劉皓，羅杰，劉楚吾

（廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院 南海水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物增養(yǎng)殖廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524025）

研究動(dòng)物胚胎發(fā)生可以認(rèn)識(shí)和掌握發(fā)生的規(guī)律、熟悉發(fā)生的現(xiàn)象，為生產(chǎn)實(shí)踐服務(wù)。在水產(chǎn)業(yè)中，提高魚、蝦、貝等的受精率及幼苗的成活率，進(jìn)行種質(zhì)保存和良種培育等方面都離不開對(duì)胚胎發(fā)育的研究。

紅鰭笛鯛（Lutjanus erythopterus），隸屬硬骨魚綱、輻鰭亞綱、鱸形目、笛鯛科、笛鯛屬（成慶泰 等，1987），俗稱紅魚、紅槽魚、紅雞、紅笛鯛。為暖水性近底層魚類，我國(guó)主要產(chǎn)于南海和東海南部，為南海重要經(jīng)濟(jì)魚類之一。紅鰭笛鯛個(gè)體較大，肉質(zhì)豐厚堅(jiān)實(shí)，生長(zhǎng)速度快，產(chǎn)量高，經(jīng)濟(jì)效益顯著。近年來，對(duì)紅鰭笛鯛的研究有不少報(bào)道，但主要集中在生化研究、遺傳學(xué)、繁殖技術(shù)及養(yǎng)殖技術(shù)等方面的研究（楊春玲 等，2010；鄭樂云 等，2004；陳武各，2002；彭銀輝 等，2008），其胚胎發(fā)育的研究只見個(gè)別文獻(xiàn)中有零散的報(bào)道（佘忠明 等，2005）。本文擬對(duì)紅鰭笛鯛早期胚胎發(fā)生的形態(tài)學(xué)進(jìn)行研究，了解早期胚胎發(fā)育的形態(tài)發(fā)生過程和特點(diǎn)以及在正常自然溫度下各發(fā)育階段所經(jīng)歷的時(shí)間，旨在為其人工繁殖和育苗起到一定的指導(dǎo)作用，以期進(jìn)一步利用和保護(hù)好這一優(yōu)良種質(zhì)資源。

1 材料和方法

1.1 材料

供胚胎發(fā)育觀察的紅鰭笛鯛魚受精卵于2011年6月和2012年8月分別由海南省三亞市紅沙龍勝魚苗場(chǎng)和海南省三亞市蜈支洲島后海村海水養(yǎng)殖基地提供。

1.2 方法

紅鰭笛鯛親魚產(chǎn)卵后，用手抄網(wǎng)采集紅鰭笛鯛的受精卵置于25 L 塑料桶中，在水溫28 ℃、鹽度32.2 的干凈海水中充氣孵化，并定期換水。每次取10 個(gè)左右胚胎，連續(xù)采樣，在Olympus SZ 雙筒體視顯微鏡下采用載玻片（凹玻片） 直接觀察法連續(xù)觀察活體胚胎的發(fā)育過程，并參考其他魚（王彥懷等，2007） 胚胎發(fā)育的分期方法記錄各期發(fā)育的時(shí)間和主要形態(tài)學(xué)特征，拍照。同時(shí)取樣固定胚胎發(fā)育各時(shí)期的部分材料于70%酒精中保存?zhèn)溆谩?/p>

胚胎發(fā)育時(shí)期經(jīng)歷時(shí)間為視野中有50%的胚胎從前一期胚胎到下一期所經(jīng)歷的時(shí)間。

2 結(jié)果

紅鰭笛鯛早期胚胎的形態(tài)發(fā)生過程可分為受精卵、卵裂、囊胚、原腸胚、神經(jīng)胚、器官形成等6個(gè)階段，24 個(gè)時(shí)期。從受精到孵化出膜經(jīng)歷了約20 h 后，然后進(jìn)入胚后發(fā)育階段。

2.1 紅鰭笛鯛早期正常胚胎發(fā)育各階段的形態(tài)特征

受精卵期：紅鰭笛鯛受精卵為圓球形，平均直徑為500 μm 左右，浮性端黃卵，透明，內(nèi)有一大油球。

胚盤形成期：受精后15 min 原生質(zhì)聚集于動(dòng)物極，隆起形成胚盤（圖版1 ∶1）。

2 細(xì)胞期：受精后30 min 進(jìn)行第1 次卵裂，為盤狀卵裂，經(jīng)裂，將胚盤均分為兩個(gè)細(xì)胞（圖版1 ∶2）。

4 細(xì)胞期：受精后42 min 進(jìn)行第2 次卵裂，盤狀卵裂，經(jīng)裂，分裂面與第一次卵裂面垂直，胚盤由2 個(gè)細(xì)胞分裂為4 個(gè)細(xì)胞（圖版1 ∶3）。

8 細(xì)胞期：受精后57 min 進(jìn)行第3 次卵裂，盤狀卵裂，經(jīng)裂，具兩條分裂溝（2 個(gè)分裂面），分別在第1 次卵裂溝的兩側(cè)、與第1 次卵裂面平行而與第2 次卵裂面垂直，胚盤由4 個(gè)細(xì)胞分裂為8 細(xì)胞，規(guī)則地排列成2 行（圖版1 ∶4）。

16 細(xì)胞期：受精后1 h 13 min 進(jìn)行第4 次卵裂，盤狀卵裂，經(jīng)裂，具兩條分裂溝（兩個(gè)分裂面），分別在第2 次卵裂溝的兩側(cè)、與第2 次卵裂面平行而與第1、3 次卵裂面垂直，胚盤由8 個(gè)細(xì)胞分裂為16 個(gè)細(xì)胞，規(guī)則地排列成4 行，每行4個(gè)細(xì)胞（圖版1 ∶5）。

32 細(xì)胞期：受精后1 h 36 min 進(jìn)行第5 次卵裂，盤狀卵裂，經(jīng)裂，具4 條分裂溝（4 個(gè)分裂面），分別在第1、3 次卵裂面平行而與第2、4 次卵裂面垂直，胚盤由16 個(gè)細(xì)胞分裂為32 個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞排列已不那么規(guī)則。

64 細(xì)胞期：受精后2 h 進(jìn)行第6 次卵裂，盤狀卵裂，胚盤由32 個(gè)細(xì)胞分裂為64 個(gè)細(xì)胞，排列不規(guī)則，大小不均等，胚盤細(xì)胞層數(shù)增加，顯微鏡下側(cè)面觀，可見到細(xì)胞明顯重疊現(xiàn)象，顯然已經(jīng)出現(xiàn)緯裂。

由于是盤狀卵裂，分裂只在胚盤的區(qū)域進(jìn)行縱向分裂（經(jīng)裂），因此從第1 次至第5 次分裂形成了一單層分裂球，而分裂球都沒有完整的細(xì)胞膜，即分裂球與卵黃之間沒有細(xì)胞膜的隔離，所形成的胚層似乎是一個(gè)合胞體細(xì)胞層。

多細(xì)胞期：受精后2 h 33 min 胚層細(xì)胞繼續(xù)分裂，并且出現(xiàn)了橫向分裂（緯裂）。由于細(xì)胞不斷分裂，細(xì)胞數(shù)量不斷增加，但體積越來越小，細(xì)胞排列變得不規(guī)則，細(xì)胞之間由界限清楚，慢慢變得不清楚，從而形成了桑葚狀的多細(xì)胞胚胎（圖版1 ∶6）。

高囊胚期：細(xì)胞分裂繼續(xù)進(jìn)行，數(shù)量不斷增多，細(xì)胞體積越分越小，胚胎細(xì)胞層次逐漸增多，胚盤位于卵黃上慢慢升高，受精后3 h，胚胎進(jìn)入高囊胚期。此時(shí)胚盤突起呈高帽狀，表面凹凸不平，邊緣較直，細(xì)胞層次較厚（圖版1 ∶7）。

低囊胚期：隨胚胎的繼續(xù)發(fā)育，受精后5 h 42 min，囊胚細(xì)胞覆蓋在卵黃上逐漸向周圍擴(kuò)展，因此，囊胚形狀變低，囊胚層變薄，并且出現(xiàn)了囊胚腔而成為低囊胚期。低囊胚期胚胎表面較光滑，胚盤邊緣與卵黃表面接觸，在接觸處可見到卵黃多核體，由卵黃多核體牽引，胚層逐漸向下伸展（圖版1 ∶8）。

原腸早期：囊胚層細(xì)胞繼續(xù)分裂，并且沿卵黃的表面逐漸向植物極擴(kuò)展、下包，由于囊胚層細(xì)胞分裂的速度快于向植物極擴(kuò)展、下包的速度，部分囊胚層邊緣細(xì)胞向內(nèi)卷入而形成胚環(huán)，受精后6 h 27 min，囊胚層細(xì)胞下包整個(gè)卵黃囊的1/2 即為原腸早期（圖版1 ∶9）。之后進(jìn)入原腸中期。

原腸中期：囊胚層細(xì)胞繼續(xù)下包，受精后7 h 22 min，胚層細(xì)胞下包整個(gè)卵黃囊的2/3 即進(jìn)入原腸中期（圖版1 ∶10）。此時(shí)胚環(huán)加寬，增厚，胚環(huán)處細(xì)胞向胚唇集中突出形成盾狀突起為胚盾。

原腸晚期：囊胚層細(xì)胞繼續(xù)下包，受精后8 h 39 min，胚層下包卵黃3/4～4/5 時(shí)，即發(fā)育至原腸晚期（圖版1 ∶11）。此時(shí)環(huán)形的胚孔出現(xiàn)，環(huán)形胚孔中露出部分卵黃稱為卵黃栓。胚盾逐漸向前伸展，擴(kuò)大成舌狀。

胚孔封閉期：受精后9 h 36 min，原腸晚期胚層細(xì)胞繼續(xù)下包，直至胚層細(xì)胞將卵黃完全包裹，胚孔封閉而發(fā)育到胚孔封閉期。原腸形成后，器官開始形成，胚盤背面增厚，形成神經(jīng)板。神經(jīng)板中央線下內(nèi)有一條圓柱狀脊索；接著，較寬厚的神經(jīng)板前部膨大形成腦泡，腦泡繼而分為前腦泡、中腦泡和后腦泡；而神經(jīng)板的后端窄而薄，此時(shí)胚體中軸器官基本形成，已可區(qū)分頭、尾（圖版1 ∶12）。

克氏泡期：受精后12 h 09 min 胚體越來越明顯，胚體末尾接近卵黃部位出現(xiàn)克氏泡（圖版1 ∶13）。

視囊期：腦泡分化后，前腦部?jī)蓚?cè)出現(xiàn)1 對(duì)視囊（圖版1 ∶14），隨后，視囊凹陷成視杯。

聽板期：腦泡的背后方與體節(jié)前方之間的左右兩側(cè)，各形成一聽板，聽板凹陷成聽囊（圖版1 ∶15）。身體出現(xiàn)色素細(xì)胞。

晶體形成期：受精后12 h 32 min，在視囊的誘導(dǎo)下，其外的外胚層形成晶狀體（圖版1 ∶16），尾部逐漸凸起。

尾芽期：受精后15 h 32 min 胚體尾部少部分與卵黃囊分離，發(fā)育成尖錐狀尾芽（圖版1 ∶17） .

肌肉效應(yīng)期：受精后16 h 26 min，胚體尾部開始扭動(dòng)（圖版1 ∶18）。

心跳期：心臟位于胚體頭下后方，受精后17 h 31 min 心臟開始搏動(dòng)（圖版1 ∶19），起初搏動(dòng)很微弱，逐漸變得快而有力，心跳頻率約85 次/min。

孵化前期：胚體繼續(xù)發(fā)育，受精后18 h 55 min胚體扭動(dòng)較前一階段頻繁而劇烈，尾部可左右抽動(dòng)、卷曲（圖版1 ∶20）。這樣的運(yùn)動(dòng)有利于卵膜破裂，即將孵化出膜。

脫膜孵化期：受精后約20h，仔魚大量出膜(圖版1∶21)。由胚胎頭部?jī)裳壑車谋砥ぜ?xì)胞分化形成的單細(xì)胞腺分泌孵化酶，使卵膜變薄、溶解，同時(shí)由于胚體的不斷扭曲、擺動(dòng)，使胚胎從卵膜中孵化出來。

2.2 紅鰭笛鯛早期正常胚胎發(fā)育發(fā)育時(shí)程表

表1 紅鰭笛鯛胚胎發(fā)育時(shí)程表（水溫：28 ℃鹽度：32.2）

3 討論

3.1 關(guān)于硬骨魚類早期胚胎發(fā)育的分期

硬骨魚類早期胚胎發(fā)育是指從受精卵到孵化出膜，一般分為受精卵期、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、器官發(fā)生期等6 個(gè)階段，進(jìn)而可細(xì)分為30 個(gè)左右時(shí)期（曲漱惠 等，1980）。由于沒有統(tǒng)一的劃分標(biāo)準(zhǔn)，也可能因?yàn)榉N類差異，分期方法不盡一致，不管是大階段的劃分還是時(shí)期的劃分都有增、刪和合并的現(xiàn)象。如劉筠（1993） 將草魚劃分為28 個(gè)時(shí)期，多了一個(gè)多細(xì)胞期，將神經(jīng)胚分成了早、中、晚期，少了眼基出現(xiàn)期、尾鰭出現(xiàn)期、晶體出現(xiàn)期、嗅窩期、耳石期；陳福艷等（2011） 將丁鱥魚分為30 個(gè)時(shí)期少了眼基出現(xiàn)期；鄒記興等（2003） 將點(diǎn)帶石斑魚分為26 個(gè)期；張海發(fā)等（2008） 將鞍帶石斑魚、王興春（2014） 將斑鱾以及陳樸賢（2012）將犬齒牙鲆分為27 個(gè)時(shí)期，等等。本文根據(jù)紅鰭笛鯛胚胎形態(tài)發(fā)生的特點(diǎn)，參考前述及其他學(xué)者（陳國(guó)華 等，2001；杜偉 等，2004；夏連軍 等，2005；張玉明 等，2010；于道德 等，2014；王永明 等，2014；張海發(fā) 等，2006） 對(duì)其他魚的研究結(jié)果，將其早期胚胎的形態(tài)發(fā)生過程同樣分為受精卵期、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、器官形成等6 個(gè)階段，再細(xì)分為受精卵、胚盤隆起（1-細(xì)胞期）、2-細(xì)胞期、4-細(xì)胞期、8-細(xì)胞期、16-細(xì)胞期、32-細(xì)胞期、64-細(xì)胞期、多細(xì)胞期、高囊胚期、低囊胚期、早原腸胚期、中原腸胚期、晚原腸胚期、胚孔封閉期、克氏泡期、視囊期、聽板期、晶體形成期、尾芽期、肌肉效應(yīng)期、心跳期、出膜前期、出膜（孵化期） 24 個(gè)時(shí)期。紅鰭笛鯛在水溫28 ℃、海水鹽度32.2 的條件下從受精到孵化出膜經(jīng)歷了約20 h。其形態(tài)發(fā)生過程與點(diǎn)帶石斑（Epinephelus malabaricus）、黃鯛（Dentex tumifrons）、金頭鯛（Sparus aurata），等其他海水魚的發(fā)育過程相似。

（圖1待續(xù)）

圖1 紅鰭笛鯛早期胚胎發(fā)育過程

3.2 關(guān)于硬骨魚胚胎發(fā)育的時(shí)序

胚胎發(fā)育是一個(gè)連續(xù)的過程，上一個(gè)階段還沒有全部完成，下一階段就開始了，即前一個(gè)組織結(jié)構(gòu)還未完全形成，下一個(gè)組織結(jié)構(gòu)的發(fā)生便啟動(dòng)了，一個(gè)接著一個(gè)，互相重疊甚至是同時(shí)發(fā)生，特別是器官發(fā)生時(shí)更是如此，所以分期或者發(fā)育階段的劃分是人為的。胚胎發(fā)育時(shí)期或階段雖然是人為劃分的，但每一個(gè)階段都有其主要結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。而且每一物種的正常發(fā)育都是按其本身具有的規(guī)律進(jìn)行。按照一般正常發(fā)生規(guī)律，在脊椎動(dòng)物原腸胚形成過程中外胚層已經(jīng)分化為神經(jīng)外胚層和表皮外胚層，神經(jīng)外胚層通過神經(jīng)胚形成而形成神經(jīng)管，神經(jīng)管將分化為中樞神經(jīng)系統(tǒng)（曲漱惠 等，1980；Gilbert，2010；尤永隆 等，2011）。神經(jīng)管形成后（在高等脊椎動(dòng)物胚胎后端的神經(jīng)管尚未完全形成），首先其本身前端分化出前、中、后（菱） 腦泡，然后，前腦泡的兩側(cè)（間腦位置） 向左右各凸出一個(gè)視泡。本文對(duì)紅鰭笛鯛胚胎發(fā)育的研究認(rèn)為原腸形成后的胚孔封閉期和克氏泡期便是神經(jīng)胚期，在這期間神經(jīng)管形成，胚體中軸器官基本形成，已可區(qū)分頭、尾（圖版1 ∶12-13）。神經(jīng)管前部膨大形成腦泡，緊接著，視泡、聽板等器官形成。這一結(jié)果與一般發(fā)育過程及大多數(shù)學(xué)者的研究結(jié)果一致（王彥懷 等，2007；陳國(guó)華 等，2001；鄒記興 等，2003；謝菁 等，2009；陳樸賢，2012；王永明 等，2014；?？姑?等，2005；李明德，1987；Evans，1961；Kimura et al，1989），而與斜帶石斑魚腦泡的形成在聽囊形成后的結(jié)果不一致（張海發(fā) 等，2006）。當(dāng)然，在不同種的魚，某一個(gè)器官、組織的出現(xiàn)的具體時(shí)間可能有一定的差異，同時(shí)，外部形態(tài)觀察結(jié)果一定要通過切片、解剖觀察來證實(shí)才更準(zhǔn)確。

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