邵艷卿 方 軍 柏 艷, 張炯明 肖國(guó)強(qiáng)滕爽爽 劉 博 柴雪良①

(1. 浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所 浙江省近岸水域生物資源開(kāi)發(fā)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 溫州 325000;2. 溫州醫(yī)科大學(xué) 溫州 325000)

縊蟶(Sinonovacula constrictaLamarck)俗稱蟶(福建)、蜻(浙江)或跣(我國(guó)北方), 其肉味鮮美, 營(yíng)養(yǎng)豐富, 含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素和無(wú)機(jī)鹽。除供鮮食外, 還可制成蟶干、蟶油等, 是消費(fèi)者喜愛(ài)的海產(chǎn)食品, 也是我國(guó)傳統(tǒng)四大養(yǎng)殖貝類之一(王如才等,2008)。縊蟶養(yǎng)殖歷史悠久, 過(guò)去主要集中在福建和浙江一帶, 隨著縊蟶養(yǎng)殖業(yè)的不斷擴(kuò)展和人工育苗技術(shù)日漸成熟, 江蘇、山東等地紛紛引進(jìn)苗種, 有力地推動(dòng)了縊蟶養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。然而, 目前人工苗的親蟶絕大多數(shù)來(lái)自人工養(yǎng)殖, 其種質(zhì)屬于未經(jīng)遺傳改良的野生種, 在經(jīng)過(guò)多年累代繁、養(yǎng)殖之后, 出現(xiàn)了成活率低、生長(zhǎng)速度減慢和抗病力下降等生產(chǎn)性狀退化現(xiàn)象; 加之, 無(wú)序的養(yǎng)殖、盲目引種和養(yǎng)殖環(huán)境的日益惡化, 已經(jīng)嚴(yán)重制約了縊蟶養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展(王興強(qiáng)等, 2006; 劉博等, 2013)。因此, 采用有效方法培育出高產(chǎn)、抗逆的縊蟶優(yōu)良品種成為突破瓶頸、帶動(dòng)產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的當(dāng)務(wù)之急。

利用分子遺傳標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記輔助選育, 是當(dāng)今動(dòng)物遺傳育種研究的熱點(diǎn)之一。微衛(wèi)星也稱簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat, SSR), 是由1-6個(gè)核苷酸組成的簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)DNA序列(Tautz D, 1989), 按照其來(lái)源可分為基因組 SSR(G-SSR)和表達(dá)序列標(biāo)簽SSR(EST-SSR)。微衛(wèi)星標(biāo)記具有數(shù)量多、多態(tài)性豐富、共顯性遺傳、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)(Zaneet al, 2002; 劉芳等, 2006), 在篩選水產(chǎn)動(dòng)物形態(tài)、抗病、抗逆、性別等經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)標(biāo)記方面已被廣泛使用, 如在虹鱒(Oncorhynchus mykiss)(Rodriguezet al, 2004)、鯉魚(Cyprinus carpio)(張義鳳等, 2008; 顧穎等, 2009)、南美白對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)(Zhanget al, 2007)、馬氏珠母貝(Pinctada martensii)(鄧岳文等, 2013)、文蛤(Meretrix meretrix)(Luet al, 2013; Nieet al, 2013)等都已有相關(guān)報(bào)道, 而縊蟶在性狀相關(guān)標(biāo)記篩選方面則還未見(jiàn)報(bào)道。本研究首先構(gòu)建縊蟶全同胞家系, 進(jìn)而采用 SSR技術(shù)對(duì)其分子特征進(jìn)行檢測(cè), 并結(jié)合其數(shù)量性狀度量, 篩選與縊蟶生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)的分子標(biāo)記, 以期為縊蟶生長(zhǎng)性狀的QTLs定位、分子標(biāo)記輔助育種和新品種培育提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

所用縊蟶樣品為2011年10月在浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所清江基地培育的全同胞(F1)家系(包含父母本樣品), 養(yǎng)殖一齡后隨機(jī)取120顆, 測(cè)量殼長(zhǎng)、殼高、體重等指標(biāo), 解剖取肌肉組織, 固定于90%乙醇中備用。

1.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增及檢測(cè)

基因組 DNA 采用常規(guī)的苯酚/氯仿/異戊醇法抽提, 用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度, 再用無(wú)菌水統(tǒng)一調(diào)至100ng/μL, –20°C保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)體系總體積為25μL, 包括10×PCR buffer 2.5μL, 25mmol/L MgCl22.5μL, 2.5mmol/L dNTPs 2μL, 上下游引物(10μmol/L)各 1.0μL, 5U/μL Taq DNA 聚合酶(TaKaRa)0.13μL,DNA模板 1.0μL, 加滅菌雙蒸水至 25μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)? 94°C預(yù)變性5min, 進(jìn)入30個(gè)PCR循環(huán)[94°C 30s, 退火溫度(表 1) 30s, 72°C 30s], 最后 72°C 下延伸7min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè), 硝酸銀染色。

本實(shí)驗(yàn)所用引物來(lái)自劉博等(2012)已發(fā)表的和后續(xù)自主設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)。所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成, 根據(jù)親本篩選出 16對(duì)多態(tài)性引物用于后續(xù)研究(表1)。

1.3 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

根據(jù)電泳圖譜, 并參照引物設(shè)計(jì)時(shí)預(yù)期片段的大小判讀、統(tǒng)計(jì)條帶。用PopGene (Verion3.2)軟件計(jì)算各位點(diǎn)在子代中的等位基因頻率(allele frequency)、等位基因數(shù)(observed number of alleles,Na)、有效等位基因數(shù)(effective number of alleles,Ne)和觀測(cè)雜合度(observed heterozygosity,Ho); 根據(jù)親本的基因型推算各位點(diǎn)在子代的期望雜合度(expected heterozygosity,He); 根據(jù)Botstein等(1980)的公式計(jì)算出多態(tài)性信息含量(PIC)。

用SPSS19.0軟件中的卡方檢驗(yàn)分析各位點(diǎn)在子代中的分離比是否符合孟德?tīng)栠z傳; 用一般線性模型(general linear model, GLM)對(duì)SSR位點(diǎn)基因型與主要生長(zhǎng)性狀(殼長(zhǎng)、殼寬、殼高和體重)進(jìn)行相關(guān)性分析, 經(jīng)方差分析檢驗(yàn)呈顯著性差異的位點(diǎn), 使用Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 縊蟶的生長(zhǎng)指標(biāo)分析

隨機(jī)取縊蟶 F1家系 120個(gè)個(gè)體, 分別測(cè)量其殼長(zhǎng)、殼寬、殼高、體重的生長(zhǎng)指標(biāo), 測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表2,4個(gè)生長(zhǎng)性狀都呈現(xiàn)連續(xù)變異的特點(diǎn), 符合典型的數(shù)量性狀或多基因遺傳特點(diǎn)。通過(guò)K-S單樣本正態(tài)分布檢驗(yàn), 結(jié)果顯示其殼長(zhǎng)、殼寬、殼高與體重的P值分別為0.56、0.30、0.25和0.57, 均符合正態(tài)分布(表2),適合作為標(biāo)記與性狀相關(guān)分析的材料。

2.2 縊蟶SSR遺傳多樣性分析及其基因型分布情況

用16個(gè)SSR位點(diǎn)對(duì)縊蟶親本及其子代120個(gè)個(gè)體進(jìn)行了PCR擴(kuò)增, 其中有1個(gè)子代個(gè)體PCR產(chǎn)物電泳條帶不夠理想, 因此舍棄了該個(gè)體。遺傳參數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明(表3): 16個(gè)位點(diǎn)共檢測(cè)到39個(gè)等位基因,各位點(diǎn)的等位基因數(shù)2—4個(gè), 平均2.44, 平均有效等位基因數(shù)為2.09; 觀測(cè)雜合度在0.36—1.00之間, 平均為0.58; 期望雜合度在0.50—1.00之間, 平均為0.63;多態(tài)信息含量(PIC)在0.25—0.70之間, 平均值0.40。

根據(jù)親本和子代的基因型判讀統(tǒng)計(jì)。16個(gè)位點(diǎn)中有 4個(gè)位點(diǎn)子代具有 4種基因型, 為 1︰1︰1︰1(BC×AD/AB×BC/AC×BD)的分離類型; 10位點(diǎn)屬 1︰1分離類型, 其中4個(gè)為雄親雜合雌親純合, 6個(gè)為雌親雜合雄親純合; 2個(gè)位點(diǎn)屬1︰2︰1 (AB×AB)分離類型。根據(jù)卡方檢驗(yàn), 有 10個(gè)位點(diǎn)(62.5%)的子代基因型分布處于平衡狀態(tài)(P>0.05), 其它位點(diǎn)(37.5%)都不同程度地偏離了平衡(P<0.05或P<0.01)(表3)。

2.3 縊蟶生長(zhǎng)性狀相關(guān)SSR位點(diǎn)分析與多重比較

對(duì)每個(gè) SSR位點(diǎn)的不同基因型進(jìn)行分類, 結(jié)合

表型數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析, 結(jié)果在 16個(gè) SSR位點(diǎn)中,發(fā)現(xiàn)共有 4個(gè)位點(diǎn)與縊蟶生長(zhǎng)性狀表現(xiàn)出一定的相關(guān)性, 其中YC-1與殼寬顯著相關(guān)(P<0.05); YC-93與殼寬、殼高均極顯著相關(guān)(P<0.01); YC-96與體重顯著相關(guān)(P<0.05); YC-123位點(diǎn)與殼高、體重均顯著相關(guān)(P<0.05)。

表1 本研究選用的微衛(wèi)星位點(diǎn)、核心序列、引物序列和退火溫度Tab.1 Microsatellite loci, repeat motif sequence, prime sequence and annealing temperature used in this study

表2 殼長(zhǎng)、殼寬、殼高、體重的表型數(shù)據(jù)及正態(tài)分布檢驗(yàn)Tab.2 The phenotypic data of shell length, width, height, and weight, and normal distribution test

表3 16個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在縊蟶F1家系的統(tǒng)計(jì)信息Tab.3 Statistic information for 16 microsatellite loci in an F1 family of S. constricta

將這 4個(gè)有顯著相關(guān)的位點(diǎn)進(jìn)行不同基因型間的不同性狀的多重比較(Duncan法), 結(jié)果如下(表4):在標(biāo)記YC-1中, 基因型BB個(gè)體的殼長(zhǎng)、體重、殼寬值均高于AA和AB個(gè)體, 但僅在殼寬性狀上呈顯著差異(P<0.05), 推測(cè) BB基因型是殼寬的優(yōu)勢(shì)基因型, 等位基因A可能起負(fù)面影響。

表4 4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)不同基因型殼長(zhǎng)、寬、高與體重的多重比較Tab.4 Multiple comparisons of major growth traits with different genotypes at 4 microsatellite loci

在標(biāo)記YC-93中, 基因型BC和BB個(gè)體的殼寬值極顯著高于AB和AC個(gè)體(P<0.01), 說(shuō)明等位基因A對(duì)殼寬起負(fù)面影響; 在殼高性狀上則是基因型 AB和AC個(gè)體極顯著或顯著高于BC和BB個(gè)體(P<0.01或P<0.05), 說(shuō)明等位基因A對(duì)殼高起正面影響; 4種基因型在體重上AB型個(gè)體最大, 但與其它3種基因型個(gè)體均未達(dá)到顯著差異水平。

在標(biāo)記YC-96中, 基因型BC個(gè)體的平均殼長(zhǎng)、殼寬、殼高、體重值均高于AB個(gè)體, 在平均體重性狀上差異顯著(P<0.05), 可說(shuō)明 BC基因型是體重性狀的優(yōu)勢(shì)基因型, 而等位基因A起負(fù)面影響。

在標(biāo)記YC-123中, 基因型BB個(gè)體的平均殼高、體重值均顯著高于AB個(gè)體(P<0.05), 說(shuō)明基因型BB對(duì)殼高、體重起正面影響, 等位基因A起負(fù)面影響。

2.4 最優(yōu)基因型組合篩選

因?yàn)轶w重一般是水產(chǎn)動(dòng)物最終收獲的主要經(jīng)濟(jì)性狀, 因此, 本研究以體重為參照指標(biāo)對(duì)這4個(gè)位點(diǎn)不同基因型組合進(jìn)行比較。由于4個(gè)位點(diǎn)中某些基因型組合出現(xiàn)頻率太少, 缺少分析價(jià)值, 因此在實(shí)際統(tǒng)計(jì)分析中, 每種基因型組合至少有3次觀察值才被考慮。YC-1、YC-93、YC-96和YC-123四個(gè)位點(diǎn)的基因型分別有3、4、2和2種基因型, 可形成48種組合, 因在標(biāo)記YC-93和YC-96中分別有7個(gè)和2個(gè)個(gè)體未檢測(cè)到基因型, 因此樣本數(shù)為 110。在檢測(cè)的110個(gè)個(gè)體中實(shí)際出現(xiàn)了32種基因型組合, 16種基因型組合的個(gè)體沒(méi)出現(xiàn)。對(duì)32種不同基因型組合的體重表型值進(jìn)行比較, 獲得的最優(yōu)基因型組合為BB/BB(BC)/BC/BB, 與4個(gè)位點(diǎn)單獨(dú)分析對(duì)應(yīng)的最優(yōu)基因型基本完全一致, 符合加性作用模型(表5)。

表5 縊蟶F1家系的不同基因型組合對(duì)應(yīng)體重排序統(tǒng)計(jì)表Tab.5 The statistics to body weight value with different genotype combinations in an F1 family of S. constricta

3 討論

3.1 縊蟶家系遺傳結(jié)構(gòu)分析

Ne、Ho、He和 PIC是反映群體遺傳多樣性的重要參數(shù), 數(shù)值越大, 表明群體遺傳結(jié)構(gòu)越復(fù)雜, 進(jìn)而說(shuō)明基因豐富度越高(李春艷, 2009)。本文中, 縊蟶家系群體的Ne=2.09,Ho=0.58,He=0.63和PIC=0.40, 可以看出該縊蟶家系的遺傳多樣性水平處于中等水平,普遍低于已報(bào)道的縊蟶不同地理養(yǎng)殖群體和野生群體的遺傳多樣性水平(牛東紅等, 2011; 劉達(dá)博等,2011; 劉博等, 2013), 出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能與本文研究的對(duì)象是全同胞家系群體有關(guān)。

另外, 本研究的 16個(gè)位點(diǎn)的期望雜合度多數(shù)與觀測(cè)雜合度基本一致, 說(shuō)明實(shí)驗(yàn)中測(cè)量縊蟶家系群體的這些位點(diǎn)的基因頻率和基因型頻率穩(wěn)定性較好,除了位點(diǎn)YC-8的期望雜合度(He=0.50)明顯大于觀測(cè)雜合度(Ho=0.27), 表現(xiàn)出 F1代個(gè)體的分離方式嚴(yán)重偏離孟德?tīng)柗蛛x規(guī)律(P<0.01)。分析該位點(diǎn)在F1群體中的基因型分布, 發(fā)現(xiàn)雜合子 AB個(gè)體很少, 僅占全部觀測(cè)個(gè)體的 26.9%(理論上應(yīng) 50%); 而純合子 AA個(gè)體很多, 占全部觀測(cè)個(gè)體的 47.1%(理論上只占25%)。這提示該位點(diǎn)附近可能存在著不利于雜合子AB個(gè)體而利于純合子 AA個(gè)體存活的基因。位點(diǎn)YC-35嚴(yán)重偏離孟德?tīng)柗蛛x定律(P=0.000), 其原因是由于基因型AB和BD個(gè)體(AB︰AC︰BD︰DC=19︰31︰17︰48, 理論上應(yīng) 1︰1︰1︰1)出現(xiàn)頻率顯著偏低, 暗示該位點(diǎn)可能存在與B連鎖的基因不利于縊蟶存活, 有待于進(jìn)一步深入研究。

多態(tài)信息含量(PIC)是衡量基因變異程度高低的重要指標(biāo), 可以反應(yīng)出基因座位在群體中的多態(tài)性高低。研究利用的16個(gè)SSR位點(diǎn), 據(jù)Botstein等(1980)的界定標(biāo)準(zhǔn), 有 5個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)為高度多態(tài)位點(diǎn)(PIC>0.50), 11個(gè)表現(xiàn)為中度多態(tài)位點(diǎn)(0.25

3.2 縊蟶生長(zhǎng)性狀相關(guān)分子標(biāo)記的篩選

微衛(wèi)星標(biāo)記具有保守性好、呈共顯性遺傳的特點(diǎn),是近年來(lái)發(fā)展迅速、應(yīng)用廣泛的分子標(biāo)記, 也是分析與重要經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳連鎖關(guān)系最理想的標(biāo)記之一,目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)、抗病、性別等性狀相關(guān)分子標(biāo)記篩選。例如 Lu等(2013)利用雙向選擇性分型篩選出3個(gè)與文蛤(Meretrix meretrix)生長(zhǎng)QTL緊密連鎖的 EST-SSR標(biāo)記, 并用單向選擇性分型對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證; Song等(2012)利用半滑舌鰨(Cynoglossus semiliaevis)F1家系構(gòu)建高密度遺傳連鎖圖譜, 并進(jìn)行性狀-標(biāo)記之間的回歸分析, 得到2個(gè)與生長(zhǎng)性狀相關(guān)(P<0.01)的SSR標(biāo)記; Guo等(2012)基于全同胞家系構(gòu)建長(zhǎng)牡蠣(Crassostrea gigas)的性別平均連鎖圖, 檢測(cè)到3個(gè)生長(zhǎng)相關(guān)的QTLs和一個(gè)性別相關(guān)的QTL; Rodriguez等(2004)利用雄性硬頭鱒和雌性虹鱒(Oncorhynchus mykiss)雜交產(chǎn)生的雄性F1回交雌性虹鱒產(chǎn)生70個(gè)家系(BC1), 從每個(gè)F1和BC1家系中取近100個(gè)體進(jìn)行IHN病毒感染, 表型性狀采用1(感染后死亡)和0(感染后存活), 篩選到6 個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記和IHNV抗性有關(guān), 為進(jìn)一步將與抗性有關(guān)的基因進(jìn)行定位、克隆奠定基礎(chǔ)。在本實(shí)驗(yàn)中, 共找到了4個(gè)與生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)的 EST-SSR標(biāo)記, 其中YC-93與縊蟶的殼寬、殼高性狀極顯著相關(guān), YC-123與殼高、體重性狀顯著相關(guān), 而位點(diǎn)YC-1和YC-96僅與殼寬或體重一個(gè)性狀顯著相關(guān), 可初步確定這些位點(diǎn)為與生長(zhǎng)相關(guān)的候選標(biāo)記; 尤其是位點(diǎn)YC-96的BC基因型和YC-123的BB基因型的個(gè)體體重性狀均顯著高于同一標(biāo)記的其它基因型的個(gè)體, 推測(cè)這兩個(gè)基因型為體重優(yōu)勢(shì)基因型, 可用于對(duì)縊蟶體重性狀進(jìn)行輔助選育。

后續(xù)的研究工作中, 將對(duì)篩選到的這些候選標(biāo)記進(jìn)行進(jìn)一步的分析與驗(yàn)證, 探討其能否作為縊蟶標(biāo)記輔助育種的有效分子標(biāo)記。

王興強(qiáng), 曹 梅, 閻斌倫, 2006. 縊蟶Sinonovacula constricta(Lamarck)養(yǎng)殖期間發(fā)病原因及防治對(duì)策. 現(xiàn)代漁業(yè)信息,21(5): 13—16

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