袁佳妮 曹 蔚 周暄宣 楊 倩 孫紀元 謝艷華 王四旺

第四軍醫(yī)大學(西安 710032)

紫外分光光度法測定靶向修飾脂質體中蟾毒靈的含量*

袁佳妮 曹 蔚 周暄宣 楊 倩 孫紀元 謝艷華 王四旺△

第四軍醫(yī)大學(西安 710032)

目的：建立靶向修飾的蟾毒靈脂質體( BLs)制劑中蟾毒靈( Bu)含量測定的方法。方法：采用紫外分光光度法，通過測定波長300nm處的吸光度，計算BLs制劑中Bu的含量。結果：Bu在15.62-250.0μg/mL的濃度范圍內(nèi)，于300nm處的吸光度線性關系良好，回歸方程為Y=0.0114X-0.0346(R2=0.9997),平均回收率為99.82%，RSD為1.13%(n=9)。結論：本方法操作簡單，且穩(wěn)定性、準確度和精密度均符合要求，可用于BLs制劑中Bu含量的測定，并計算得到BLs制劑中Bu包封率。

傳統(tǒng)中藥材蟾酥(Venenum Bufonis)又名蟾蜍眉脂、蛤蟆酥，是蟾蜍科中華大蟾蜍(Bufo,bufogargarizans Cantor)或黑框蟾蜍(Bufomelanostictus Schneider)的耳后腺和皮膚腺分泌的白色漿液，采集后濾凈曬干制得[1]。蟾酥性辛，溫，味甘平，有毒。入胃、腎經(jīng)，歸心經(jīng)，具有解毒消腫、強心、止痛、開竅醒神的功效。《本草綱目》曾記載蟾酥“治一切惡腫”，其治療腫瘤具有悠久的歷史。蟾毒靈(Bufalin, Bu)屬于蟾毒甾烯類化合物，分子式為C24H34O4，是蟾酥抗腫瘤的主要活性單體成分[2]。研究表明，Bu對多種惡性腫瘤具有抑制作用， 具有較為廣闊的臨床應用潛能[3-4]。但是，蟾毒靈水溶性差，毒性強且體內(nèi)半衰期短，靜脈注射治療窗狹窄，口服給藥蟾毒靈容易分解失效，極大的限制了其臨床應用[5-6]。

納米制劑是近年來新興的靶向遞藥系統(tǒng)，研究表明，腫瘤細胞具有的吞噬能力遠甚于正常細胞，同時，腫瘤病灶部位的血管內(nèi)皮細胞縫隙遠大于正常部位的血管內(nèi)皮細胞，因此與進入正常組織、器官相比，納米粒更易進入并富集于腫瘤病變部位[7-8]。同時載藥納米粒在體內(nèi)能夠緩釋抗腫瘤藥物，延長藥物在腫瘤內(nèi)的存留時間，有效延長藥物作用時間，提高療效[9-10]。我們課題組將蟾毒靈制備成脂質體納米制劑，以期改變其水溶性，降低毒性，延長半衰期，增加蟾毒靈抗腫瘤臨床應用的可行性。本文在參考相關研究文獻的基礎上，應用紫外分光光度法建立了測定蟾毒靈脂質體BLs中Bu含量的方法。

1 材 料 UV2600型紫外分光光度儀(德國Techcompany)；ME235S型電子分析天平(德國賽多利斯公司)；KQ-300E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；超純水系統(tǒng)(美國密理博公司)；bufalin(陜西寶雞辰光生物科技公司，純度%)；大豆卵磷脂(Sigma-Aldrich，St Louis, MO, USA)；膽固醇(Sigma-Aldrich，St Louis, MO, USA)；其他試劑均為分析純，實驗室用水為超純水。

2 方 法 2.1 供試溶液的制備 對照品溶液的制備:精密稱取Bu 10.0mg，置于10mL棕色容量瓶中，加無水乙醇，搖勻，定容至刻度線，超聲震蕩使之充分溶解，配制成1.0mg/mL的Bu標準品儲備液，待用;供試品溶液的制備:精密量取BLs溶液1mL, 置于10mL具塞玻璃試管中，超聲10min后轉移至10mL棕色容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度線，搖勻，即得?？瞻字|體溶液的制備:同供試品溶液制備方法。

2.2 方法學建立 2.2.1 檢測波長的確定：將一定濃度的對照品溶液(Bufalin,100μg/mL)、供試品溶液(BLs)，空白脂質體溶液(Blank)，無水乙醇為空白對照，應用紫外分光光度儀在200～700nm范圍內(nèi)全波段掃描。

2.2.2 標準曲線的建立：分別精密量取對照品溶液0.156,0.312,0.625,1.25,2.50mL于10mL棕色容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度線，得到濃度分別為15.62, 31.25, 62.50, 125.0, 250.0μg/mL的系列對照品溶液，4℃冰箱中避光保存?zhèn)溆?。以無水乙醇作空白，紫外分光光度儀在300nm處分別測定吸光度，以待測物Bu濃度(C)為橫坐標，待測物Bu吸光度(A)為縱坐標，進行線性回歸。

2.2.3 精密度試驗：取Bu對照品溶液(濃度分別為15.62， 62.50， 125.0μg/mL)，紫外分光光度儀在300nm處測定吸光度，日內(nèi)組1d內(nèi)連續(xù)測定5次，日間組同一條件下每隔1d測定一次，連續(xù)測定5d，記錄吸光度值，根據(jù)回歸方程計算其濃度，進而得到日內(nèi)精密度及日間精密度。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗:取Bu對照品溶液(濃度分別為15.62， 62.50， 125.0μg/mL)，分別在低溫(-4℃)、常溫(22℃)、高溫(65℃)下放置12h后測定其吸光度，按回歸方程計算濃度，評價其穩(wěn)定性。

2.2.5 重復性試驗：精密量取自制BLs溶液5份，按照“2.1”項下同供試品溶液制備方法溶進行操作，測定吸光度，根據(jù)回歸方程計算濃度。

2.2.6 加樣回收率測定：分別準確量取Bu對照品溶液1mL(濃度31.25μg/mL)置于9個10mL棕色容量瓶中，分為3組，每組3份。分別加入Bu對照品溶液(15.62μg/mL)1.0mL、2.0mL、3.0mL，配置成低、中、高三種濃度的溶液。以無水乙醇為空白對照，分別測定其在300nm處吸光度值，計算回收率。

2.2.7 樣品檢測：制備3批BLs制劑(每批制劑

體積為2.5mL)，精密量取BLs溶液1mL，分別置于3個10mL棕色容量瓶中，無水乙醇定容至刻度線。以無水乙醇為空白對照，在300nm波長處測定吸光度值，根據(jù)線性回歸方程測得其濃度C，并由稀釋倍數(shù)n(n=100)計算得到BLs制劑中Bu的含量。由于每批BLs制劑制備處方中Bu加入量為0.60mg，求得BLs制劑中Bu包封率。

3 結 果 3.1 檢測波長的確定 蟾毒靈(Bufalin)、蟾毒靈脂質體制劑(BLs)、空白脂質體制劑(Blank)三者的全波長掃描圖可知，Bu的最大吸收波長為300nm，且在300nm波長處，空白脂質體溶液沒有吸收，不會干擾蟾毒靈檢測，專屬性較強，見圖1。

(1.Bufalin；2.BLs；3.blank)

圖1 蟾毒靈、蟾毒靈脂質體制劑及空白脂質體制劑的紫外吸收光譜圖

3.2 標準曲線的建立 由試驗可知，蟾毒靈的濃度及其吸光度之間具有良好的線性關系，線性擬合得到標準曲線方程為Y=0.0114X-0.0346，R2=0.9997(n=5)，其標準曲線。結果顯示，蟾毒靈在15.62至250.0μg/mL的濃度范圍內(nèi)，線性關系良好，符合分析測試要求。

3.3 精密度試驗 由測定結果可知，見表1，所有樣品的日內(nèi)RSD及日間RSD均小于1.0%，精密度良好，符合質量控制要求。

表1 精密度試驗結果

3.4 穩(wěn)定性試驗 結果如表2，所有樣品的回收率均在97.27%～113.35%之間，符合質量控制要求。

3.5 重復性試驗 結果如表3，5份由同一處方制備而成的BLs制劑的RSD值為0.16%，表明重復性較好，符合分析要求。

表2穩(wěn)定性試驗結果(n=6)

表3 重復性試驗結果(n=5)

3.6 加樣回收率測定 其結果見表4，所有樣品的回收率均在98.30%～101.76%之間，求得平均回收率為99.82%，RSD值為1.13%(n=9)，試驗結果符合分析要求，見表4。

表4加樣回收率試驗結果(n=9)

3.7 樣品檢測 結果見表5，根據(jù)測得的樣品吸光度求得3批BLs制劑中Bu的包封率分別為67.69%、68.24%、68.93%。

表5 蟾毒靈脂質體制劑樣品的含量測定結果

4 討 論 本試驗研制的BLs，以蛋黃卵磷脂和膽固醇為載體，將蟾毒靈單體藥物包載于脂質體制劑中，并對蟾毒靈脂質體進行靶向修飾，以達到定位緩釋效果，提高蟾毒靈的生物利用度，延長作用時間，降低藥物毒性，提高藥物安全性，增加其臨床應用的價值。本試驗建立了應用紫外分光光度法測定蟾毒靈脂質體制劑中蟾毒靈含量的方法，方法學結果表明，該方法簡便易行，且準確度高、重現(xiàn)性好，可應用于蟾毒靈含量的測定。

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(收稿2015-07-29；修回2015-08-30)

Content determination of bufalin in targeted liposomes by ultraviolet spectrophotometry

Yuan JianiCao WeiZhou Xuanxuanet al

Fourth Military Medical University( Xi'an 710032)

Objective: To establish the method determination of bufalin(Bu) from Bufalin liposomes(BLs). Methods: Ultraviolet spectrometric assay was used, l=300nm. Results: It had good linearity with the 15.62-250.0μg/mL concentration range of Bu. The regression is Y=0.0114X-0.0346(R2=0.9997). The recovery from the sample was 99.82%, RSD=1.12%(n=9). Conclusion: This method is simple, stable and accurate, which could be used to quality standards for Bu of BLs.

@Bufalin @Ultraviolet spectrometric content determination

*陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項目(2015KTZDSF02-01-02)

@蟾毒靈 @紫外分光光度法

R282

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.12.051

△通訊作者