曹冬伸，趙柏林，曲 萍，胡冬梅，王文超，宋曉暉＊，潘樹德＊

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，遼寧沈陽(yáng)110866；2.中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京102609）

小反芻獸疫（Peste des petits ruminants，PPR）俗稱“羊瘟”，是由小反芻獸疫病毒（Peste des petits ruminants virus，PPRV）引起山羊、綿羊及野生小反芻動(dòng)物發(fā)生的以發(fā)熱、口炎、腹瀉、肺炎為特征的急性接觸性傳染病。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）曾將其列為必須報(bào)告的動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病。1942年，Dennec G 等首次報(bào)道了非洲西部象牙海岸發(fā)生的PPR 疫情。此后，PPR 幾乎遍及撒哈拉沙漠到赤道的所有國(guó)家。近年來(lái)，PPR 全球疫情趨于復(fù)雜，老撾、孟加拉國(guó)、印度、尼泊爾、俄羅斯、巴基斯坦和緬甸等我國(guó)周邊多個(gè)國(guó)家該病呈地方性流行態(tài)勢(shì)。2007年P(guān)PR 首次由境外傳入我國(guó)西藏阿里地區(qū)［1］，疫情很快被迅速撲滅，之后在2008年和2010年再次由境外傳入并引發(fā)疫情。2013 年底，PPR 由境外傳入我國(guó)新疆地區(qū)，之后迅速蔓延至全國(guó)多個(gè)省份。

目前，PPR 防控主要以弱毒疫苗免疫為主。1980年，研究人員通過(guò)將Nigeria 75／1 分離株在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代成功獲得了PPRV 致弱毒株，之后在此基礎(chǔ)上制成了第一株P(guān)PRV 弱毒疫苗?；贜igeria 75／1的致弱株疫苗目前仍在非洲地區(qū)廣泛使用，由于亞洲國(guó)家境內(nèi)流行的病毒譜系均為IV 系，接種Nigeria 75／1弱毒疫苗后可能會(huì)增加各譜系病毒的重組、突變和毒力增強(qiáng)的幾率，因此，印度研究人員使用基因IV 分離株Sungri／96、Arasur／87、Coimbatore／97 等，在Vero 細(xì) 胞 上 傳 代 致弱研制成了3株P(guān)PRV 弱毒疫苗，該疫苗目前在印度廣泛使用。弱毒疫苗的應(yīng)用在PPR 疫病控制中發(fā)揮了重要作用，但由于產(chǎn)生的抗體無(wú)法同野毒感染抗體區(qū)分，給疫病的監(jiān)測(cè)和凈化工作帶來(lái)了困難。因此開發(fā)新型基因工程苗成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，并且在重組亞單位疫苗、病毒樣顆粒疫苗、反向遺傳致弱活疫苗、核酸疫苗等研究領(lǐng)域均取得了一定的進(jìn)展。

1 亞單位疫苗

亞單位疫苗是指以能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體的病原體功能性結(jié)構(gòu)蛋白制成的疫苗。亞單位疫苗不含病毒基因，因此具有安全性高、方便規(guī)模制造等優(yōu)點(diǎn)，是目前開發(fā)新型疫苗的一個(gè)重要手段。PPRV 是單股負(fù)鏈RNA 病毒，同其他麻疹病毒科成員一樣，具有囊膜，病毒基因組共編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白，分別為核衣殼蛋白（N）、磷蛋白（P）、大蛋白（L）、囊膜基質(zhì)蛋白（M）、纖突糖蛋白（F）和血凝素（H）。目前在這些結(jié)構(gòu)蛋白的功能研究方面都取得了一些進(jìn)展。N 蛋白包裹著病毒RNA，是最主要的免疫原蛋白，但是針對(duì)N 蛋白的抗體，并不能抵抗病毒感染，因此該蛋白主要用于診斷試劑的研究；H 蛋白是血凝素蛋白，能夠結(jié)合宿主細(xì)胞表面的受體，啟動(dòng)膜融合，使病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞中，H 蛋白是PPRV 感染的最主要免疫原性蛋白，也是引起體液免疫的主要蛋白；F蛋白主要引起細(xì)胞免疫。目前PPR 亞單位疫苗的研究主要集中于H 蛋白和F蛋白，已經(jīng)成功構(gòu)建了能夠表達(dá)H 蛋白、F 蛋白以及F 和H 蛋白的羊痘病毒、腺病毒、桿狀病毒等重組病毒，在實(shí)驗(yàn)條件下接種動(dòng)物，能夠誘導(dǎo)接種動(dòng)物產(chǎn)生免疫保護(hù)力并且沒有副作用。

Diallo A 等［2］將PPRV 的H 基 因 和F 基 因 整合到山羊痘病毒（CPV）上獲得表達(dá)PPRV H 蛋白和F 蛋白的重組CPV 疫苗，該類疫苗免疫接種羊群可以有效保護(hù)羊群免受PPRV 和CPV 的感染，并且低PFU 劑量接種也可產(chǎn)生針對(duì)PPRV 的完全保護(hù)。Caufour P等［3］以CPV－Kenya sheep－1（KS－1）為基礎(chǔ)成功構(gòu)建了表達(dá)PPRV－Nigeria 75／1毒株的F蛋白和H 蛋白的重組CPV，將這兩株重組病毒以103TCID50／頭份的劑量接種山羊，可使山羊獲得針對(duì)CPV 和PPRV 的免疫保護(hù)力，免疫保護(hù)可持續(xù)3周時(shí)間。Qin J L 等［4］將包含人巨細(xì)胞病毒（hCMV）啟動(dòng)子和BGH 早期mRNA 的多聚腺苷酸化信號(hào)的PPRV H 蛋白表達(dá)系統(tǒng)插入到犬2型腺病毒非復(fù)制關(guān)鍵區(qū)的E3區(qū)的SSPI的位點(diǎn)，構(gòu)建了表達(dá)PPRV H 蛋白的重組犬2型腺病毒，用該重組犬2型腺病毒免疫接種山羊可產(chǎn)生高水平的免疫抗體，抗體水平可持續(xù)長(zhǎng)達(dá)7個(gè)月的時(shí)間，并且在免疫接種山羊體內(nèi)沒有分離出腺病毒。Wang Y等［5－6］分 別 以 腺 病 毒（AV）為 載 體，構(gòu) 建 了 表 達(dá)PPRV 的F蛋白、H 蛋白以及F－H 融合蛋白的重組腺病毒疫苗，以該重組病毒免疫接種綿羊或山羊，可使受免疫動(dòng)物產(chǎn)生有效的抗病毒中和抗體，并且沒有出現(xiàn)臨床副反應(yīng)。Rojas J M 等［7］發(fā)現(xiàn)用同時(shí)表達(dá)PPRV F和H 的重組腺病毒疫苗免疫效果比用只表達(dá)F蛋白或H 蛋白的重組腺病毒的好，免疫保護(hù)可持續(xù)長(zhǎng)達(dá)21周，并且可以同時(shí)激活機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫。Rahman M M 等［8］以家蠶角體病毒（BmNPV）表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)PPRV 的F蛋白和牛瘟病毒（RPV）H 蛋白融合蛋白，免疫接種小鼠后，小鼠能夠產(chǎn)生針對(duì)PPRV 和RPV 的特異性抗體。

目前研制成功的PPRV 亞單位疫苗主要分為PPRV H 蛋白亞單位疫苗和PPRV F－H 融合蛋白亞單位疫苗，該兩種亞單位疫苗在臨床上均可完全保護(hù)羊群不受PPRV 的感染，又因其不含有PPRV的全基因組，因此該亞單位疫苗具有免疫保護(hù)性強(qiáng)，安全性高，并可通過(guò)血清學(xué)檢測(cè)免疫羊群是否感染PPRV 野毒等優(yōu)點(diǎn)。但因其在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的高水平抗體時(shí)間為2個(gè)～7個(gè)月，故此類抗體在有效保護(hù)時(shí)間上存在一定缺陷。

2 病毒樣顆粒疫苗

病毒樣顆粒（virus－like particle，VLP）是一種空心顆?；虬铑w粒結(jié)構(gòu)，由病毒結(jié)構(gòu)蛋白組裝而成，形態(tài)上與真正病毒粒子相似，因缺乏病毒基因組而不能自主復(fù)制。與單獨(dú)的抗原蛋白和多肽相比較，病毒樣顆粒表現(xiàn)出與天然病毒更相似的構(gòu)象表位，以接近真實(shí)構(gòu)象的形式呈遞給免疫細(xì)胞，更容易被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別，從而有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)，因此具有更強(qiáng)的免疫原性和生物學(xué)活性，并且不存在基因重組或重配和毒力返強(qiáng)的可能，安全性高，是安全的候選疫苗。Tiollais M L等［9］成功開發(fā)出第一個(gè)基于VLP的疫苗－乙肝病毒表面抗原VLP（HBsAg）疫苗，自此病毒樣顆粒疫苗的研究迅速發(fā)展。目前已經(jīng)建立了細(xì)菌、酵母、桿狀病毒／昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等基于不同表達(dá)系統(tǒng)的病毒樣顆粒系統(tǒng)，并且已經(jīng)成功包裝出了艾滋病病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、傳染性法氏囊病病毒、藍(lán)舌病病毒等病毒的病毒樣顆粒［10］。

王秋霞等［11］構(gòu)建了表達(dá)PPRV 4 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白的 真 核 表 達(dá) 載 體 pCAGGS／N、pCAGGS／M、pCAGGS／F 和pCAGGS／H，將這4個(gè)重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，成功裝配釋放了PPRV VLP，研究還發(fā)現(xiàn)M 蛋白是PPRV VLP正確的裝配和釋放所必須的。隨 后 劉 拂 曉 等［12－15］利 用Bac－to－Bac○R桿 狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建了共表達(dá)M 和H 蛋白的病毒BV－MH 和共表達(dá)M、H、N 蛋白的病毒BVMHN，通過(guò)Western blot、透射電鏡等技術(shù)證明這兩種重組病毒在昆蟲細(xì)胞中均可表達(dá)相應(yīng)的蛋白并自行組裝成VLP（VLP－MH、VLP－MHN），并以出芽方式釋放。將VLP－MH、VLP－MHN 通過(guò)蔗糖密度梯度離心提純后免疫小鼠發(fā)現(xiàn)，這兩種VLP均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性抗H、N 蛋白抗體和中和性抗體，但VLP并不能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生干擾素和白細(xì)胞介素。Li W C等［16］利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建了包含PPRV M 蛋白、F 蛋白、H 蛋白的VLPs，用構(gòu)建的VLPs皮下免疫接種山羊和小鼠后，山羊和小鼠體內(nèi)針對(duì)PPRV 的IgG 抗體顯著升高，在4周內(nèi)能夠獲得針對(duì)PPRV 的完全免疫保護(hù)。

PPRV 病毒樣顆粒疫苗，在抗原形態(tài)上表現(xiàn)為抗原蛋白與病毒顆粒保持一致，因此其具有完整PPRV 的免疫原性，又因其不含病毒基因組，故該疫苗較弱毒活疫苗具有安全性高，可通過(guò)血清學(xué)檢測(cè)免疫羊群是否感染PPRV 野毒等優(yōu)點(diǎn)。但因其在機(jī)體內(nèi)不能連續(xù)產(chǎn)生病毒樣顆粒，使得該疫苗在保護(hù)周期上表現(xiàn)出一定的短板。

3 反向遺傳致弱活疫苗

反向遺傳致弱活疫苗是指以反向遺傳技術(shù)對(duì)病毒的基因組進(jìn)行定向改變，然后通過(guò)病毒拯救技術(shù)得到病毒基因突變或缺失的毒株，并用其制備疫苗。該疫苗兼具弱毒苗的優(yōu)點(diǎn)，且目的性更明確，減毒效率更高，毒力恢復(fù)的幾率更小，是目前發(fā)展迅速的新型疫苗研究方向。1981 年，Racaniello等利用克隆的脊髓灰質(zhì)炎病毒全長(zhǎng)cDNA 轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞首次成功的拯救了脊髓灰質(zhì)炎病毒，開創(chuàng)RNA 病毒反向遺傳學(xué)研究的先河。隨著反向遺傳操作技術(shù)的興起和發(fā)展，30 多年來(lái)，幾乎針對(duì)所有重要的RNA 病毒，如口蹄疫病毒、流感病毒等都成功建立了相應(yīng)的反向遺傳操作系統(tǒng)，通過(guò)構(gòu)建RNA 病毒的感染性cDNA，在DNA 水平上進(jìn)行體外操作，將病毒基因組中的毒力基因進(jìn)行敲除或者替換，就可以獲得毒力減弱的疫苗株，為研究和開發(fā)RNA 病毒疫苗提供了新思路和新手段。

Radecke L S等［17］利用T7RNA 聚合酶系統(tǒng)首次成功建立了麻疹病毒（Measles virus，MV）反向遺傳操作系統(tǒng)，隨后麻疹病毒屬其他成員的反向遺傳操作系統(tǒng)也相繼被建立起來(lái)，目前成功構(gòu)建了MV、RPV、CDV、PPRV 等病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)［18］。對(duì)于PPRV 反向遺傳操作系統(tǒng)建立的關(guān)鍵步驟是病毒基因組全長(zhǎng)cDNA 的克隆，目前多采用“分段克隆”的方法，即將PPRV 病毒全基因分片段克隆，并將得到的病毒基因片段通過(guò)雙酶切連接到真核表達(dá)載體上，測(cè)序并確定序列正確后通過(guò)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞成功拯救出病毒。Hu Q 等［19］通過(guò)該方法成功構(gòu)建了PPRV 的反向遺傳系統(tǒng)，并成功拯救獲得了能表達(dá)綠色熒光蛋白（eGFP）的Nigeria 75／1 毒株。此后Yin C 等［20］還利用該系統(tǒng)成功構(gòu)建了表達(dá)口蹄疫病毒（FMDV）VP1 蛋白的PPRV 重組病毒，該重組病毒可在體外正常增殖，并且能夠表達(dá)口蹄疫病毒VP1 蛋白。重組病毒誘導(dǎo)山羊產(chǎn)生PPRV 中和抗體的免疫原性也沒受到影響，免疫山羊后可同時(shí)檢測(cè)到針對(duì)FMDV 和PPRV 的中和抗體，攻毒試驗(yàn)表明該疫苗可完全保護(hù)山羊免受FMDV 野毒和PPRV 野 毒 的 攻 擊。Muniraju M 等［21］成功構(gòu)建了PPRV 病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)，并成功拯救出H 蛋白77位半胱氨酸定點(diǎn)突變的Nigeria75／1毒株的弱毒株，以該毒株為疫苗接種羊群，羊群可獲得針對(duì)PPRV 的完全保護(hù)，并可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)ELISA 方法區(qū)別疫苗毒和野毒。

PPRV 反向遺傳致弱活疫苗利用病毒反向遺傳技術(shù)，構(gòu)建PPRV 拯救平臺(tái)，通過(guò)該平臺(tái)可成功拯救由基因突變或缺失致弱的PPRV，并可將該弱毒制作弱毒活疫苗。由該方法制備的PPRV 弱毒活疫苗從基因水平解決了弱毒活疫苗在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的弱毒返強(qiáng)問(wèn)題。同時(shí)該方法還可根據(jù)不同基因型的PPRV 制備相應(yīng)PPRV 反向遺傳致弱活疫苗。該疫苗有效的解決了弱毒活疫苗的安全性問(wèn)題，同時(shí)保留了弱毒活疫苗的全部?jī)?yōu)點(diǎn)，更為突出的優(yōu)點(diǎn)是可針對(duì)基因突變的PPRV 制備相應(yīng)的PPRV 反向遺傳致弱活疫苗。該疫苗的缺點(diǎn)為不能通過(guò)血清學(xué)檢測(cè)免疫羊群是否感染PPRV 野毒。

4 核酸疫苗

1990 年，Wolff 等 報(bào) 道 將 純 化 的DNA 或RNA 通過(guò)肌肉注射到小鼠體內(nèi)，載體上的基因能在體內(nèi)表達(dá)并可持續(xù)數(shù)月甚至終生，這一發(fā)現(xiàn)為新型疫苗的開發(fā)開拓了新思路，也標(biāo)志著核酸疫苗的誕生。核酸疫苗是將編碼某種抗原的基因制成疫苗，免疫動(dòng)物后該外源基因可在宿主體內(nèi)表達(dá)抗原，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體。相對(duì)于傳統(tǒng)疫苗，核酸疫苗可同時(shí)激活細(xì)胞免疫和體液免疫，更接近于自然免疫反應(yīng)，且在抗原呈遞過(guò)程中無(wú)抗原表位變化。目前，在流感病毒、艾滋病病毒、乙型肝炎病毒、狂犬病病毒、結(jié)核桿菌及肺炎支原體等病原的核酸疫苗研究領(lǐng)域均取得了一定的進(jìn)展，其中部分疫苗也進(jìn)入了臨床試驗(yàn)階段。

朱學(xué)亮等［22］構(gòu)建了表達(dá)PPRV 的F、H、M 蛋白 的 重 組 真 核 表 達(dá) 質(zhì) 粒pEGFP－F、pEGFP－H 和pEGFP－HM＋FM，用重組質(zhì)粒免疫山羊，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，并且與傳統(tǒng)弱毒疫苗免疫相比，免疫羊在免疫后第4周血清抗體達(dá)到峰值，之后逐漸下降，而弱毒疫苗免疫山羊的血清抗體在免疫后第3周達(dá)到最高峰值，之后開始下降，研究還發(fā)現(xiàn)3種重組真核表達(dá)質(zhì)粒免疫羊的抗體效價(jià)高于弱毒疫苗免疫羊。阮洋等［23］構(gòu)建了表達(dá)PPRV 的F、H蛋白的真核重組質(zhì)粒pCAGGS－H、pCAGGS－F，用重組質(zhì)粒免疫小鼠，能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性抗體，研究還發(fā)現(xiàn)H 蛋白的重組表達(dá)質(zhì)粒的免疫原性強(qiáng)于F蛋白的。楊香芳構(gòu)建了表達(dá)PPRV F 蛋白的重組質(zhì)粒pCAGGS－F，該重組質(zhì)粒在有無(wú)佐劑CpG的情況下，均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高的抗體水平。Wang Y 等［24］將PPRV 的H 基因插入到pSCA1質(zhì)粒上，通過(guò)塞姆利基森林病毒（SFV）復(fù)制子構(gòu)建了PPR 自殺性DNA 疫苗，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK－21細(xì)胞后可表達(dá)有生物活性的PPRV H 蛋白，將該疫苗通過(guò)肌肉注射免疫Balb／c小鼠，能夠在小鼠體內(nèi)檢測(cè)到抗H 蛋白的特異性抗體，并能誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖和產(chǎn)生細(xì)胞免疫。PPRV 核酸疫苗的優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)為免疫機(jī)體后產(chǎn)生抗體迅速，機(jī)體產(chǎn)生抗體的效價(jià)高，可通過(guò)血清學(xué)檢測(cè)確認(rèn)免疫羊群是否感染PPRV野毒，同時(shí)還具有制備周期短，儲(chǔ)存條件簡(jiǎn)單等。但因該疫苗為重組質(zhì)粒核酸疫苗，使得其在機(jī)體會(huì)受到核酸酶的降解，降低其對(duì)動(dòng)物機(jī)體的保護(hù)周期。

5 展望

2011年FAO 和OIE 聯(lián)合發(fā)布全球根除RPV計(jì)劃，成為動(dòng)物疫病防控歷史上的里程碑?？紤]到從病原學(xué)特性及致病機(jī)理等方面同RPV 的相似性，很多學(xué)者提出PPR 可以作為下一個(gè)全球最有可能消滅的動(dòng)物疫病。在廣泛使用弱毒疫苗免疫的情況下如何實(shí)施根除計(jì)劃，需要堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和有力的技術(shù)手段支持，因此，針對(duì)于PPRV 的致病機(jī)理的深入研究更加重要，并且以此為基礎(chǔ)的新型疫苗的開發(fā)以及特異性診斷技術(shù)的研究尤為迫切。就筆者看來(lái)，在廣泛使用弱毒疫苗免疫的情況下，可通過(guò)血清學(xué)檢測(cè)區(qū)分疫苗毒和野毒株感染的基因工程疫苗將是PPR 疫苗發(fā)展的方向，上述4種基因工程疫苗中，除反向遺傳致弱活疫苗外其余3種疫苗均可通過(guò)血清學(xué)方法檢測(cè)羊群是否感染PPRV 野毒，因此這3種疫苗可在建立PPR 無(wú)疫病區(qū)時(shí)發(fā)揮積極作用。反向遺傳致弱活疫苗是完全保留了PPRV免疫原性的活疫苗，并且在宿主體內(nèi)復(fù)制不會(huì)出現(xiàn)毒力返強(qiáng)的現(xiàn)象，較傳統(tǒng)疫苗相比其安全性極大增強(qiáng)，并可針對(duì)不同基因型的PPRV 快速制備針對(duì)性較強(qiáng)的疫苗，迅速控制疫情的發(fā)展，因此PPRV 反向遺傳致弱活疫苗是未來(lái)PPR 預(yù)防及疫情控制研究的一個(gè)新熱點(diǎn)。

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