石家莊市婦幼保健院兒科(石家莊 050056)

柴玲彥 趙 紅 劉連鳳 劉彥霞 楊秀麗

·臨床研究·

肺炎支原體肺炎患兒血清及支氣管肺泡灌洗液中SP-A、SP-D和KL-6含量變化及意義*

石家莊市婦幼保健院兒科(石家莊 050056)

柴玲彥 趙 紅 劉連鳳 劉彥霞 楊秀麗

目的：探討肺表面活性蛋白A、D(SP-A、SP-D)和KL-6在肺炎支原體肺炎(MPP)血清和支氣管肺泡灌洗液(BALF)中變化及意義。方法：采用自身對(duì)照方法，根據(jù)肺CT影像結(jié)果對(duì)32例單側(cè)肺實(shí)變MPP患兒血清、患側(cè)和健側(cè)BALF中SP-A、SP-D與KL-6進(jìn)行檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果：32例MPP患兒患側(cè)BALF中SP-A、SP-D和KL-6含量分別為243(90～468)、187(43～333)和148(47～426)；健側(cè)分別為104(37～257)、56(25～131)和35(12～147)；血清中分別為35(25～69)、33(9～149)和24(15～62)。血清中KL-6與患側(cè)和健側(cè)BALF中KL-6的相關(guān)系數(shù)分別是-0.534和-0.378。結(jié)論：CAP患兒血清中SP-A、SP-D和KL-6水平變化與肺組織感染具相關(guān)性，血清中KL-6可能比SP-A、SP-D更為敏感。

目前小兒社區(qū)獲得性肺炎(Community-acquired pneumonia, CAP)炎癥方面的化驗(yàn)檢查只能反映宿主全身炎癥狀況，不能直接反映肺組織的炎癥狀況和細(xì)胞損傷程度，不能對(duì)損傷肺組織轉(zhuǎn)歸及預(yù)后提供客觀評(píng)估指標(biāo)[1-2]。2012年10月至2014年10月對(duì)我院兒科確診為肺炎支原體肺炎(Mycoplasma pneumonia pneumonia, MPP)患兒血清和支氣管肺泡灌洗液(BALF)中肺表面活性蛋白A、D(SP-A，SP-D)和KL-6的變化進(jìn)行了研究，旨在尋找能夠反映肺組織被感染后損傷程度的生化指標(biāo)，以評(píng)估肺組織感染損傷嚴(yán)重程度。

資料與方法

1 一般資料 本組MPP患兒32例，男18例，女14例，年齡8個(gè)月至14歲，平均年齡(4.5±1.1)歲。診斷符合實(shí)用兒科學(xué)第七版肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)。病程10～14 d。肺CT影像均顯示病變側(cè)肺實(shí)變面積大于同側(cè)同層橫斷面積1/3，而對(duì)側(cè)無(wú)實(shí)變及滲出MPP的患兒(右肺17例，左肺15例；其中13例伴有胸腔積液)。均排除細(xì)菌感染、病毒感染、肺結(jié)核、真菌感染、兒童哮喘及其他肺疾病。本研究通過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

2 研究方法 采用自身對(duì)照方法，將血清、病變側(cè)BALF和健側(cè)BALF三組中KL-6、SP-A、SP-D進(jìn)行比對(duì)研究。

2.1 肺炎支原體(MP)抗體測(cè)定：入院第1天進(jìn)行MP-IgM、MP-Ab檢測(cè)。采用明膠顆粒載體間接凝集試驗(yàn)，動(dòng)態(tài)血清檢測(cè)MP特異性抗體(日本富士SERODIA-MYCOⅡ試劑盒)。首份血清MP-Ab滴度>1∶160時(shí)，2周后取第2份血清檢測(cè)MP-Ab；首份MP血清MP-Ab滴度<1∶160時(shí)，每5～7d或距首次采血4周后采血檢測(cè)MP-Ab滴度。32例患兒雙份血清MP-Ab滴度升高≥原滴度4倍或≤原滴度的1/4，且MP-IgM陽(yáng)性。

2.2 血清標(biāo)本采集和標(biāo)本制備：32例肺CT顯示具有單側(cè)肺實(shí)變改變的MPP患兒，入院后1～7 d內(nèi)按照《兒科支氣管鏡術(shù)指南(2009年版)》[3]全麻下行支氣管肺泡灌洗術(shù)，灌洗術(shù)經(jīng)患兒家長(zhǎng)知情同意和我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。術(shù)前采血2 ml，4℃條件下以3000 r/min離心10 min[5]，取上清于-80℃儲(chǔ)存待檢。

2.3 BALF標(biāo)本采集和標(biāo)本制備：患兒在全麻下行支氣管肺泡灌洗術(shù)，灌洗時(shí)將37℃生理鹽水1ml/(kg·次)分別注入同一患兒健側(cè)肺段和患側(cè)肺段，用100 mmHg的負(fù)壓立即將灌洗液抽回，共灌洗3～4次，回收率≥40%，取患兒雙側(cè)肺BALF[4-5]，標(biāo)本制備同血清。術(shù)中除1例見支氣管狹窄外，其余未見痰栓、息肉等阻塞支氣管。

2.4 血清及BALF中SP-A、SP-D和KL-6的檢測(cè)：血清及BALF中SP-A、SP-D和KL-6的檢測(cè)使用美國(guó)Santa Cruz 生物公司SP-A、SP-D試劑盒。操作步驟簡(jiǎn)要如下：將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋后加樣，標(biāo)準(zhǔn)品孔加入標(biāo)準(zhǔn)品50μl，待測(cè)品孔加入40μl樣品，再加入抗體各10μl。加入鏈霉親和素50μl，振蕩混勻，37℃水浴1h。每孔加滿稀釋20倍的洗滌液，加顯色劑顯色，用酶標(biāo)儀以450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度值(A)。蛋白定量：取141支一次性試管，分別向管內(nèi)加入2.5 ml堿性銅液，20μl樣品，混勻，室溫放置20min，分別向管內(nèi)加入250μl酚試劑，充分混勻，室溫放置30 min，以未加樣品的第一號(hào)管作為空白對(duì)照，在650 nm處進(jìn)行比色測(cè)定，記錄A值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布，采用中位數(shù)和四分位數(shù)間距[M(IQR)]對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述；組間比較采用Friedman秩和檢驗(yàn)，兩兩比較采用配對(duì)Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)，采用Bonferroni法調(diào)整檢驗(yàn)水準(zhǔn)；相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)系數(shù)。P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 32例MPP患兒病變側(cè)BALF、健側(cè)BALF和血清中SP-A、SP-D和KL-6含量的變化 本組患兒患側(cè)BALF中KL-6和SP-A、SP-D水平明顯高于健側(cè)BALF和血清中KL-6和SP-A、SP-D水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。血清中SP-A水平與健側(cè)BALF中SP-A相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而血清中SP-D、KL-6與健側(cè)BALF中SP-D、KL-6相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05) ，見表1。

表1 32例單側(cè)病變患兒BALF與血清中KL-6和A、D含量的比較[mg/L，M(IQR)]

注：與患側(cè)BALF組比較，*P<0.01；與健側(cè)BALF組比較，△P<0.01

2 32例MPP患兒病變側(cè)BALF、健側(cè)BALF和血清中KL-6和SP-A、SP-D含量的相關(guān)性 Spearman秩相關(guān)分析顯示，血清中KL-6含量與患側(cè)和健側(cè)BALF中KL-6含量分別呈中度負(fù)相關(guān)和低度均負(fù)相關(guān)(P均<0.05)。而血清中SP-A、SP-D含量與患側(cè)和健側(cè)BALF中SP-A、SP-D含量均無(wú)相關(guān)性(P均>0.05)，見表2。

表2 單側(cè)病變患兒血清與BALF中KL-6和SP-A、SP-D含量的相關(guān)系數(shù)

注：與血清中比較，*P<0.05

討 論

肺炎支原體肺炎(MPP)是小兒CAP中常見的一種，探索反映被肺組織感染后的血清生化指標(biāo)對(duì)于研究肺組織感染變化規(guī)律，指導(dǎo)臨床治療和評(píng)估預(yù)后具有重要意義。本研究結(jié)果顯示，32例MPP患兒患側(cè)BALF中SP-A、SP-D和KL-6含量明顯高于健側(cè)，提示SP-A、SP-D和KL-6含量增高與患側(cè)被感染肺組織密切相關(guān)，此與32例患兒肺部CT顯示結(jié)果相一致。且患側(cè)BALF中SP-A、SP-D和KL-6含量均高于血清中SP-A、SP-D和KL-6含量，提示：①肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(AEC-Ⅱ)合成釋放和分泌的SP-A、SP-D和KL-6含量的高低與肺組織是否被感染密切相關(guān)，肺CT掃描顯示為肺實(shí)變的患側(cè)BALF中SP-A、SP-D和KL-6明顯高于未發(fā)生實(shí)變的健側(cè)。②感染肺組織BALF中SP-A、SP-D和KL-6的變化比血清中SP-A、SP-D和KL-6的變化更為敏感、迅速和直接。這可能與下列機(jī)制有關(guān)：宿主肺組織被MP感染初期，AEC-Ⅱ損傷早期，SP-A、SP-D和KL-6合成增加，代償性分泌增高，釋放SP-A、SP-D和KL-6進(jìn)入肺泡腔，使感染嚴(yán)重的患側(cè)BALF中SP-A、SP-D和KL-6的含量明顯高于健側(cè)和血清中含量[6]。肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞因炎癥反應(yīng)受到損傷，導(dǎo)致肺泡毛細(xì)血管通透性增加，SP-A、SP-D和KL-6通過肺泡毛細(xì)血管管壁入血[7]，從而導(dǎo)致血清中SP-A、SP-D和KL-6水平升高。血清中SP-A、SP-D和KL-6水平直接反映了AEC-Ⅱ、且間接反映了AEC-I以及內(nèi)皮細(xì)胞等的損傷[8-9]。③本研究中血清中SP-A含量與患側(cè)和健側(cè)BALF中SP-A的含量間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而SP-D、KL-6只與患側(cè)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明在感染的某一階段，血清中SP-D、KL-6能夠體現(xiàn)出患側(cè)與健側(cè)的差異，即肺組織被感染與未被感染的差異。這可能與SP-A在AEC-Ⅱ的含量較高有關(guān)，SP-A大量?jī)?chǔ)存與AEC-II的板層小體之內(nèi)，且與感染的階段有關(guān)[10]。④從表1中還可以推測(cè)：肺組織被感染階段和程度不同，患側(cè)或健側(cè)BALF和血清中SP-A、SP-D和KL-6含量不同。在感染的某一時(shí)刻，血清中SP-A含量可能與健側(cè)BALF中SP-A差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但疾病進(jìn)展后產(chǎn)生顯著差異；有可能病情再發(fā)展，血清中SP-D和(或)KL-6的含量也會(huì)與健側(cè)BALF中的含量發(fā)生顯著變化。也可以推測(cè)，血清中SP-A、SP-D和KL-6的含量在肺組織被感染的某一時(shí)刻或不同階段與健側(cè)肺組織BALF中含量或差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即可以代表肺組織正常水平(范圍)；如果高于此水平(范圍)則可能預(yù)示肺組織被感染，且含量不同感染的程度也不同。近10年來肺部感染損傷標(biāo)志物的研究[8,11]越來越受到重視。Ishikawa等[12]2011年研究報(bào)道SP-A、SP-D和KL-6在COPD患者誘導(dǎo)痰中的水平升高，與本研究結(jié)果相似。

為了更好地尋找反映被感染肺組織的臨床生化指標(biāo)，對(duì)32例MPP患兒血清中SP-A、SP-D和KL-6含量與被感染肺組織BALF中SP-A、SP-D和KL-6含量的相關(guān)性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明血清中KL-6含量與患側(cè)和健側(cè)BALF中KL-6含量密切相關(guān)。提示在肺組織感染時(shí)，血清中KL-6可能成為比血清中SP-A、SP-D更為敏感的反映肺組織細(xì)胞損傷程度的生化指標(biāo)，且與通過有創(chuàng)性檢測(cè)BALF中KL-6水平評(píng)估肺組織損傷程度相比更容易實(shí)施和接受。Sato等[13]通過對(duì)ARDS患者的研究表明，血清KL-6是衡量肺損傷病理嚴(yán)重程度的指標(biāo)，且對(duì)ARDS的預(yù)后估計(jì)與評(píng)價(jià)有一定的重要意義。這與Nathani等[14]和Kondo等[15]研究的結(jié)果相同：血清KL-6不僅是反映肺泡炎癥的一個(gè)指標(biāo)，同時(shí)也是評(píng)估ARDS預(yù)后的良好指標(biāo)。血清中SP-A、SP-D和KL-6在肺組織感染性疾病中的變化，可能與病原微生物的種類、肺組織被感染損傷的程度和階段有關(guān)，需要對(duì)不同種類的感染和感染的不同階段進(jìn)行動(dòng)態(tài)研究。本研究因無(wú)健康兒童血清和BALF中SP-A、SP-D和KL-6作正常對(duì)照組，且受樣本數(shù)量限制，研究結(jié)果存在一定的局限性，需要不同地域、有代表性的多中心、大樣本，甚至不同年齡段的兒童進(jìn)行系統(tǒng)地研究。

綜上所述，MPP患兒血清和BALF中SP-A、SP-D和KL-6含量與肺組織被感染與否密切相關(guān)。在肺組織感染損傷的某一階段，血清中KL-6水平比血清中SP-A、SP-D更能反映肺組織被感染損傷的狀況。

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(收稿：2015-03-11)

Alterations of SP-A, SP-D and KL-6 in serum and bronchoalveolar lavage fluid in children with Mycoplasma pneumoniae pneumonia

Pediatrics Department of Maternal and Child Health Hospital in Shi Jiazhuang City (Shijiazhuang 050056)

Chai Lingyan Zhao Hong Liu Lianfeng et al

Objective: To study the alterations and relationship of surfactant protein(SP)-A, SP-D and KL-6 in serum and bronchoalveolar lavage fluids (BALF) in children with Mycoplasma pneumonia pneumonia (MPP). Methods: Self-control method was used for the study on SP-A, SP-D and KL-6 in serum, infected and non-infected BALFs in 32 MMP children with only one side of MPP. Results: The contents of SP-A, SP-D and KL-6 in infected BALF were 243(90-468), 187(43-333), 148(47-426); 104(37-257), 56(25-131), 35(12-147) in non-infected BALF; 35(25-69), 33(9-149) and 24(15-62) in serum. The correlation coefficient of KL-6 between serum and infected BALF were -0.534 and -0.378. Conclusion: There are significant correlation between the alterations of SP-A, SP-D and KL-6 in serum and lung infection in children with CAP. KL-6 in serum may be more sensitive than SP-A and SP-D.

Pneumonia mycoplasma/physiopathology Pulmonary surfactant protein Bronchoalveolar lavage fluid Child

*石家莊市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展指導(dǎo)計(jì)劃課題(131461053)

肺炎，支原體/病理生理學(xué) @肺表面活性蛋白 支氣管肺泡灌洗液 兒童

R725.6

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.07.012