蔡 琨 魏 迎 馬久太

山東達(dá)因海洋生物制藥股份有限公司(山東 264300)

膚清液中苦參堿含量測(cè)定方法學(xué)研究*

蔡 琨 魏 迎△馬久太▲

山東達(dá)因海洋生物制藥股份有限公司(山東 264300)

目的：建立膚清液中苦參堿的測(cè)定方法。方法：采用高效液相色譜法測(cè)定苦參堿，色譜柱采用C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，以0.018mol/L磷酸二氫鉀-0.016mol/L十二烷基硫酸鈉-乙腈(30:30:35)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)215nm。結(jié)果：苦參堿與其它成分分離良好，線性范圍為0.2575～2.5750mg，R2=0.9998，膚清液中苦參堿的含量為0.13mg/mL。結(jié)論：所采用方法準(zhǔn)確、靈敏、專屬性好，可用于膚清液中苦參堿的含量測(cè)定。

膚清液是新研發(fā)的一種純中藥復(fù)方制劑，由苦參、鴉膽子、土茯苓等八味中藥組成，具有清熱解毒、燥濕去毒功能，用于治療由病毒感染引起的皮膚瘙癢、疼痛不適、女性白帶量多色黃等疾病，臨床效果良好。方中苦參、鴉膽子為君藥，因鴉膽子成分非常復(fù)雜，暫無有效質(zhì)量控制方法[1]。而苦參具有抗腫瘤、抗炎、抑制皮膚過敏等作用，臨床上苦參常用于治療寄生蟲病，細(xì)菌性疾病，皮膚病，蕁麻珍，濕疹，皮炎等皮膚疾病[2-3]，苦參堿作為苦參中的最為重要的活性化合物[4]。本研究以苦參堿作為膚清液質(zhì)量控制指標(biāo)，對(duì)膚清液中的苦參堿含量測(cè)定及其方法學(xué)考察進(jìn)行了系統(tǒng)研究，為有效控制膚清液的藥品質(zhì)量提供了重要依據(jù)。

1 儀器與試藥 1.1 儀 器 高效液相色譜儀Waters-515)，紫外-可見檢測(cè)器(Waters-2487)，化學(xué)工作站(Waters Empower 3.0)，C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)(Phenomenex Luna)。

1.2 試劑與試藥 苦參堿(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110805-201103)；乙腈：色譜級(jí)；水：重蒸餾水；膚清液：批號(hào)130901、130902、130903，自制。

2 方法與結(jié)果 2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性 Waters C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)； 0.018mol/l磷酸二氫鉀-0.016mol/l十二烷基硫酸鈉-乙腈(30:30:35)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)215nm；流速1.0mL/min?？鄥A理論板數(shù)不低于3000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取苦參堿對(duì)照品20.60mg，置20mL容量瓶中，用80%乙腈溶解，稀釋至刻度，搖勻，作為苦參堿對(duì)照品溶液(濃度1.030mg/mL)，4℃儲(chǔ)存，備用。

2.3 供試品溶液的制備 精密吸取膚清液供試品溶液10mL，加10%氨水溶液調(diào)pH值9～10后，三氯甲烷萃取4次，每次20mL，合并三氯甲烷溶液，水浴蒸干，殘?jiān)?0%乙腈溶解，稀釋，定容至10mL，搖勻，即得。

2.4 線性考察 精密吸取0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL苦參堿對(duì)照品溶液(濃度為1.030mg/mL)至10mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。按上述的色譜條件測(cè)定，以進(jìn)樣量X為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)，計(jì)算并得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為A = 30000000C+92638，R2=0.9998(n=6)。結(jié)果表明，在該色譜條件下苦參堿的線性范圍是0.2575～2.5750mg，線性關(guān)系良好。

2.5 精密度考察 精密10μL苦參堿對(duì)照品溶液(濃度0.1030mg/mL)，重復(fù)進(jìn)樣6次，并按上述色譜條件測(cè)定。結(jié)果峰面積的RSD為1.23%(n=6)，保留時(shí)間RSD為0.07%，表明系統(tǒng)精密度良好。

2.6 溶液穩(wěn)定性 取本品(批號(hào)130901)樣品，按2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，并于室溫放置0、2、4、8、16h后，分別精密吸取供試品溶液10μL，測(cè)定。結(jié)果峰面積RSD為1.42%，表明穩(wěn)定性良好。

2.7重復(fù)性試驗(yàn) 取5份樣品(批號(hào)130901)，按照2.3項(xiàng)下方法制備得供試品溶液，測(cè)定結(jié)果峰面積的RSD為1.54%(n=5)，表明重復(fù)性良好。

2.8 中間精密度 同一實(shí)驗(yàn)室的三位不同實(shí)驗(yàn)人員在不同時(shí)間、不同條件下進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果不同人員測(cè)定的RSD為0.19%。

2.9 陰性試驗(yàn) 按照膚清液的處方、工藝，制備膚清液陰性樣品，按照2.3項(xiàng)下方法制備得陰性樣品溶液并測(cè)定。結(jié)果顯示陰性溶液色譜圖中無苦參堿色譜峰出現(xiàn)，說明陰性無干擾。

2.10 加樣回收試驗(yàn) 取本品(批號(hào)130901)樣品適量6份，精密稱定，分別按80%、100%及120%比例加入苦參堿對(duì)照品溶液，按照2.3項(xiàng)下方法制備得供試品溶液并測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果表明本方法的加樣回收率平均值98.79%， RSD為0.98%(n=6)，表明本方法的準(zhǔn)確性良好。結(jié)果詳見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.11 樣品含量測(cè)定 按照2.3項(xiàng)下方法制備得供試品溶液，供試品、對(duì)照品溶液分別精密吸取10μL，進(jìn)樣，記錄峰面積，測(cè)定本品中苦參堿含量，測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討 論 試驗(yàn)中曾參考2010年版《中國(guó)藥典》一部，對(duì)苦參堿含量測(cè)定的色譜條件中流動(dòng)相乙腈-無水乙醇-3%磷酸溶液(80∶10∶10)[5]進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果表明供試品中苦參堿峰與其他雜質(zhì)峰達(dá)不到基線分離。經(jīng)多次研究篩選優(yōu)化后以0.016mol/L磷酸二氫鉀-0.016mol/L十二烷基硫酸鈉-乙腈(30∶30∶35)為流動(dòng)相，在此條件下苦參堿色譜峰具有較好的分離度。對(duì)于膚清液中苦參堿的提取方法，曾經(jīng)對(duì)超生、回流及萃取進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果萃取>超生>回流。在膚清液含量測(cè)定方法研究中，曾對(duì)苦參中苦參堿、氧化苦參堿都進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)苦參藥材中苦參堿、氧化苦參堿含量較高，而成品中氧化苦參堿特別低，與有關(guān)文獻(xiàn)基本一致，主要原因是氧化苦參堿轉(zhuǎn)化為苦參堿，提示本品在生產(chǎn)過程中，減低溫度，減少加熱時(shí)間[6]。本方法準(zhǔn)確、靈敏、專屬性好，可用于膚清液中苦參堿的含量測(cè)定。

[1] 王立軍, 黃 嫻, 祝靜靜,等.鴉膽子化學(xué)成分及腫瘤細(xì)胞毒活性研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2013，25(6):772-777.

[2] 戴五好, 錢利武, 楊士友,等.苦參山豆根生物堿及其總堿的抑菌活性研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2012,18(3):177-180.

[3] 杜思邈, 馬麗強(qiáng), 孫俊杰,等.苦參提取物體外抗菌實(shí)驗(yàn)研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2010，8(3):74-76.

[4] 張 翅, 馬 悅, 高慧敏,等.苦參化學(xué)成分研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2014，20(4): 205-214.

[5] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].一部.北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：188.

[6] 賈敏鴿，孫文基.苦參及其復(fù)方中苦參堿與氧化苦參堿的轉(zhuǎn)化研究[J].藥物分析雜志,2003，23(2)：90-93.

(收稿2015-07-29；修回2015-08-25)

*國(guó)家科技重大專項(xiàng)項(xiàng)目(2011ZX09401-308-4)

色譜法，高效液相 苦參堿 堿膚清液

R282

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.12.050

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