李建軍，黃寶玉

（1.濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 濰坊 261041；2.中國科學(xué)院海洋研究所，山東 青島 266071；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是指在體外模擬體內(nèi)細(xì)胞生長環(huán)境，置細(xì)胞于無菌，充足的營養(yǎng)條件，以及適宜的溫度和酸堿度條件下，細(xì)胞能正常生長繁殖，并能維持結(jié)構(gòu)和功能的一種技術(shù)。自從Harrison 于1907年以淋巴液做培養(yǎng)基進(jìn)行蛙胚神經(jīng)組織細(xì)胞的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)取得成功后，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)經(jīng)過一個(gè)多世紀(jì)的發(fā)展已日臻成熟，并成為生物、醫(yī)學(xué)研究及應(yīng)用廣泛采用的技術(shù)方法。利用細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)開展體外試驗(yàn)，已成為闡釋生命機(jī)理，解釋某些疾病的發(fā)病機(jī)制以及篩選藥物的重要手段（薛慶善，2001）；另外，利用細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞融合（Cell fusion），轉(zhuǎn)基因（Transgene） 技術(shù)相結(jié)合的手段可以進(jìn)行基因重組、組織構(gòu)建等。在產(chǎn)業(yè)上，利用細(xì)胞培養(yǎng)可以批量生產(chǎn)具有重要醫(yī)用價(jià)值的酶、生長因子、疫苗和單克隆抗體等，大大提高了效率并降低了成本（王捷，2004）。

目前，全世界已建立的細(xì)胞系至少有數(shù)千種，其中包括人和動(dòng)物的正常細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞以及遺傳缺陷型細(xì)胞等。這也為低等動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的研究提供了大量指導(dǎo)和參考。Grace等（1962） 實(shí)現(xiàn)了鱗翅目昆蟲天蠶蛾（Antheraea eucalypti） 卵巢細(xì)胞系的建立（Grace，1962），開創(chuàng)了無脊椎動(dòng)物病毒學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)、遺傳學(xué)和基因組學(xué)等研究領(lǐng)域（張博等，2011；艾慶輝等，2012）。然而，水生的無脊椎動(dòng)物的細(xì)胞培養(yǎng)卻面臨重重困難。到目前為止，也僅建立了一種淡水蝸牛擔(dān)輪幼蟲胚胎（Biomphalaria glabrata embryonic，BGE） 細(xì) 胞 系（Hansen，1976）。迄今為止，在海洋無脊椎動(dòng)物中尚未建立起成功的細(xì)胞系，目前的細(xì)胞培養(yǎng)多停留在原代培養(yǎng)和有限傳代培養(yǎng)的水平。因此，建立海洋無脊椎動(dòng)物的細(xì)胞系是當(dāng)前國際上的攻關(guān)課題（郎剛?cè)A等，2000a）。鑒于最近我國近海污染比較嚴(yán)重，海洋貝類的重金屬富集現(xiàn)象突出，海洋貝類食品安全問題日益明顯。而海洋貝類細(xì)胞培養(yǎng)能為相關(guān)研究提供迅速靈敏的檢測工具，應(yīng)用前景廣闊。此外，隨著以長牡蠣全基因組序列的測序完成（Zhang et al，2012），以牡蠣為代表的海洋貝類功能基因的驗(yàn)證工作必將掀起前所未有的高潮。而相應(yīng)的細(xì)胞系的建立能為基因功能驗(yàn)證提供強(qiáng)有力工具?，F(xiàn)就貝類細(xì)胞的培養(yǎng)的意義及現(xiàn)狀做一簡要綜述。

1 貝類細(xì)胞培養(yǎng)的研究意義

1.1 進(jìn)行貝類基因功能驗(yàn)證

無論是高等的哺乳動(dòng)物還是較為低等的水生無脊椎動(dòng)物，基因功能的深入驗(yàn)證離不開相應(yīng)細(xì)胞系的建立。無論是轉(zhuǎn)染基因過表達(dá)蛋白還是基因的敲低，敲除，沒有細(xì)胞系的成功建立，這些功能基因驗(yàn)證的常規(guī)實(shí)驗(yàn)都很難開展。細(xì)胞系的建立對(duì)功能基因驗(yàn)證的重要性在此也不再贅述。

1.2 在貝類免疫以及病害防治研究中的應(yīng)用

貝類作為軟體動(dòng)物缺少獲得性免疫，只能依靠自身的天然免疫系統(tǒng)來抵御外來的病菌等。近年來，經(jīng)濟(jì)貝類如牡蠣病毒病害相當(dāng)嚴(yán)重，嚴(yán)重影響了水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)的發(fā)展（Martenot et al，2010）。體外培養(yǎng)的細(xì)胞具有使病毒復(fù)制的全部條件，因此體外培養(yǎng)的細(xì)胞可以用于增殖甚至分離鑒定病毒，為貝類病毒學(xué)的理論研究以及后續(xù)抗病毒藥物的開發(fā)提供理論指導(dǎo)。利用原代培養(yǎng)的血細(xì)胞與病原菌體外共培養(yǎng)的方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于貝類免疫分子機(jī)制的研究（Qiu et al，2007；Yu et al，2012）。此外，多種螺類是人類寄生蟲的中間宿主，相關(guān)的研究能為提高貝類食品安全提供保障，而體外細(xì)胞培養(yǎng)可為研究這些寄生蟲與宿主的互作提供簡便快捷的實(shí)驗(yàn)工具。

1.3 貝類珍珠形成機(jī)理研究

貝類珍珠的形成機(jī)制一直為人們所關(guān)注。目前對(duì)于分泌珍珠質(zhì)的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制還了解不多，而基于個(gè)體或組織水平上的分析又有諸多不便，所以對(duì)于外套膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)的研究對(duì)于珍珠產(chǎn)生機(jī)制的揭示具有重大意義?，F(xiàn)代人工珍珠培養(yǎng)技術(shù)就是將供體珍珠貝外套膜組織塊單獨(dú)或與珠核一并植入受體珍珠貝體內(nèi)形成無核珍珠或有核珍珠（王愛民等，2003）。那么能否模擬珍珠貝體內(nèi)的環(huán)境，體外培養(yǎng)外套膜組織使之形成珍珠囊，最終在培養(yǎng)瓶中培育“試管珍珠”呢？這是長久以來人們的美好愿望，而愿望的實(shí)現(xiàn)首先要解決的問題就是珍珠貝體外細(xì)胞的培養(yǎng)。

1.4 應(yīng)用于環(huán)境檢測

海洋雙殼貝類具有廣泛的地域分布，也較易采集。固著、慮食的生活習(xí)性決定了貝類較容易在體內(nèi)富集污染物，如牡蠣體內(nèi)就能富集大量的重金屬。因此貝類可作為凈化水質(zhì)和檢測水污染的優(yōu)選生物（Latire et al，2012）。由于貝類大部分是人們喜愛的肉質(zhì)鮮美的食品，因此這也是關(guān)乎人類食品安全的大問題。如能建立起成功的貝類細(xì)胞系，那么這種分散的細(xì)胞相比動(dòng)物個(gè)體來說具有操作簡單、檢測迅速準(zhǔn)確以及靈敏度高等不可比擬的優(yōu)點(diǎn)。因此細(xì)胞培養(yǎng)在環(huán)境檢測方面以及相應(yīng)的貝類食品安全等級(jí)評(píng)估等也顯示出廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

1.5 神經(jīng)生物學(xué)的研究以及貝類腫瘤的研究等

神經(jīng)生物學(xué)是21 世紀(jì)的明星學(xué)科。神經(jīng)系統(tǒng)是異常復(fù)雜與精密的，所以其研究難度可想而知。軟體動(dòng)物擁有巨大的神經(jīng)元，是研究神經(jīng)生物學(xué)的難得的實(shí)驗(yàn)材料。并且由于其神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)相對(duì)簡單，比較容易鑒定和適于機(jī)械和一些電生理操作，所以神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)已廣泛用于神經(jīng)軸突生長和再生的研究（Rinkevich，1999；Tamse，1995） 等。另外，貝類的細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)于貝類腫瘤的研究等也具有重要意義。

2 貝類的細(xì)胞培養(yǎng)研究現(xiàn)狀及應(yīng)用

在無脊椎動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的研究方面，海洋貝類的細(xì)胞培養(yǎng)在過去的半個(gè)世紀(jì)里研究最為廣泛。雖然截至目前還沒能培育出一個(gè)能無限傳代成功的細(xì)胞系，但是海洋貝類的原代細(xì)胞的培養(yǎng)依然應(yīng)用到了各個(gè)方面的研究。由于開展的研究較多，以下就海洋貝類不同組織的細(xì)胞培養(yǎng)做一簡述。

2.1 血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)

海洋無脊椎動(dòng)物缺少獲得性免疫系統(tǒng)，血液是重要的免疫器官。細(xì)胞培養(yǎng)作為良好的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头浅＿m用于血細(xì)胞對(duì)外毒物的反應(yīng)的研究。Qiu等（2007） 利用原代培養(yǎng)的櫛孔扇貝Chlamys farreri 血細(xì)胞探究了血細(xì)胞在細(xì)菌脂多糖LPS 刺激下免疫相關(guān)基因CfToll-1 表達(dá)量的變化情況。劉靜等利用培養(yǎng)的櫛孔扇貝血細(xì)胞篩選了細(xì)胞活性檢測的方法，并且研究了苯并芘對(duì)櫛孔扇貝血細(xì)胞的影響（劉靜 等，2009）。Yu 等（2012） 利用多種病原相關(guān)分子模式（Pathogen-Associated Molecular Patterns，PAMPs） 刺激培養(yǎng)的長牡蠣Crassostrea gigas 原代血細(xì)胞來研究相關(guān)基因表達(dá)隨時(shí)間的變化情況。

2.2 鰓組織細(xì)胞培養(yǎng)

在國外，鰓組織細(xì)胞的培養(yǎng)在貽貝中研究的較多。國內(nèi)的鰓細(xì)胞的研究在皺紋盤鮑，中國蛤蜊，菲律賓蛤仔，牡蠣中均有開展。李霞等（1997） 對(duì)皺紋盤鮑Haliotis.discus hanai 鰓組織細(xì)胞體外培養(yǎng)做了研究，用E-MEM 培養(yǎng)液成功將鰓細(xì)胞傳代培養(yǎng)了10 代和11 代。崔龍波等（2000） 進(jìn)行了皺紋盤鮑鰓細(xì)胞培養(yǎng)條件的摸索，并成功把其中兩株鰓細(xì)胞分別傳代培養(yǎng)了22 代和30 代。孫振興等（2005） 將中國蛤蜊Mactra.chinensis 的鰓組織在RPMI1640 培養(yǎng)基中進(jìn)行了原代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在溫度26 ℃～27 ℃，pH=7.4，培養(yǎng)基中不添加小牛血清的條件下，中國蛤蜊的組織也能正常生長。鰓組織培養(yǎng)24 小時(shí)后即有游離細(xì)胞從組織塊遷出，最長培養(yǎng)時(shí)間可持續(xù)至第12 天。孫振興等（2004） 還以菲律賓蛤仔Ruditapes philippinarum 的鰓組織為材料，分別用E-MEM 和M199 培養(yǎng)基對(duì)鰓細(xì)胞進(jìn)行了原代培養(yǎng)。結(jié)果表明，兩種培養(yǎng)基均滿足菲律賓蛤仔鰓組織細(xì)胞培養(yǎng)的要求，細(xì)胞均能正常遷出和增殖（孫振興 等，2004）。鄧瑞鵬等（2004） 利用RPMI1640 培養(yǎng)基對(duì)僧帽牡蠣Saccostrea cucullata 的鰓組織進(jìn)行了培養(yǎng)。并在此基礎(chǔ)上研究了毒性較大的氯化三丁基錫對(duì)牡蠣鰓組織細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)以及存活率的影響。王彬等（2010）采用改良的DMEM 培養(yǎng)基成功的培養(yǎng)了近江牡蠣鰓組織的原代細(xì)胞。

2.3 外套膜細(xì)胞培養(yǎng)

王愛民等（1995） 經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，篩選出適宜于馬氏珠母貝Pinctada martensii 外套組織培養(yǎng)的平衡鹽溶液（改進(jìn)的MMBSS）、基本培養(yǎng)基，并且確立了防止污染的組織凈化方法，并篩選出一種能促進(jìn)細(xì)胞貼壁的物質(zhì)。并在此基礎(chǔ)上，用偏光顯微鏡、掃描電鏡及X-射線能譜分析儀對(duì)所培養(yǎng)細(xì)胞的分泌物進(jìn)行觀察，為進(jìn)一步探索體外珍珠提供了證據(jù)（王愛民等，2003）。

李霞等（1997） 用E-MEM 培養(yǎng)基成功將鮑外套膜細(xì)胞傳至19 代。郎剛?cè)A等選用多種合成培養(yǎng)基與無機(jī)鹽、小牛血清配合進(jìn)行櫛孔扇貝外套膜細(xì)胞的培養(yǎng)。通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)以199 培養(yǎng)基為培養(yǎng)基的主要成分，添加各種鹽以調(diào)整其滲透壓和pH值，另外再加入20%小牛血清等成分為最佳（郎剛?cè)A等，2000b）。陳頡等（2007） 則采用改良的M199 培養(yǎng)基，研究文蛤Meretrix meretrix 外套膜細(xì)胞在不同溫度和鹽濃度條件下細(xì)胞的生長情況，他們培養(yǎng)的細(xì)胞可持續(xù)30～35 d。Gong 等（2008） 成功對(duì)對(duì)合浦珠母貝Pinctada fucata 的外套膜細(xì)胞進(jìn)行了原代培養(yǎng)。并初步研究了其外表皮細(xì)胞參與生物礦化的殼基質(zhì)蛋白分泌過程。他們的原代細(xì)胞培養(yǎng)基選用的是L-15 與M199 按1 ∶1 混合的培養(yǎng)基。并且添加了抗壞血酸，?；撬幔榘椎鞍姿馕锛案黝惪股?。在培養(yǎng)24 h 后細(xì)胞從組織塊中遷出，流式細(xì)胞儀檢測表明遷出的細(xì)胞處于G0/G1期的占83.8%，S 期的占14.61%，G2/M 期的僅1.59%，表明細(xì)胞蛋白合成非?；钴S，但是幾乎無增殖。

2.4 其他組織細(xì)胞的培養(yǎng)

除以上組織的原代細(xì)胞培養(yǎng)外，另外組織細(xì)胞的原代培養(yǎng)也有很多嘗試。如心肌組織細(xì)胞，消化腺細(xì)胞，足肌細(xì)胞等。如Renault 等（1995） 對(duì)歐洲牡蠣Ostrea.edulis 心肌組織的細(xì)胞培養(yǎng)。他們從基本培養(yǎng)基、添加物、促貼壁物質(zhì)等方面都進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)論是：心肌細(xì)胞最佳的培養(yǎng)條件為無菌海水（含3%L-15 培養(yǎng)基） 與長牡蠣C.gigas 血淋巴按1 ∶1 混合，同時(shí)添加10% Fetal Bovine Serum（FBS），促貼壁物質(zhì)多聚賴氨酸等。You 等（2012） 則利用L-15 培養(yǎng)基添加酵母提取物的方法成功培養(yǎng)文蛤消化腺細(xì)胞，并在此基礎(chǔ)上，成功開展RNA 干擾實(shí)驗(yàn)。足肌細(xì)胞的培養(yǎng)在皺紋盤鮑中有過嘗試，但未能進(jìn)行傳代。Takeuchi 等（1998） 對(duì)地中海貽貝Mytilus galloprovincialis 的足細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行的比較成功，基礎(chǔ)培養(yǎng)基L-15 中添加20%FBS 進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)膠原酶處理獲得的單細(xì)胞，4～7 d 便能形成單層，并且可進(jìn)行傳代；經(jīng)胰酶消化后移至新培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞可貼壁并增殖，7 d 內(nèi)形成單層，研究還發(fā)現(xiàn)原代及傳代細(xì)胞中的足絲蛋白Mgfp-1、Mgfp-2、Mgfp-3 基因可以穩(wěn)定的進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。

還有其他關(guān)于海洋貝類原代細(xì)胞培養(yǎng)的嘗試，在此就不一一列舉。

3 貝類細(xì)胞培養(yǎng)面臨的主要困難

3.1 培養(yǎng)基及促生長添加因子

對(duì)于貝類細(xì)胞的培養(yǎng)，基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇應(yīng)該不是難題，由以上的敘述可以看出，無論是EMEM，M199，還是L-15 或是M199 與L-15 培養(yǎng)基的混合液，細(xì)胞生長基礎(chǔ)的營養(yǎng)應(yīng)該都能供給。關(guān)鍵是在促生長的添加因子方面，一直沒能尋得一種或是幾種混合的生長因子來促進(jìn)貝類細(xì)胞的生長繁殖。大量的已有研究成果表明，不能單純的套用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)模式，必須要充分的認(rèn)識(shí)海洋貝類動(dòng)物與哺乳動(dòng)物的不同，深入研究貝類細(xì)胞的營養(yǎng)代謝以及細(xì)胞生理等，以便研發(fā)海洋貝類細(xì)胞培養(yǎng)所適用的培養(yǎng)基。像培養(yǎng)細(xì)胞小牛血清的利用，永生型BGE 細(xì)胞系的成功建立也表明，貝類細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)小牛血清的依賴是不明確的，更有可能小牛血清中一些不確定的營養(yǎng)成分對(duì)貝類細(xì)胞的生長是有害的。對(duì)于不同的貝類，甚至是同種貝類不同組織的細(xì)胞，可能對(duì)營養(yǎng)以及生長因子的需求是不同的。這些都是需要明確并且亟待解決的問題。

3.2 污染防治問題

污染防治的問題一直是細(xì)胞培養(yǎng)面臨的大問題。微生物污染是細(xì)胞培養(yǎng)過程中的大敵，其中以細(xì)菌、真菌和支原體污染最為常見。海洋貝類開放的生活環(huán)境，決定了其本身的器官組織有攜帶大量病菌的可能。雖然在自然條件下，貝類通過自身復(fù)雜精密的免疫調(diào)節(jié)嫻熟的應(yīng)對(duì)來自海洋的形形色色的侵?jǐn)_，但是培養(yǎng)的細(xì)胞卻失去了這種功能。通過怎樣的手段或試劑來對(duì)組織進(jìn)行徹底消毒，而又不影響海洋貝類細(xì)胞本身的活力成為困擾眾多研究者的難題之一，有很大一部分的貝類細(xì)胞的培養(yǎng)終因污染而告終。另外，除以上細(xì)胞培養(yǎng)常見的污染之外，貝類細(xì)胞的培養(yǎng)還可能會(huì)受單細(xì)胞真核生物的污染，如阿米巴蟲等（鐘秀穎，2009），更增加了貝類細(xì)胞培養(yǎng)污染防治的難度。

3.3 細(xì)胞永生性轉(zhuǎn)化問題

要建立一個(gè)成功的貝類細(xì)胞系，永生性是一個(gè)必須面對(duì)的問題。目前對(duì)于海洋無脊椎動(dòng)物特別是貝類細(xì)胞增殖調(diào)控的知識(shí)知之甚少，分析其細(xì)胞周期和了解細(xì)胞分裂的分子機(jī)制將為永生性細(xì)胞的培養(yǎng)提供理論依據(jù)。近年來為了獲得永生性的細(xì)胞系，轉(zhuǎn)永生性相關(guān)基因技術(shù)、物理和化學(xué)誘變技術(shù)以及細(xì)胞雜交技術(shù)已有了初步的發(fā)展和應(yīng)用，這也為解決海洋貝類細(xì)胞培養(yǎng)的永生性轉(zhuǎn)化問題帶來了新的希望。因此，尋找和深入挖掘海洋貝類的永生性轉(zhuǎn)化相關(guān)基因，探究物理和化學(xué)方法誘變海洋貝類細(xì)胞的方法和條件，或是與其他永生性細(xì)胞雜交都是今后需要進(jìn)一步開展的工作內(nèi)容。

海洋貝類重要的經(jīng)濟(jì)和科研地位讓越來越多的人為其細(xì)胞系的建立不斷探索，多年來學(xué)者們對(duì)貝類細(xì)胞系的追求一直沒有停止，也取得了相當(dāng)多的成就，積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)資料等。但是由于各種問題的限制，海洋貝類細(xì)胞的培養(yǎng)現(xiàn)在仍然停留在原代細(xì)胞培養(yǎng)條件的摸索或如何使細(xì)胞在體外生存較長時(shí)間的階段。如何在體外使貝類細(xì)胞無限增殖仍然是全世界所面臨的難題?？傊?，要實(shí)現(xiàn)海洋貝類細(xì)胞建系的目標(biāo)，首先要得到適合海洋貝類生長的合適的培養(yǎng)基，其次添加合適的生長因子等使細(xì)胞成功的進(jìn)行傳代，再次通過一系列的手段實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的永生性轉(zhuǎn)化，最終獲得細(xì)胞系。海洋貝類細(xì)胞系的成功建立也必將為相關(guān)的分子生化研究以及提升海洋貝類食品安全等級(jí)提供保障。

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