薛永培, 梁化蘭, 尼亞孜別克, 蔣中英,2

(1. 伊犁師范學(xué)院電子與信息工程學(xué)院, 伊寧 835000; 2. 新疆大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 烏魯木齊 830046)

磷脂跨膜交換機(jī)制的研究

薛永培1, 梁化蘭1, 尼亞孜別克1, 蔣中英1,2

(1. 伊犁師范學(xué)院電子與信息工程學(xué)院, 伊寧 835000; 2. 新疆大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 烏魯木齊 830046)

膜間磷脂交換是一項(xiàng)重要的生理活動(dòng), 其對(duì)藥物運(yùn)輸及膜功能研究有重要意義. 本文用石英晶體微天平及耗散系數(shù)測(cè)試儀研究囊泡與囊泡、囊泡與支撐膜間磷脂交換行為, 熒光光譜儀用來(lái)測(cè)量膜表面電性與膜組分對(duì)磷脂交換的影響. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明: 磷脂跨膜交換速率與交換時(shí)間成反比, 膜表面異電性磷脂的增加會(huì)加速膜內(nèi)相互作用和磷脂跨膜交換速率, 以及改變膜表面組分會(huì)對(duì)囊泡與支撐膜間的磷脂交換產(chǎn)生影響. 本文研究有助于加深理解磷脂跨膜交換機(jī)制, 并對(duì)藥學(xué)研究提供參考.

石英晶體微天平; 支撐膜; 帶電磷脂; 交換速率

1 引 言

細(xì)胞是一切生物體的基本組成單元, 而細(xì)胞膜在其中起著重要的作用, 它與許多生命現(xiàn)象和生命活動(dòng)都息息相關(guān), 是能量轉(zhuǎn)換、物質(zhì)運(yùn)輸、生物傳感和信號(hào)傳導(dǎo)得以進(jìn)行的重要場(chǎng)所. 然而由于細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜, 實(shí)驗(yàn)通常建立結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的模型用來(lái)研究其結(jié)構(gòu), 這些模型包括小單層囊泡(SUVs), 大單層囊泡(GUVs)[1]支持磷脂雙層膜等. 生物膜中、不同的磷脂組分直接影響不同的膜功能, 為了維持膜內(nèi)磷脂組分的恒定, 需要在生物膜之間進(jìn)行磷脂跨膜交換. 磷脂的跨膜交換是保持膜功能的一項(xiàng)重要生命活動(dòng). 此外, 膜內(nèi)磷脂跨膜交換也運(yùn)用于藥物傳遞, 這些以磷脂為基的藥物傳遞系統(tǒng)與膜間相互作用及磷脂交換緊密聯(lián)系.

研究不同的生物膜體系有助于理解磷脂跨膜交換機(jī)制, 異電性磷脂膜間的平衡磷脂交換量與磷脂交換速率已被深入研究, 之前的研究中, 采用吸附囊泡與支撐膜體系, 也對(duì)磷脂跨膜交換有了一定的理解. 早在1960年, Mueller等[2]開(kāi)發(fā)了平面磷脂是雙層膜電學(xué)性質(zhì)的研究體系, Saeki等[3]發(fā)現(xiàn)異電性膜間的靜電吸引作用是實(shí)現(xiàn)磷脂交換的主要因素, MacDonald等[4]已通過(guò)使用熒光顯微鏡和離子譜用來(lái)研究磷脂在囊泡間交換的動(dòng)力學(xué)過(guò)程, 實(shí)驗(yàn)研究正、負(fù)電性磷脂膜間的平衡交換量和磷脂交換的速率, 并首次引入半融合膜結(jié)構(gòu)解釋膜之間的磷脂交換行為. Parikh等人使用鹽離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)器改變膠體磷脂雙層間的靜電相互作用[5]和磷脂交換程度. 雖然前人的研究結(jié)果提出了許多有價(jià)值的結(jié)論, 但是磷脂跨膜交換機(jī)制仍然存在很多疑問(wèn). 例如, 磷脂膜間的接觸實(shí)驗(yàn)的研究仍處于初級(jí)階段, 對(duì)于磷脂跨膜交換過(guò)程中的膜結(jié)構(gòu)認(rèn)識(shí)也有待提高, 除此之外, 膜曲率的影響機(jī)制及磷脂相對(duì)跨膜機(jī)制也有待深入的探索.

本實(shí)驗(yàn)中, 我們使用石英晶體微天平及耗散系數(shù)測(cè)量?jī)x(QCM-D)表征膜表面電性及膜組分對(duì)磷脂跨膜過(guò)程的影響. 石英晶體微天平是一種新型的超微量分析儀器, 它具有靈敏度高、實(shí)時(shí)、快捷、簡(jiǎn)便等特點(diǎn), 可以用以表征膜表面吸附量、膜表面分子的相互作用以及膜體系形貌的變化過(guò)程, 廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域. 熒光光譜儀具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、樣品用量少和方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn), 是基礎(chǔ)研究和實(shí)際應(yīng)用的有效工具. 在此用來(lái)測(cè)量膜表面電性和組分對(duì)磷脂跨膜交換的影響. 實(shí)驗(yàn)闡述了磷脂交換過(guò)程中支撐膜與囊泡之間的最大膜接觸面積的控制機(jī)制. 本研究有助于理解磷脂跨膜交換與運(yùn)輸?shù)男袨? 對(duì)脂質(zhì)體作為藥物傳輸載體提供了參考, 有助于深入理解生物膜的特殊功能.

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用的二油酰基磷脂酰膽堿(DOPC)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二油酰基磷脂酰絲氨酸(DOPS)與二油?；装被?DOTAP)均購(gòu)于Avanti Polar Lipids公司. DOPC, DPPC均為雙電性磷脂. DOTAP, DOPS分別為帶正電和帶負(fù)電的磷脂. 其分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示. 所使用化學(xué)試劑均屬于分析純級(jí), 且在使用前都未被進(jìn)一步提純. 在25℃條件下制備100nM TRIS緩沖溶液, 逐滴滴加100nM NaCl的鹽酸水溶液調(diào)節(jié)PH值至7.4. 實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)過(guò)Milli-Q (購(gòu)于美國(guó)Millipore Co)離子交換凈化系統(tǒng)所得的超純水, 其最小電阻率為18.

圖1 DOPC, DPPC, DOPS, DOTAP, Rhod-DPPE, NOB-DSPE的分子式Fig.1 Formulas of DOPC, DPPC, DOPS, DOTAP, Rhod-DPPE, and NOB-DSPE

2.2 囊泡制備

實(shí)驗(yàn)通過(guò)擠出法制備囊泡. 氮?dú)馔ㄈ胪L(fēng)廚內(nèi), 通過(guò)在容器內(nèi)蒸發(fā)磷脂(200(L)氯仿溶液(3.5 mg/mL)制備磷脂膜. 室溫條件下容器被儲(chǔ)藏在真空干燥箱一夜以去除氯仿雜質(zhì). 為了制備脂質(zhì)體, 實(shí)驗(yàn)溫度增加至50℃且通過(guò)增加1 mL緩沖液并不時(shí)搖動(dòng)3 h達(dá)到再水化. 使用擠壓器(Avanti Polar Lipids)擠壓懸浮液. 使用濾膜孔徑為100 nm或30 nm的擠壓器并循環(huán)擠壓50次得到單層囊泡溶液, 將其放置在新的容器內(nèi), 溫度保持為4℃, 使用前稀釋, 溶液在兩天內(nèi)使用.

2.3 測(cè)量囊泡尺寸

納米粒度分析儀 (NanoSight LM10公司)測(cè)量囊泡尺寸. 實(shí)驗(yàn)在20℃條件下進(jìn)行. 測(cè)量得到由100nm孔徑的濾膜擠出的囊泡, 其流體力學(xué)半徑為56±6 nm(標(biāo)準(zhǔn)誤差), 然而由30 nm孔徑的濾膜擠出的囊泡, 其流體半徑為17±4 nm(圖2).

圖2 納米粒度分析儀測(cè)量的囊泡, 其尺寸(直徑)作為濃度(C)的函數(shù).擠出孔徑濾膜分別為(A)100 nm和(B)30 nm.相應(yīng)的冷凍電鏡顯微圖如右上方所示Fig.2 Nanometer particle size of vesicle measured by the nanometer particle size analyzer, its size (diameter) is seen as a function of the concentration (C). Extrusion aperture membrane are, respectively, (A) 100 nm and (B) 30 nm. The corresponding frozen electron microscopy micrographs are shown in the upper right

2.4石英晶體微天平耗散測(cè)試儀

石英晶體微天平耗散測(cè)試儀(QCM-D)測(cè)量了吸附物的共振頻率偏移值(Δf)和能量耗散偏移值(ΔD). 與吸附物質(zhì)量(Δm)符合Sauerbrey關(guān)系[6]：

Δm=CQCMΔf=CQCMΔfn/n

(1)

其中是Δfn晶體質(zhì)量感應(yīng)常數(shù), 是在n次倍頻后的共振頻率偏移值, 與吸附物的粘滯系數(shù)有關(guān). 如果吸附物的力學(xué)性質(zhì)與牛頓流體性質(zhì)相似(如小單層囊泡SUV), 則值較大.如果其物理性質(zhì)趨近于固體性質(zhì)(如磷脂支撐膜SLB), 則值較小.

在25℃時(shí), 磷脂交換實(shí)驗(yàn)在QCM-D流動(dòng)倉(cāng)E1(QsenseAB)內(nèi)進(jìn)行. 實(shí)驗(yàn)使用基頻為5MHz的SiO2涂層傳感晶體. 首先, 緩沖液注入艙內(nèi)直到保持穩(wěn)定; 其次, 正電性磷脂膜形成支撐膜; 再次, 通過(guò)緩沖液沖洗剩余的囊泡; 然后, 正電性磷脂支撐膜與負(fù)電性囊泡在靜電吸引膜上進(jìn)行跨膜交換. 交換之后, 再次通入緩沖溶液. 至少重復(fù)三次直至誤差為標(biāo)準(zhǔn)偏差. 實(shí)驗(yàn)中所有和的倍頻數(shù)均為7.

2.5 熒光光譜儀測(cè)量

熒光光譜儀(PerkinElmer LS 55)基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)測(cè)量能量供體(NBD-DSPE)與能量受體(Rhod-DPPE)間的平衡磷脂交換量[7]. 實(shí)驗(yàn)中所用囊泡有二種, 一種以0.5 mol%NBD-DSPE和0.5 mol%Rhod-DPPE標(biāo)記, 另一種囊泡未用熒光標(biāo)記. 激發(fā)波長(zhǎng)為460 nm. 測(cè)量20 μL, 1 mM未標(biāo)記的囊泡溶液滴加至2 mL, 0.001 mM的標(biāo)記溶液滴加80 mins之后的熒光行為. 計(jì)算反應(yīng)磷脂交換量的能量轉(zhuǎn)移效率(E), 基于公式: E=IR/IN, 其中, IR和IN分別為Rhod-PE (λem= 589 nm)和NBD-DSPE (λem= 543 nm)的熒光峰值. 磷脂之間的膜交換會(huì)增加標(biāo)記供體和受體探針的平均距離, 能量效率E也隨之增加. 實(shí)驗(yàn)條件與QCM-D的實(shí)驗(yàn)條件保持一致, 被標(biāo)記囊泡對(duì)應(yīng)支撐膜, 未標(biāo)記囊泡對(duì)應(yīng)囊泡.

3 結(jié)果與討論

3.1 膜內(nèi)磷脂交換速率與最大總接觸面積

通過(guò)QCM-D表征正電性支撐膜和帶負(fù)電的囊泡之間的交換行為. 圖3為Δf和ΔD隨時(shí)間t變化的曲線(xiàn)圖. 支撐膜形成過(guò)程(Ⅰ), 首先-Δf和ΔD增加, 表示囊泡吸附在SiO2表面. 隨后-Δf和ΔD降低, 表明囊泡破裂形成剛性片狀磷脂雙層. 最后, 作為完整囊泡的標(biāo)準(zhǔn)值, 分別平衡在(-22.0±1.5)Hz和(3.4±1.8)×10-7Hz. 磷脂交換過(guò)程(Ⅱ), 首先-Δf和ΔD增加, 表明帶負(fù)電的囊泡開(kāi)始吸附在支撐膜上. 隨后-Δf和ΔD降低, 表明在支撐膜與囊泡交換之后支撐膜與囊泡之間的靜電吸引作用逐漸降低, 吸附質(zhì)量由囊泡的解析附過(guò)程主導(dǎo). 最后, 值穩(wěn)定在(-22.3±2.0) Hz和(5.4±2.6)×10-7Hz. 大部分囊泡在磷脂交換最后被解吸附. Kasemo等人已通過(guò)QCM-D, 反射計(jì)法及熒光顯微鏡研究了支撐膜-吸附-誘導(dǎo)磷脂交換的過(guò)程.

實(shí)驗(yàn)中定義的tint與-Δfmin分別與磷脂交換的動(dòng)力學(xué)條件和物理?xiàng)l件有關(guān), 如圖3所示. tint表示支撐膜與囊泡在磷脂跨膜過(guò)程中作用的時(shí)間. 固定磷脂交換量, tint與膜內(nèi)磷脂交換速率成反比. 由于表征支撐膜與囊泡間的磷脂交換量較為困難, 實(shí)驗(yàn)通過(guò)熒光光譜儀測(cè)量正電性與負(fù)電性囊泡之間的磷脂交換量而不考慮交換的程度. -Δfmin表示過(guò)程(Ⅱ)中的最大值即囊泡吸附到支撐膜上的最大量. 假設(shè)與單一囊泡吸附的質(zhì)量增量成正比, 與膜內(nèi)囊泡吸附的接觸面積的增量成正比, -Δfmin反映當(dāng)囊泡尺寸恒定時(shí), 磷脂交換過(guò)程中支撐膜與囊泡之間的最大接觸面積. 圖4 顯示了磷脂交換過(guò)程的示意圖以及兩種類(lèi)型的囊泡交換前和80 mins之后的相應(yīng)能量E值. 能量值E在交換后下降的很快, 表明磷脂交換發(fā)生在膜之間.

圖3 實(shí)驗(yàn)用QCM-D法測(cè)量磷脂交換的Δf-t, ΔD-t的曲線(xiàn). 曲線(xiàn)(Ⅰ)表明正電荷磷脂囊泡吸附在SiO2表面從而形成支撐膜. 曲線(xiàn)(Ⅱ)表明負(fù)電性囊泡與之前的支撐膜交換磷脂, 闡明了相應(yīng)的磷脂組裝在SiO2表面及定義了Δfmin和tint Fig. 3 Δf-t and ΔD-t curves of phospholipids exchange measured by QCM method, Where Curve (Ⅰ) shows that positive charge phospholipid vesicles are adsorpted on the surface of SiO2,which form to the supporting membrane,and Curve (Ⅱ) shows electronegative vesicles exchange phospholipids with the supporting membrane, illustrating the corresponding phospholipid assembles on the surface of SiO2 and defining Δfmin and tint

圖4 磷脂交換示意圖及兩種類(lèi)型的囊泡混合前與混合80 mins之后的熒光光譜圖Fig. 4 Phospholipids exchange figure and fluorescence spectrum figure of two types of vesicles which are before mixing and after mixing for 80 mins

3.2 膜表面電荷效應(yīng)

通過(guò)改變DOTAP/DOPC與支撐膜混合及DOPS/DOPC與囊泡混合的帶電磷脂組分比率研究膜表面電性對(duì)磷脂交換的影響. 如圖5所示, 能量值E隨著帶電磷脂組分的增加而增加. 這表明增加膜表面電荷可以增加平衡磷脂交換量, 也就是說(shuō)異電性磷脂膜可以中和膜表面勢(shì)壘以致達(dá)到交換平衡. 如圖6所示, 支撐膜或囊泡的帶電磷脂組分增加30%, 使得tint縮短10-68%, 說(shuō)明了膜表面電荷的增加會(huì)加速支撐膜與囊泡之間的磷脂交換速率. 這一結(jié)果與MacDonald, Brinker等[8]人得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致, 他們的實(shí)驗(yàn)表明增加異電性磷脂能夠提升膜間相互作用和膠體磷脂雙層與細(xì)胞內(nèi)磷脂的交換能力.

支撐膜或囊泡的帶電磷脂組分增加30%, 致使-Δfmin降低31-47%, 如圖6所示. 也就是說(shuō), 膜表面帶電量越高導(dǎo)致支撐膜與囊泡之間的最大接觸總面積減小. 然而, tint隨著膜表面帶電量的增加而減小, 因此不能推斷出接觸總面積越大膜內(nèi)磷脂交換速率越大.

圖5 熒光光譜實(shí)驗(yàn), 膜表面電性對(duì)熒光標(biāo)記的DOTAP/DOPC與囊泡混合(DOTAP組分比為20%或50%,Rh = 56 nm)及未標(biāo)記的DOPS/DOPC與囊泡混合(DOPS組分比為20%或50%, Rh= 56 nm)磷脂交換的影響. (A)熒光光譜; (B)計(jì)算值EFig.5 The experiment of fluorescence spectrum, the membrane surface electric properties have effects on phospholipids exchange, which are DOTAP/DOPC with fluorescent tags mixing with vesicles (DOTAP component ratio is 20% or 50%, Rh = 56 nm) and DOPS/ DOPC without fluorescent tags mixing with vesicles (DOPS component ratio is 20% or 50%, Rh = 56 nm). (A) fluorescence spectrum; (B) E which is the calculated value

圖6 QCM-D實(shí)驗(yàn)關(guān)于帶電表面的影響. (A) Δf-t曲線(xiàn), 曲線(xiàn)表示DOTAP/DOPC與支撐膜混合之間(DOTAP組分比為20%或50%)及DOPS/DOPC與囊泡混合之間 (DOPS組分比為20%或50%, Rh = 56 nm)的磷脂交換曲線(xiàn).(B)(C)為不同膜表面帶電情況下的 tint, -Δfmin變化Fig.6 The effects of the charged surface in the QCM- D experiment. (A) The Δf-t curves, which show the curves of phospholipids exchange, which say that DOTAP/DOPC and the supporting membrane are mixed up (DOTAP component ratio is 20% or 50%), and the DOPS/DOPC and vesicles are mixed up (DOPS component ratio is 20% or 50%, Rh = 56 nm).(B) (C) The changes of tint and -Δfmin which are conditions of charge on the different membrane surface

圖7 熒光光譜實(shí)驗(yàn). 熒光標(biāo)記的DOTAP/DOPC與囊泡混合(DOTAP組分比為20%或50%, Rh為56 nm)及未標(biāo)記的DOPS/DOPC與囊泡混合(DOPS組分比為20%或50%, Rh為56 nm)膜組分對(duì)磷脂交換的影響. (A)熒光光譜; (B)計(jì)算值EFig.7 The experiment of fluorescence spectrum. The membrane components, that DOTAP/DOPC with fluorescent tags and vesicles are mixed up (DOTAP component ratio is 20% or 50%, Rh is 56 nm), and DOPS/DOPC without fluorescent tags and vesicles are mixed up (DOPS component ratio is 20% or 50%, Rh is 56 nm), have effects on phospholipids exchange. (A) Fluorescence spectrum; (B) E which is the calculated value

3.3 膜組分效應(yīng)

改變囊泡上雙電性磷脂組分DOPC為DPPC, 研究膜組分對(duì)膜內(nèi)磷脂交換的作用. 實(shí)驗(yàn)溫度為25℃, DOPC, DOTAP, DOPS均為液晶態(tài), 而DPPC為凝膠相. 由QCM-D和熒光光譜得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù), 如圖7和圖8所示. 磷脂組分的改變不影響E的變化, 而使時(shí)間tint延長(zhǎng)2-70%. 凝膠相的DPPC組分并不會(huì)改變平衡磷脂交換量, 但是它致使帶異電性膜之間的磷脂交換速率下降. 以前的研究給出了磷脂組分對(duì)中性電荷和液晶囊泡之間磷脂自發(fā)交換的影響. 結(jié)果發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)脂肪酰鏈對(duì)磷脂交換速率有較強(qiáng)的影響. 磷脂交換速率隨著雙鍵的數(shù)目的增加而增加, 隨著?；溕蟻喖谆鶖?shù)目的減少而增加. 增加膽固醇會(huì)降低磷脂交換速率[9]. 然而, 本次實(shí)驗(yàn)首次使用不同相磷脂研究異電性磷脂膜之間的磷脂交換.

囊泡上的雙電性離子從液晶相DOPC轉(zhuǎn)為凝膠相DPPC時(shí)[10], 由于含有DPPC的囊泡流動(dòng)性差,硬度強(qiáng), 這就導(dǎo)致其接觸面積小, 膜內(nèi)交換變慢, 使得囊泡吸附量增加, 得到-Δfmin增加25-84%, 如圖8所示. 這與膜表面帶電量的影響一致. 膜內(nèi)磷脂交換速率越低, 支撐膜與囊泡之間的最大接觸總面積就越大.

圖8 QCM-D實(shí)驗(yàn)(A) Δf-t曲線(xiàn)，ΔD-t曲線(xiàn)表示DOTAP/DOPC與支撐膜混合之間(DOTAP組分比為20%或50%)及DOPS/DPPC或DOPS/DOPC與支撐膜混合之間 (DOPS組分比為20%或50%, Rh為56 nm)的磷脂交換曲線(xiàn). (B)(C)不同膜組分條件下tint和-ΔfminFig.8 The QCM-D experiment, (A) Δf-t and ΔD-t curves, which show the curves of phospholipids exchange, which say that DOTAP/DOPC and supporting membrane are mixed up (DOTAP component ratio is 20% or 50%), and DOPS/DPPC or DOPS/DOPC and supporting membrane are mixed up (DOPS component ratio is 20% or 20%, Rh is 56 nm). (B) (C) tint and -Δfmin, which are conditions of different membrane component

4 討 論

磷脂在支撐膜與異電性囊泡間的交換分為三步. 首先, 囊泡吸附在支撐膜表面[11]. 然后, 支持膜與囊泡發(fā)生交換. 最后, 囊泡從支撐膜上解析附. 在此, 討論交換過(guò)程有助于深入理解磷脂跨膜的交換行為.

異電性磷脂的靜電吸引作用是囊泡吸附到支撐膜表面的主要?jiǎng)恿? 然而, 在離子濃度強(qiáng)的緩沖溶液中靜電相互作用被屏蔽. 100 nM 的NaCl緩沖液中Debye半徑約為0.9 nm, 表明靜電相互作用誘導(dǎo)的沉積效應(yīng)僅在囊泡緊鄰支撐膜時(shí)才起作用. 因此, 盡管帶電磷脂之間的長(zhǎng)程靜電相互吸引作用對(duì)于囊泡吸附在支撐膜上的行為致關(guān)重要, 但由于是短程靜電相互作用起作用, 所以靜電吸引作用對(duì)囊泡吸附速率的作用較小.

通過(guò)熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)[12]驗(yàn)證了靜電吸引膜之間的磷脂交換依賴(lài)于半融合中間結(jié)構(gòu). 如圖9 所示,這一結(jié)構(gòu)首次被提出作為莖和孔之間的中間結(jié)構(gòu)而存在, 其緩解了膜表面的張力. MacDonald等[13]人首次引入這一結(jié)構(gòu)解釋膜之間的磷脂交換行為.

膜表面吸附引起磷脂與磷脂組裝的介質(zhì)之間的交換, 形成過(guò)渡磷脂結(jié)構(gòu). 膜間磷脂交換結(jié)構(gòu)分為四種(圖9): (a) 單體轉(zhuǎn)變; (b) 瞬時(shí)碰撞; (c) 嵌入; (d) 半融合. 單體轉(zhuǎn)變結(jié)構(gòu)和瞬時(shí)碰撞結(jié)構(gòu)是早在1980s提出的兩種磷脂跨膜交換方式[14], 這兩種方法也適用于較低和較高濃度時(shí)不帶電膜之間的自發(fā)磷脂交換行為. 嵌入式結(jié)構(gòu)是從理論上提出的磷脂交換方式[14]. 磷脂直接從供體膜嵌入受體膜而不改變其方向. 早期的研究中, 半融合方法應(yīng)用于異電性膜間的磷脂交換[15]. 交換過(guò)程中激活能與半融合結(jié)構(gòu)的形成有關(guān). 從QCM-D和熒光實(shí)驗(yàn)的尺度上判斷, 前三種都不是最主要的模式, 其交換時(shí)間都比較長(zhǎng), 只有半融合模式對(duì)交換過(guò)程其主導(dǎo)作用, 這與前人的研究一致[16].

5 結(jié) 論

磷脂的跨膜運(yùn)輸和交換過(guò)程較為復(fù)雜, 本文用QCM-D方法和熒光光譜儀研究磷脂在正電性支撐膜和異電性囊泡間交換的速率與膜最大接觸面積, 膜表面電性, 膜組分效應(yīng). 實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn), 支撐膜與囊泡在磷脂交換膜之間所用的時(shí)間與交換速率成反比, 增加帶電磷脂組分比率和減小囊泡尺寸可以提高囊泡吸附速率, 以致加速膜內(nèi)磷脂跨膜交換. 改變膜組分從DOPC到DPPC會(huì)抑制磷脂側(cè)向融合, 從而降低磷脂交換速率. 結(jié)果表明, 最大膜接觸面積隨著膜表面電荷的降低, 囊泡尺寸的降低以及磷脂組分的改變而改變. 囊泡吸附速率和膜內(nèi)磷脂交換速率的競(jìng)爭(zhēng)與最大膜接觸面積有關(guān).

圖9 半融合結(jié)構(gòu)圖Fig.9 Semi-fusion structure figures

本次試驗(yàn)有助于解釋一些生理學(xué)現(xiàn)象, 為藥學(xué)的研究提供了指導(dǎo), 并為進(jìn)一步探索磷脂跨膜交換機(jī)制等復(fù)雜問(wèn)題提供了參考.

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The research of phospholipids exchange mechanism across membrane

XUE Yong-Pei1, LIANG Hua-Lan1, NI Ya-Zi-Bie-Ke1，JIANG Zhong-Ying1,2

(1. School of Electronic and Information Engineering, Yili Normal University, Yining 835000, China;2. School of Physics Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, China)

Inter-membrane lipid exchange is an important physiological activity, which is important in drug delivery and the study of function of membrane. In this paper, quartz crystal microbalance with dissipation monitor(QCM-D) was applied to study the lipid exchange of vesicles-vesicles, small unilamellar vesicles(SUVs) and the supported lipid bilayers(SLBs), and fluorescence spectrometer was used to moniter the effects of membrane surface charge and membrane composition on the lipid exchange. It was found that lipids exchange time is inversely proportional to the inter-membrane lipid exchange rate, the addition of oppositely charged lipids in membranes improves the inter-membrane interaction and lipid exchange, and the changes of membrane composition have effect on the inter-membrane lipid exchange. The study may be helpful to understanding the mechanism of lipid exchange deeply and it also provides guidelines about the pharmaceutical research.

Quartz crystal microbalance; Supported lipid bilayers; Charged phospholipids; Exchange rate

2014-04-02

國(guó)家自然科學(xué)基金(21264016, 21364016)

薛永培 (1991—)，女, 安徽阜陽(yáng)市, 在讀研究生, 主要研究領(lǐng)域?yàn)樯锬づc納米材料復(fù)合體系的自組裝.

蔣中英 (1966—). E-mail: jiangzhongying@163.com

103969/j.issn.1000-0364.2015.08.024

0485

A

1000-0364(2015)08-0660-09