166—173和196—202), 3個肉蔻?；稽c(32—37, 240—245和387—392)。

2.2 Wap65-1和Wap65-2基因多序列比對及系統(tǒng)進化樹分析

使用 DNAMAN軟件對藍點馬鮫 Wap65-1和Wap65-2的氨基酸序列進行同源序列分析, 結(jié)果如圖3所示, 藍點馬鮫(Scomberomorus niphonius)Wap65-1基因與花鱸(Lateolabrax japonicus)的同源性為 86%,與條石鯛(Oplegnathus fasciatus)、金頭鯛(Sparusaurata)、黑棘鯛(Acanthopagrus schlegeli)的同源性為85%。利用MEGA5軟件進行系統(tǒng)進化分析, 結(jié)果表明, 藍點馬鮫 Wap65-1基因與花鱸的親緣關(guān)系比較近。藍點馬鮫(Scomberomorus niphonius)Wap65-2基因與條石鯛(Oplegnathus fasciatus)、花鱸(Lateolabraxjaponicus)的同源性為 84%, 與南極真裸魚(Harpagifer antarcticus)、魚(Miichthys miiuy)的同源性為82%,與大菱鲆(Scophthalmus maximus)的同源性為 80%。利用 MEGA5軟件進行系統(tǒng)進化分析, 結(jié)果表明,藍點馬鮫 Wap65-2與條石鯛、花鱸的親緣關(guān)系比較近。

圖2 Wap65-2開放閱讀框核苷酸序列及推導編碼的氨基酸Fig.2 The open reading frame of full length cDNA of Wap65-2 gene and deduced amino acid sequence方框里ATG為起始密碼子, TAG為終止密碼子, 下劃線為信號肽

2.3 Wap65-1和Wap65-2在不同溫度下mRNA的表達特征分析

qRT-PCR結(jié)果表明: 藍點馬鮫 Wap65-1基因和Wap65-2 基因在 20°C、25°C、30°C、35°C 分別都有表達, 而 Wap65-2的表達量隨著溫度的增高而明顯增高, 這一結(jié)果與所查文獻所得出的結(jié)果類似, 在藍點馬鮫體內(nèi), 主要參與溫度調(diào)節(jié)的基因是Wap65-2。

圖3 藍點馬鮫Wap65-1和Wap65-2氨基酸序列與其它魚類氨基酸序列比對Fig.3 Amino acid sequence alignment of Wap65-1 and Wap65-2 from S. niphonius with other fishes同種氨基酸用相同顏色背景表示; 缺失的氨基酸用“.”表示

圖4 藍點馬鮫Wap65-1和Wap65-2基因與其它魚類的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of Wap65-1 and Wap65-2 from S. niphonius and other fishes

圖5 藍點馬鮫幼體在不同溫度下Wap65-1和Wap65-2的相對表達量Fig.5 Expression characterization of Wap65-1 and Wap65-2 transcript in different temperature

2.4 藍點馬鮫 Wap65-1和 Wap65-2原核表達及 E.coli BL21 (DE3)熱耐受性實驗

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)IPTG誘導后,SDS-PAGE檢測表明在相對分子質(zhì)量為100kDa處出現(xiàn)濃度較高的表達條帶, 由于 pCold TF載體自帶表達伴侶, 所以表達出的蛋白分子量應(yīng)減掉自帶分子伴侶的分子量(48kDa)。經(jīng)過計算后, 所得蛋白的分子量與預測一致, 并且用His-Tag Monoclonal Antibody一抗進行Western blot分析(見圖6)。

通過對表達 pCold TF、Wap65-1-pCold TF、Wap65-2-pCold TF 的E. coliBL21 (DE3)進行 45°C 的熱處理, 在處理15、30、45和60min后, 細菌生存率分別是40%、22%、15%、7%, 以及75%、60%、45%、30%; 而對照組(含pCold TF)細菌生存率在上述各時間點分別是30%、17%、10%和5%(見圖 7), 這說明熱刺激條件下, Wap65-1-pCold TF和Wap65-2-pCold TF對細菌都起到了一定程度的保護作用, 而 Wap65-2與空白對照組比較, 表明其保護作用尤為顯著。

圖6 藍點馬鮫Wap65基因的原核表達Fig.6 Prokaryotic expression of S. niphoniusa. Wap65兩種蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果; b. Wap65兩種蛋白的Western bolt分析結(jié)果

圖7 Wap65基因在高溫脅迫下保護實驗Fig.7 The protection experiments of Wap65 under high temperature stress

3 討論

Wap65廣泛存在于硬骨魚類的血漿蛋白, 參與了體內(nèi)多種機制的調(diào)控。本次研究通過克隆技術(shù)獲得了藍點馬鮫Wap65-1和Wap65-2的cDNA全長序列,通過 SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果表明, Wap65-1和Wap65-2的分子量大約為48kDa, 與理論大致吻合。兩個基因的N端都有19個氨基酸序列為信號肽序列,與花鱸及其它硬骨魚類的 Wap65基因一樣。雖然Wap65-1與Wap65-2是具有同源性的, 但是, Wap65-2蛋白具有魚類Wap65的典型結(jié)構(gòu)特征, 具有保守的7個疏水殘基和2個組氨酸殘基, 這些都與血紅素結(jié)合區(qū)的形成有關(guān)(史雨紅等, 2012), 而Wap65-1卻沒有。

通過對蛋白質(zhì)氨基酸的分析, 發(fā)現(xiàn)在氨基酸的組成中, 兩種蛋白賴氨酸和組氨酸的含量比較高, 其氨基酸上含有多個功能位點, 例如糖基化、磷酸化等,有助于進一步研究蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和功能, 同樣也促進了蛋白質(zhì)的主要定位。

通過對其進化的分析, 結(jié)果表明: 藍點馬鮫的Wap65-1與花鱸親緣關(guān)系最近, Wap65-2與條石鯛、花鱸的Wap65-2親緣關(guān)系最近。

許多資料證明, Wap65-1與Wap65-2除了在分子特征的差異, 其表達量在不同溫度下, 也有差異。在高溫處理的藍點馬鮫幼體組織定量結(jié)果表明,Wap65-2的表達量隨著溫度的升高表達量呈顯著性差異(P<0.05), 與所查文獻結(jié)果一致。這就說明了在藍點馬鮫體內(nèi), 其參與溫度調(diào)節(jié)的主要是Wap65-2。

魚類Wap65-1和Wap65-2表達的差異性證明了它們之間的功能的差異性。通過對魚類在進化過程中適應(yīng)性的分析, 可以知道 Wap65-2仍然處于快速的進化當中, 其中也存在著一些選擇位點, 稱為正達爾文選擇位點, 尤其是在 Wap65-2中該位點更多一些(Sarropoulouet al, 2010)。

目前, 對 Wap65這類蛋白的功能研究還不是很多, 除了與溫度有關(guān), 還與其它多種環(huán)境應(yīng)激因子有關(guān), 例如水的鹽度(Choiet al, 2008), 重金屬脅迫等有關(guān)(Georgeet al, 2004; Hayeset al, 2004; Berthetet al, 2005; Burgoset al, 2005)。另外, 許多數(shù)據(jù)研究發(fā)現(xiàn), 魚類的免疫系統(tǒng)與 Wap65之間的關(guān)系非常密切,而且細菌、LPS也會誘導Wap65的上調(diào)(Peatmanet al,2008), 此外, 轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)NF-IL6存在于Wap65-2基因 5’調(diào)控區(qū), 表明免疫因子調(diào)節(jié)與 Wap65-2的表達可能相關(guān)。但是, 目前在功能和作用途徑仍不清楚。

本次研究成功克隆了藍點馬鮫 Wap65-1和Wap65-2基因的cDNA序列全長, 并通過不同溫度下其表達量的差異, 進一步確定Wap65-2與溫度之間的關(guān)系, 在溫度調(diào)節(jié)過程中起著重要的作用, 為以后深入研究 Wap65基因在魚類或者其它動物的功能奠定了基礎(chǔ)。

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