方衛(wèi)東 唐 旭 劉源森 林 凌 黃仕新 高培麗 徐長安①

(1. 集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 廈門 361021; 2. 福建省海新集團(tuán)有限公司 漳州 363102; 3. 國家海洋局第三海洋研究所 廈門 361005)

隨著健康養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展, 有益微生物的應(yīng)用越來越廣泛, 如在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中, 使用光合細(xì)菌、枯草芽孢桿菌等微生物制劑改善養(yǎng)殖環(huán)境, 降低疾病的發(fā)生, 取得了較好的效果(Vanittanakomet al, 1986;Burgesset al, 1993; Barsbyet al, 2001; Vaseeharanet al, 2003; 顧繼銳等, 2011; 張慶華等, 2011; 高存川等,2012; 潘娟等, 2012; 張峰峰等, 2012); 通過篩選生防細(xì)菌, 利用生防細(xì)菌對水產(chǎn)病原菌的抑制作用, 尋找替代抗生素的新途徑, 如從高度污染的海灘污泥中, 分離得到一株枯草芽孢桿菌 LHB02對三種弧菌包括哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和鰻弧菌(Vibrio anguillarum)都有很強(qiáng)的抑制作用(徐長安等, 2011); 從不同生長階段的對蝦腸道中分離對病原菌(鰻弧菌、副溶血弧菌、哈維氏弧菌)有拮抗作用的細(xì)菌(李海兵等, 2008)。另外專家學(xué)者也開展了利用益生菌、酶制劑促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的健康和提高飼料利用率方面的研究(Tamehiroet al, 2002; Liuet al, 2010), 并取得了很好的試驗效果,如芽孢桿菌、低聚木糖、復(fù)合酶制劑及它們的配伍物可以促進(jìn)異育銀鯽的生長, 提高飼料利用率, 促進(jìn)腸道有益微生物的生長和抑制有害微生物, 并且能提高肝胰臟蛋白酶mRNA表達(dá)量和腸道酶活性(劉文斌等, 2007); 在飼料中添加糞腸球菌能夠促進(jìn)羅非魚生長, 提高飼料利用率, 降低血清膽固醇和甘油三酯含量以及谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性, 同時增加腸道乳酸菌數(shù)量,改善腸道微環(huán)境(周曉波等, 2014); 纖維素酶可降低動物胃腸內(nèi)容物的粘稠度, 促進(jìn)內(nèi)源酶的擴(kuò)散, 提高養(yǎng)分的消化吸收(胡喜峰等, 2004); 飼料中添加纖維素酶, 草魚增重率提高, 餌料系數(shù)降低, 干物質(zhì)、粗蛋白、粗脂肪和粗纖維消化率都提高, 體成分沒有顯著變化(高春生等, 2006)。

目前, 同時具有產(chǎn)酶和抗菌性能的功能菌株篩選報道較少, 本實驗室在前期的功能菌篩選中, 篩選到一株既產(chǎn)纖維素酶又具有拮抗水產(chǎn)病原菌的芽孢桿菌, 本研究報道了該功能菌的篩選、鑒定, 及對功能菌產(chǎn)生的纖維素酶進(jìn)行耐溫、耐酸堿和對紫外線的穩(wěn)定性進(jìn)行考察, 并開展功能菌對水產(chǎn)常見病原菌的拮抗效果分析, 初步評估該功能菌株的價值, 為以后開發(fā)該菌株提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

用于篩菌的樣品采自福建省寧德市養(yǎng)殖池底泥。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基: 蛋白胨10g, 酵母提取物5g, 氯化鈉10g, 水 1000 mL, pH 7.2—7.4。

SLB培養(yǎng)基: 蛋白胨10g, 酵母提取物 5g, 氯化鈉 10g, 瓊脂20g, 水1000 mL, pH 7.2—7.4。

產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基: 蛋白胨 9.0 g、酵母膏 10.0 g,羧甲基纖維素鈉 5.0 g, 水1000 mL。

CMC-Na平板: 羧甲基纖維素鈉15.0 g、硫酸銨1.0 g、酵母膏1.0 g、硫酸鎂1.0 g、磷酸二氫鉀1.0 g、瓊脂20.0 g、水1000 mL, pH為自然值。

1.3 測試菌

嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila), 愛德華氏菌(Edwardsiella), 哈維氏弧菌(Vibrio harveyi), 溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus), 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus), 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。

1.4 儀器設(shè)備

常規(guī)玻璃器皿、電子天平、超凈工作臺、打孔器、移液槍、臺式搖床、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱,PCR儀, 核酸電泳儀, 凝膠成像儀, 多功能酶標(biāo)儀和手提式紫外反射儀等。

1.5 功能菌的篩選

1.5.1 目標(biāo)菌的分離 取 10g污泥樣品, 加入100mL 0.85% NaCl中, 攪拌后取上層濁液置于LB培養(yǎng)基, 37°C, 180 r/min, 富集培養(yǎng) 30h后, 菌液置于75°C水浴20min。水浴后的菌液進(jìn)行梯度稀釋及平板涂布法進(jìn)行分離。

1.5.2 功能菌產(chǎn)纖維素酶檢測 分別挑取初篩得到的目標(biāo)菌, 標(biāo)示為: FA01、FA02、FA03、FA04、FA05、FA06、FA07、FA08、FA09、FA10 等以此類推, 將這些目標(biāo)菌置于LB培養(yǎng)基中, 37°C, 180 r/min,活化6 h, 活化好的菌液按10%接種至產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基, 37°C, 180 r/min, 發(fā)酵 48h 后, 10000 r/min, 離心 6min, 棄去沉淀, 得上清液, 為粗酶液; 采用CMC-Na平板, 打孔后, 孔內(nèi)添加 50μL所得的上清液, 之后置于 37°C過夜; 反應(yīng)后的平板用剛果紅染色1h, 接著用0.85% NaCl脫色, 觀察是否出現(xiàn)水解圈,出現(xiàn)水解圈的即定為功能菌。每株菌做三個重復(fù)。

1.6 功能菌的鑒定

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》(東秀珠等, 2001)進(jìn)行功能菌生物學(xué)特征觀察和生理生化試驗, 并結(jié)合16S rDNA序列分析方法進(jìn)行鑒定。

1.6.1 生物學(xué)特征觀察 將功能菌接種至 SLB培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿平板, 放入溫度設(shè)置為 37°C的恒溫箱中, 培養(yǎng)24 h, 觀察菌落形態(tài)特征。

1.6.2 生理生化試驗 進(jìn)行功能菌部分生理生化試驗, 包括D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露醇的產(chǎn)酸試驗; 接觸酶、苯丙氨酸脫氨酶試驗、明膠、淀粉、酪氨酸水解試驗; V-P測定、吲哚產(chǎn)生試驗、利用檸檬酸鹽試驗。

1.6.3 16S rDNA序列分析 參照文獻(xiàn)(徐長安等,2011), 采用磁珠法基因組DNA抽提試劑盒提取功能菌全基因組。以全DNA為模板, 使用細(xì)菌16S rDNA通用引物, 27F: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和 1492R: 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。用 Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增, PCR程序為: 94°C預(yù)變性 4min; 94°C 45s, 55°C 45s, 72°C 1 min, 30 個循環(huán);72°C 10 min 修復(fù)延伸; 4°C ∞終止反應(yīng)。使用 SanPreP柱式 DNA膠回收試劑盒純化 PCR產(chǎn)物。純化后的PCR產(chǎn)物送至上海生工測序。將測得的16S rDNA序列輸入www.ncbi.nlm.nih.gov Blast進(jìn)行同源性搜索,選取其中與之同源性較高的菌株, 用 MEGA軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析, 構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.7 酶活特性分析

接種功能菌株至LB培養(yǎng)基中, 37°C, 180 r/min,活化6h, 活化好的菌液按10% 接種至產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基, 37°C, 180 r/min, 發(fā)酵 24h 后, 10000 r/min, 離心6min, 棄去沉淀, 得上清液, 為粗酶液。參照文獻(xiàn)(韓銘等, 2012; 于嵐等, 2013), 采用3, 5-二硝基水楊酸比色定糖法(DNS)進(jìn)行酶活測定, 分別考察功能菌株所產(chǎn)的纖維素酶對溫度、pH值和紫外線的耐受能力。

1.7.1 酶對pH值的耐受能力檢測 粗酶液在不同pH緩沖液(3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0)混合均勻, 置于37°C, 處理1h, 測定殘存酶活, 以最高酶活為100%。

1.7.2 酶對溫度的耐受能力檢測 粗酶液分別在溫度為 30、40、50、60、70、80°C的水浴鍋中處理1h后, 測定殘存酶活, 以最高酶活為100%。1.7.3 紫外線對酶活性的影響 粗酶液分別在紫外線波長365nm, 距離10cm下照射10、20、30、40、50、60 min后, 測定殘存酶活, 以最高酶活為100%。

1.8 拮抗性能檢測

1.8.1 抑菌板的制作 選擇嗜水氣單胞菌、愛德華氏菌、哈維氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌, 用接種環(huán)刮下菌體接種至裝有5mL LB培養(yǎng)基的試管中, 放入溫度設(shè)置為37°C, 轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖床中培養(yǎng)16h后, 取1 mL的培養(yǎng)液至100 mL的45—50°C的 SLB培養(yǎng)基中, 迅速搖勻倒板, 待凝固后用打孔器打孔。

1.8.2 發(fā)酵上清的制備 功能菌FA08斜面接種至裝有5mL LB培養(yǎng)基的試管中, 放入溫度設(shè)置為37°C,轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖床中活化6 h后, 按10%的接種量至裝有50 mL LB培養(yǎng)基的三角瓶中, 放入溫度設(shè)置為 37°C, 轉(zhuǎn)速為 180 r/min的搖床中發(fā)酵 17 h,10000 r/min 離心6 min, 得發(fā)酵上清。

1.8.3 采用瓊脂擴(kuò)散法(agar diffusion method)進(jìn)行測定(Tagget al, 1971)。通過測量圓形的透明帶(抑菌圈)直徑的大小來表示發(fā)酵上清液抑菌活性的強(qiáng)弱。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標(biāo)菌篩選結(jié)果

經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn), 標(biāo)識為 FA08的菌株, 三個重復(fù)均出現(xiàn)水解圈, 如圖1所示, 而其它菌株未出現(xiàn)水解圈,因此 FA08為目標(biāo)功能菌。

圖1 功能菌FA08水解圈Fig.1 The hydrolysis circle of strain FA08

2.2 功能菌FA08生物學(xué)特征觀察

將功能菌FA08接種至SLB培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿平板,37°C培養(yǎng) 24h, 發(fā)現(xiàn)菌落白色微黃, 中間凸起, 表面光滑, 邊緣不規(guī)則, 革蘭氏染色為陽性, 產(chǎn)芽孢。

2.3 生理生化試驗

功能菌FA08的部分生理生化實驗結(jié)果如表1所示。

表1 功能菌FA08的生理生化檢測結(jié)果Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of strain FA08

2.4 16S rDNA鑒定結(jié)果

16S rDNA測序結(jié)果顯示, 菌株 FA08的 16S rDNA序列全長為1407bp。全序列見圖2。將測得的序列輸入國際核酸數(shù)據(jù)庫(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov), 用Blast進(jìn)行同源序列搜索, 在搜索結(jié)果中, 選出同源性較高的菌株系列(表2), 用MEGA 軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析, 并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹, 結(jié)果如圖3所示,通過比較可以明顯看出, FA08在遺傳位置上與Bacillus licheniformis(X68416)和Bacillus licheniformis(NR118959)兩株地衣芽孢桿菌最近, 且與Bacillus licheniformis(X68416)同源性最高達(dá)99%。結(jié)合其形態(tài)學(xué)及生理、生化特征, 鑒定功能菌 FA08為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis), 登錄號為KM892857。

2.5 酶學(xué)特性分析結(jié)果

2.5.1 pH值對 FA08所產(chǎn)生的纖維素酶穩(wěn)定性的影響 如圖4所示, FA08所產(chǎn)纖維素酶在pH 4下穩(wěn)定性最好, 且pH 3和pH 5—10下保持較好的穩(wěn)定性,相對酶活保持在 85%以上, 因此該酶對酸堿的耐受能力較強(qiáng)。

2.5.2 溫度對FA08所產(chǎn)生的纖維素酶穩(wěn)定性的影響如圖5所示, FA08所產(chǎn)纖維素酶在30—40°C保持較好的穩(wěn)定性, 50—70°C相對酶活保持在 75%以上,80°C下相對酶活仍能保持在 70%以上, 因此該酶對溫度具有較好的耐受能力。

2.5.3 紫外線對FA08所產(chǎn)生的纖維素酶穩(wěn)定性的影響 從圖6可以看出在紫外線照射的條件下FA08所產(chǎn)生的纖維素酶保持穩(wěn)定性, 酶活均接近 100%,因此該纖維素酶對紫外線具有很強(qiáng)的耐受性。

圖2 功能菌FA08 16S rDNA 測序結(jié)果Fig.2 The 16S rDNA sequence of strain FA08

圖3 基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic dendrogram based on 16S rDNA sequence

表2 選自基因庫中用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的菌株及其錄入號Tab.2 The strains and the accession numbers in GenBank for phylogenetic dendrogram construction

圖4 pH值對FA08所產(chǎn)生的纖維素酶穩(wěn)定性的影響Fig.4 The effect of pH on the stability of cellulase produced by strain FA08

圖5 溫度對FA08所產(chǎn)生的纖維素酶穩(wěn)定性的影響Fig.5 The effect of temperature on the stability of cellulase produced by strain FA08

圖6 紫外線對FA08所產(chǎn)生的纖維素酶穩(wěn)定性的影響Fig.6 The effect of UV on the stability of cellulase produced by strain FA08

2.6 功能菌FA08發(fā)酵上清對水產(chǎn)病原菌的拮抗性能

拮抗試驗結(jié)果表明: 如表 3所示, 功能菌 FA08對水產(chǎn)養(yǎng)殖常見致病菌: 嗜水氣單胞菌、哈維氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和金黃色葡萄球菌均有較強(qiáng)的抑制作用, 其中對嗜水氣單胞菌抑制作用最強(qiáng)。

表3 功能菌FA08發(fā)酵上清對病原菌的拮抗性能Tab.3 Antimicrobial activity of FA08’s supernatant on selected pathogens

3 討論

地衣芽孢桿菌作為生防細(xì)菌廣泛應(yīng)用于植物病害防治、飼料加工、醫(yī)藥開發(fā)、環(huán)境污染治理等方面(唐娟等, 2008)。1989年, 美國FDA和美國飼料控制官員協(xié)會公布了地衣芽孢桿菌是安全的微生物物種,可以直接飼用; 我國農(nóng)業(yè)部也把地衣芽孢桿菌列入飼料添加劑目錄(馬鑫等, 2011), 允許在飼料中直接添加。另外, 地衣芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面也有很好的應(yīng)用價值, 如地衣芽孢桿菌作為魚飼料添加劑, 不僅可以促進(jìn)魚體生長, 而且益于養(yǎng)殖水體的保護(hù)(葛文霞等, 2014); 地衣芽孢桿菌和低聚木糖, 可提高魚體中消化酶的活性, 有助于維持腸道內(nèi)的微生態(tài)平衡, 促進(jìn)動物生長(劉波等, 2006); 地衣芽孢桿菌增加了腸道消化酶活性, 促進(jìn)了魚體生長(劉波等,2005)。另有研究表明, 地衣芽孢桿菌具有耐高溫、耐酸堿的特性, 并能產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纖維素酶等, 有助于降解植物性飼料中某些復(fù)雜的碳水化合物, 消除抗?fàn)I養(yǎng)因子(董尚智等, 2009)。本實驗所篩選的功能菌 FA08鑒定為地衣芽孢桿菌, 且可產(chǎn)生纖維素酶, 預(yù)示著該菌具有較好的開發(fā)與應(yīng)用前景。

通過考察地衣芽孢桿菌FA08產(chǎn)生的纖維素酶對酸堿穩(wěn)定性的影響, 發(fā)現(xiàn) FA08產(chǎn)生的纖維素酶對酸堿均能保持較好的穩(wěn)定性, pH3和pH 5—10下相對酶活保持在 85%以上, 與楊麗娜等(2012)篩選到的芽孢桿菌屬(Bacillus)微生物所產(chǎn)的纖維素酶相比, 在酸性條件下的耐受能力強(qiáng), 具有相似性, 而在中性、堿性條件下地衣芽孢桿菌FA08產(chǎn)生的纖維素酶更具耐受能力。水產(chǎn)動物大多數(shù)無胃, 消化道呈中性(鯉科魚類)或偏堿性(王仁華等, 2011), 因此地衣芽孢桿菌FA08產(chǎn)生的纖維素酶不僅適合于有胃的動物, 而且也適合應(yīng)用于水產(chǎn)動物。另外, 地衣芽孢桿菌生長條件要求低, 繁殖快, 能迅速定植在腸黏膜上, 在短時間內(nèi)成為腸道的優(yōu)勢菌群(張菊等, 2012), 并在腸道中發(fā)揮作用, 有利于開發(fā)成為內(nèi)服的微生物制劑。

實驗發(fā)現(xiàn), 地衣芽孢桿菌FA08產(chǎn)生的纖維素酶對溫度有較好的耐受能力, 耐受 80°C下相對酶活仍能保持在 70%以上, 與葛春輝(2009)篩選到的蠟質(zhì)芽孢桿菌所產(chǎn)的纖維素酶相比, 更具有耐溫特性。在飼料原料中, 雜粕類的原料粗纖維含量高, 存在抗?fàn)I養(yǎng)因子, 大大限制了其在飼料中的使用量, 目前發(fā)酵技術(shù)的應(yīng)用, 可提高雜粕類原料的使用價值, 降解雜粕原料中水產(chǎn)動物難以消化的纖維素, 消除抗?fàn)I養(yǎng)因子, 提高雜粕原料的利用率。一般飼料原料的發(fā)酵溫度可達(dá)60—80°C, 而地衣芽孢桿菌FA08產(chǎn)生的纖維素酶可較好耐受發(fā)酵溫度, 可應(yīng)用于雜粕的發(fā)酵, 提高雜粕的營養(yǎng)價值。

地衣芽孢桿菌對有害微生物具有拮抗作用: 如地衣芽孢桿菌 Wl0能產(chǎn)生抗菌蛋白, 對多種植物病原菌有較好的抑制效果(紀(jì)兆林等, 2013); 又如地衣芽孢桿菌 c-4具有較廣的抑菌范圍, 對番茄枯萎病菌、玉米彎孢葉斑病菌、膠孢炭疽病菌、棉花枯萎病菌、棉花黃萎病菌、小麥赤霉病菌和西瓜枯萎病菌等均有抑制作用(孫正祥等, 2009)。然而地衣芽孢桿菌對水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌的拮抗特性報道較少。本實驗也探討了地衣芽孢桿菌FA08發(fā)酵上清對水產(chǎn)常見病原菌的拮抗效果, 發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌FA08對水產(chǎn)病原菌:嗜水氣單胞菌、愛德華氏菌、哈維氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和金黃色葡萄球菌均有較強(qiáng)的拮抗作用。由于地衣芽孢桿菌具有在水產(chǎn)動物腸道定植的特性,這意味著地衣芽孢桿菌 FA08進(jìn)入水產(chǎn)動物腸道后,在腸道內(nèi)可產(chǎn)生拮抗物質(zhì), 對病原菌進(jìn)行抑制或殺滅作用, 促進(jìn)水產(chǎn)動物腸道健康, 有著重要的意義,另外, 也可利用 FA08的拮抗性能, 制備微生物殺菌劑。

本研究開展了地衣芽孢桿菌FA08的篩選與鑒定,考察了該菌的酶學(xué)性質(zhì)和抗菌特性, 初步評估該菌的開發(fā)與應(yīng)用價值, 下一步將進(jìn)行其作為養(yǎng)殖動物腸道定植菌、雜粕飼料發(fā)酵菌及制備微生物殺菌劑的研究與開發(fā), 實現(xiàn)FA08在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用價值。

于 嵐, 程 芳, 邵文琦等, 2013. 一株嗜熱纖維素酶生產(chǎn)菌的分離、鑒定及酶學(xué)研究. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 41(17):7413—7417

馬 鑫, 郭 宏, 張寶國等, 2011. 地衣芽孢桿菌作為飼料添加劑的研究進(jìn)展. 中國飼料添加劑, (2): 10—13

王仁華, 劉曉蘭, 王琤琤, 2011. 水產(chǎn)動物纖維素酶的應(yīng)用研究. 飼料研究, (12): 62—64

東秀珠, 蔡妙英, 2001. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊. 北京: 科學(xué)出版社, 43—65

劉 波, 劉文斌, 王 恬, 2005. 地衣芽孢桿菌對異育銀鯽消化機(jī)能和生長的影響. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 28(4): 80—84

劉 波, 謝 駿, 劉文斌等, 2006. 地衣芽孢桿菌與低聚木糖對異育銀鯽消化酶活性、腸道菌群及生長的影響. 大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報, 21(4): 336—340

劉文斌, 尹 君, 方星星等, 2007. 3種益生素配伍對異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)生長、消化及腸道菌群組成的影響. 海洋與湖沼, 38(1): 29—35

孫正祥, 王振中, 2009. 生防細(xì)菌 C-4的特性鑒定及其對香蕉枯萎病的防治效果. 植物保護(hù)學(xué)報, 36(5): 392—396

紀(jì)兆林, 宋 浩, 徐敬友等, 2013. 地衣芽孢桿菌Wl0發(fā)酵產(chǎn)生抗茵蛋白的研究. 中國生物防治學(xué)報, 29(4): 579—585

李海兵, 宋曉玲, 韋 嵩等, 2008. 4株對蝦腸道益生菌的篩選及鑒定. 海洋與湖沼, 39(4): 374—380

楊麗娜, 楊明明, 龔月生, 2012. 產(chǎn)耐熱性纖維素酶菌株的分離·鑒定及其酶學(xué)性質(zhì)研究. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 40(14):8103—8105

張 菊, 李金敏, 張志焱等, 2012. 地衣芽孢桿菌的研究進(jìn)展.中國飼料, (17): 9—11

張慶華, 封永輝, 王 娟等, 2011. 地衣芽孢桿菌對養(yǎng)殖水體氨氮、殘餌降解特性研究. 水生生物學(xué)報, 35(3): 498—503

張峰峰, 謝鳳行, 周 可等, 2012. 利用復(fù)合微生物降解養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽的初步研究. 水產(chǎn)科學(xué), 31(10): 593—596

周曉波, 黃燕華, 曹俊明等, 2014. 5種乳酸菌對羅非魚生長性能、體成分、血清生化指標(biāo)及腸道茵群的影響. 動物營養(yǎng)學(xué)報, 26(7): 2009—2017

胡喜峰, 王成章, 張春梅等, 2004. 纖維素酶在水產(chǎn)中的應(yīng)用及展望. 中國水產(chǎn), (4): 73—74

顧繼銳, 蘇艷秋, 伍翠芳等, 2011. 一株嗜鹽光合菌的分離及對養(yǎng)殖污水的處理效果. 淡水漁業(yè), 41(5): 45—51

徐長安, 羅秀針, 俞超超, 2011. 海洋源生防細(xì)菌LHB02的篩選、鑒定及其抑菌譜檢測. 海洋與湖沼, 42(2): 284—288

高存川, 徐春厚, 2012. 微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖水質(zhì)改良中的應(yīng)用. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 51(7): 1419—1422

高春生, 范光麗, 李建華等, 2006. 纖維素酶對草魚生長性能和飼料消化率及體成分的影響. 中國農(nóng)學(xué)通報, 22(10):473—475

唐 娟, 張 毅, 李雷雷等, 2008. 地衣芽孢桿菌應(yīng)用研究進(jìn)展. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 47(3): 351—354

葛文霞, 柳旭偉, 2014. 地衣芽孢桿菌在養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展. 上海畜牧獸醫(yī)通訊, (1): 17—19

葛春輝, 徐萬里, 邵華偉等, 2009. 一株產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的篩選、鑒定及其纖維素酶的部分特性. 生物技術(shù), 19(1): 36—40

董尚智, 王國霞, 陳遠(yuǎn)鳳等, 2009. 飼用地衣芽孢桿菌的生物學(xué)特性研究. 飼料研究, (7) 14—18

韓 銘, 袁月祥, 閆志英等, 2012. 一株產(chǎn)耐熱纖維素酶菌株的篩選及酶學(xué)性質(zhì). 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報, 18(1): 75—79

潘 娟, 李 利, 劉麗媛, 2012. 益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中的應(yīng)用. 畜牧與飼料科學(xué), 33(4): 90—92

Barsby T, Kelly M T, Gagne S Met al, 2001. Bogorol a produced in culture by a marineBacillussp. reveals a novel template for cationic peptide antibiotics. Org Lett, 3(3): 437—440

Burgess J G, Miyashita H, Sudo Het al, 1993. Gene transfer inChromatium purpuratum, a marine photosynthetic bacterium producing antibiotics. J Mar Biotechnol, 1(2): 101

Liu K-F, Chiu C-H, Shiu Y-Let al, 2010. Effects of the probiotic,Bacillus subtilisE20, on the survival, development, stress tolerance, and immune status of white shrimp,Litopenaeus vannameilarvae. Fish Shellfish Immunol, 28(5—6):837—844

Tagg J R, McGiven A R, 1971. Assay system for bacteriocins.Appl Microbiol, 21(5): 943

Tamehiro N, Okamoto-Hosoya Y, Okamoto Set al, 2002.Bacilysocin, a novel phospholipid antibiotic produced byBacillus subtilis168. Antimicrob Agents Chemother, 46(2):315—320

Vanittanakom N, Loeffler W, Koch Uet al, 1986. Fengycin-A novel antifungal lipopeptide antibiotic produced byBacillus subtilisF-29-3. J Antibiotics, 39(7): 888— 901

Vaseeharan B, Ramasamy P, 2003. Control of pathogenicVibriospp. by Bacillus subtilis BT23, a possible probiotic treatment for black tiger shrimpPenaeus monodon. Lett App Microbiol, 36(2): 83—87