李桂黎，任冉陽，胡 凌，楊澤曉

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物檢疫實(shí)驗(yàn)室，四川雅安 625014）

兔病毒性出血?。≧abbit haemorrhagic disease RHD）又稱兔瘟，是由兔出血病病毒（Rabbit haemorrhagic disease virus RHDV）引起的兔的一種急性、烈性、高度傳染性和高度死亡性的疾病，曾給世界養(yǎng)兔業(yè)帶來了非常嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［1］。該病于1984年在我國江蘇省首次被發(fā)現(xiàn)，后來在世界各地陸續(xù)有發(fā)生和流行的報(bào)道。自確定該病病原為RHDV后，人們對RHDV進(jìn)行了比較系統(tǒng)的研究，尤其近年來在分子水平對RHDV進(jìn)行的研究越來越多，在RHDV的病原學(xué)、診斷學(xué)和遺傳變異學(xué)上都有了許多新的進(jìn)展［2］。研究表明，VP60蛋白是RHDV的核衣殼蛋白，也是它唯一的結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒誘導(dǎo)免疫的過程中起著重要的作用，是病毒的免疫保護(hù)性抗原［3］。因此，對于VP60蛋白基因結(jié)構(gòu)和功能等方面的深入研究，必將為RHDV的發(fā)病機(jī)理、診斷試劑的開發(fā)和新型疫苗的研制等提供參考材料和理論依據(jù)。為了梳理國內(nèi)外近期在RHD防控研究中取得的主要進(jìn)展，本文對RHDV VP60蛋白基因的結(jié)構(gòu)特征和相關(guān)研究應(yīng)用進(jìn)行了概述。

1 RHDV基因組和VP60基因

RHDV是在20世紀(jì)90年代早期才被定義為杯狀病毒科病毒，呈球形，沒有囊膜，大小為35nm～40nm。RHDV是單股正鏈RNA病毒，總共有7 437個核苷酸，分子質(zhì)量為2.4×103ku～2.6×103ku，基因組結(jié)構(gòu)包含2個開放閱讀框（open reading frame，ORF）。ORF1編碼分子質(zhì)量為256ku的大蛋白，裂解后可分為2C解旋酶（80ku）、3C樣蛋白酶和3D樣聚合酶（73ku）、1個保守區(qū)（43ku）及核衣殼蛋白 VP60（60ku）；ORF2，編碼 VP10蛋白（12.9ku）［4］。其中，VP60蛋白是 RHDV 的結(jié)構(gòu)蛋白，有2個主要的抗原區(qū)域，分別位于N端的第31位到250位氨基酸之間和C端的第477位到第579位氨基酸之間［5］。VP60蛋白由2個同心圓組成，其N端部分組成內(nèi)殼，包括A、B區(qū)，具有很高的抗原免疫性；其C端部分組成外殼，包括C區(qū)～F區(qū)，又可分為P1和P2兩個亞結(jié)構(gòu)域，其中P2區(qū)域暴露在病毒表面，是病毒表面的抗原決定簇。金明蘭等［6］對分離到的YL毒株VP60基因進(jìn)行擴(kuò)增分析發(fā)現(xiàn)，VP60蛋白 A、B、D、F區(qū)變異相對較低，C、E區(qū)變異較高，因而推測A、B、D、F區(qū)在衣殼蛋白中執(zhí)行更多的生物學(xué)功能。

在對RHDV感染肝臟組織的研究中發(fā)現(xiàn)，病毒粒子還含有一條約2.2ku大小的亞基因組RNA（subgnomic mRNA，sgRNA）。sgRNA 只有 一 個ORF，在其5′端共價結(jié)合Vpg蛋白，與基因組僅有2個堿基差異的16堿基保守序列，在3′端也有poly（A）尾，并且其1／3的序列與基因組RNA相對應(yīng)的序列部位相同，其表達(dá)產(chǎn)物與基因組編碼的VP60相同，提示sgRNA也可有效的合成VP60蛋白［7］。因此認(rèn)為，VP60蛋白既可以有多聚蛋白解體而來，也可以由亞基因組sgRNA翻譯而來，但是還有待更直接的證據(jù)證實(shí)。

2 RHDV VP60蛋白基因的變異

VP60蛋白是RHDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，因此VP60基因成為各分離株地域之間、親緣關(guān)系等分子流行病學(xué)調(diào)查的首選基因。劉懷然等［8］擴(kuò)增了不同毒株RHDV VP60基因，并進(jìn)行克隆測序，其結(jié)果在GenBank進(jìn)行對比，其核苷酸同源性為91%～98%，氨基酸同源性為94%～99%，且氨基酸的變異并沒有引發(fā)VP60蛋白高級結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)一步表明VP60基因的保守性。近幾年，隋慧等［9］對CD株的主要抗原表位基因進(jìn)行擴(kuò)增測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD株核酸序列與WX-84株同源性最高為97.5%，與其他毒株同源性為92.0%～96.6%之間；氨基酸序列同源性最高為99.4%，與其他毒株同源性為96.6%～98.3%。楊麗梅等［10］通過對ZB株的克隆分析，表明ZB株VP60基因核苷酸序列與其他株的同源性為92.5%～97.9%。這些研究都表明，VP60蛋白基因核苷酸序列遺傳變異相對穩(wěn)定，具有高度保守性。在國外，Alda F 等［11］分離了伊伯利亞半島野兔中的RHDV，對它們的VP60基因進(jìn)行對比分析，指出RHDV在進(jìn)化過程中，在基因群之間的遺傳距離有逐漸增大的趨勢。隨著遺傳距離的增大，會不會影響RHDV的抗原性和致病性的改變還有待進(jìn)一步研究。

3 VP60蛋白基因在RHDV檢測中的研究

臨床實(shí)踐中RHD的診斷主要靠臨床癥狀和剖檢，結(jié)合病毒分離和血凝抑制試驗(yàn)進(jìn)行綜合判定。由于VP60蛋白基因核苷酸序列遺傳變異相對穩(wěn)定，具有高度保守性，因此國內(nèi)外研究者以VP60蛋白基因?yàn)榛A(chǔ)在RHDV檢測方面進(jìn)行了大量研究，并建立了很多科學(xué)可靠的檢測技術(shù)，主要包括分子生物學(xué)檢測技術(shù)和免疫學(xué)檢測技術(shù)。

3.1 分子生物學(xué)檢測技術(shù)

3.1.1 RT-PCR RT-PCR方法檢測RHDV特異性強(qiáng)，敏感度高，重復(fù)性好，不僅可用于RHD的臨床診斷，也可以用于市場上兔肉制品的檢疫。胡波等［12］根據(jù)GenBank上公布的VP60基因的序列，設(shè)計(jì)了一對特異性引物，目的片段長度為591bp，經(jīng)過優(yōu)化條件，建立了兔群鼻拭子中的RHDV的RTPCR檢測方法，經(jīng)檢驗(yàn)，該方法有很好的檢出率。王印等［13］根據(jù)GenBank上公布的RHDV和歐洲野兔綜合征病毒（EBHSV）的VP60基因的序列，設(shè)計(jì)特異性引物，建立了RHDV和EBHSV的復(fù)合RTPCR檢測方法，對2種病毒目的基因的檢測限度可達(dá)50copies，為RHD和EBHS的診斷提供了一種技術(shù)手段。

3.1.2 RT-LAMP 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loopmediated isothermal amplification assay，LAMP）是近年來新興的一種嶄新的DNA擴(kuò)增技術(shù)，具有簡單快速，特異性強(qiáng)，靈敏度高，結(jié)果判定簡單，成本低廉等特點(diǎn)，有著極為廣泛的應(yīng)用。Yuan D等［14］針對VP60基因保守序列，設(shè)計(jì)合成了內(nèi)、外兩對引物，在Bst DNA聚合酶的作用下完成反應(yīng)，并對條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，該方法簡單快捷，特異性好，靈敏度比普通的RT-PCR方法高出100倍，對于臨床樣品的檢測結(jié)果也顯示比RT-PCR方法具有更高的檢出率。RT-LAMP檢測技術(shù)不僅節(jié)約時間，還可以通過裸眼進(jìn)行結(jié)果判讀，在國內(nèi)基層臨床RHD診斷中具有廣闊的應(yīng)用潛力。

3.2 免疫學(xué)檢測技術(shù)

3.2.1 ELISA VP60蛋白是RHDV的衣殼蛋白，也是它的保護(hù)性抗原，在誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)中起著重要作用，也是RHD免疫學(xué)診斷首選的蛋白。董婷等［15］以抗RHDV多克隆抗體為包被抗體，以抗RHDV VP60單克隆抗體為檢測抗體，建立了RHDV雙夾心ELISA檢測方法，該方法敏感性高，特異性強(qiáng)。馬力等［16］利用ZB株RHDV VP60序列為模板，擴(kuò)增了該基因并進(jìn)行原核表達(dá)，純化出該蛋白，并以該蛋白為診斷抗原，初步建立了檢測RHDV抗體的間接ELISA診斷方法。李云琴等［17］也利用原核表達(dá)建立了RHDV VP60-ELISA診斷方法，經(jīng)驗(yàn)證，該方法具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性。研究表明，利用RHDV VP60蛋白的重組蛋白建立的ELISA方法，特異性好，敏感性高，也是可以用于RHDV檢測的免疫學(xué)技術(shù)。

3.2.2 膠體金免疫層析法 蔡少平等［18］用膠體金標(biāo)記純化的RHDV多克隆抗體，以桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組RHDV VP60蛋白為免疫原制備RHDV的單克隆抗體，將這種單克隆抗體和羊抗兔IgG抗體包被在硝酸纖維素膜上，分別作為檢測線和質(zhì)控線，經(jīng)優(yōu)化制成RHDV免疫膠體金試紙條。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)該試紙條敏感性高于HA，是一種快速、靈敏、特異的檢測方法。免疫膠體金技術(shù)除了敏感特異以外，最主要的優(yōu)勢是不需要特殊工具和讀判儀器，更加適宜臨床實(shí)踐中快速簡便的使用，因此具有廣泛的應(yīng)用前景。不過到目前為止尚未見到商品化用于RHDV檢測的膠體金試紙條生產(chǎn)，其應(yīng)用有待進(jìn)一步開發(fā)研制。

4 VP60蛋白基因在疫苗預(yù)防方面的研究

目前生產(chǎn)上預(yù)防兔病毒性出血病的疫苗主要是組織滅活疫苗，但是其免疫效果常常受到各種因素的影響，并且尚未發(fā)現(xiàn)能夠讓RHDV穩(wěn)定生長的細(xì)胞系，研發(fā)新型疫苗已經(jīng)成為一種重要趨勢。鑒于RHDV只有一個血清型，其VP60蛋白具有良好免疫原性，基因又相對比較保守，為新型疫苗研制提供了前提和基礎(chǔ)，國內(nèi)外很多學(xué)者采用多種表達(dá)系統(tǒng)對VP60蛋白進(jìn)行了表達(dá)［19］。

4.1 原核表達(dá)

大腸埃希菌的原核表達(dá)系統(tǒng)是實(shí)驗(yàn)室常用的表達(dá)系統(tǒng)。Boga J A 等［20］早在1994年就對 VP60蛋白進(jìn)行了原核表達(dá)，并具有良好的免疫效果。在國內(nèi)，嚴(yán)維巍等［21］在2003年也對VP60蛋白在BL21株大腸埃希菌中進(jìn)行了表達(dá)，其蛋白與天然衣殼蛋白具有相似性。隨后，肖躍強(qiáng)等［22］建立了相應(yīng)的大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)，并檢測表明該蛋白具有良好的免疫原性，具備了作為亞單位疫苗的條件，這為亞單位疫苗的研究提供了重要參考。

4.2 真核表達(dá)

嚴(yán)維巍等［23］將VP60基因插入酵母轉(zhuǎn)移載體中轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌GS115株，篩選獲得充足酵母菌，并經(jīng)過Western blot檢測表達(dá)的重組蛋白具有良好的免疫原性。陳柳等［24］利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)RHDV結(jié)構(gòu)蛋白VP60的重組桿狀病毒，經(jīng)檢測VP60可在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，且能夠組裝形成病毒樣顆粒。譚暉等［25］和 Gao J等［26］重組嵌合 VP60基因，并利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，轉(zhuǎn)染至Sf9昆蟲細(xì)胞，并都得到表達(dá)的蛋白，且都可以形成與VP60蛋白類似的病毒樣顆粒。Cheng Y等［27］成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染至BKH-21細(xì)胞，成功表達(dá)蛋白，并且具有免疫原性。Yuan D等［28］構(gòu)建了pcDNA-VP60真核表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染至RK13細(xì)胞中，將構(gòu)建好的質(zhì)粒作為核酸疫苗注射小鼠，并檢測其抗體水平，結(jié)果表明該真核表達(dá)質(zhì)粒能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。

4.3 其他表達(dá)

也有學(xué)者采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行了口服疫苗的研究探索，李傳山等［29］建立了串葉松香草高效再生體系，并篩選到了2株擬轉(zhuǎn)基因植物；唐廣立等［30］建立了百脈根高頻再生體系，成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體；Mikschlfsky H 等［31］采用了4種不同的植物表達(dá)VP60蛋白，得出煙草和豌豆表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白可溶性較高，免疫兔后可產(chǎn)生抗體反應(yīng)。利用轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)VP60進(jìn)行口服免疫，為RHD的預(yù)防和控制提供了一條新的思路和奠定了基礎(chǔ)。

5 結(jié)語

兔病毒性出血病是在20世紀(jì)末期暴發(fā)的兔急性烈性傳染病，嚴(yán)重危害養(yǎng)兔業(yè)，加強(qiáng)對RHD診斷技術(shù)和新型疫苗的研究對該病的預(yù)防和控制都有非常重要的意義。VP60基因是RHDV的核衣殼蛋白，也是唯一的結(jié)構(gòu)蛋白，其序列的相對保守性使得在研究RHDV分子診斷技術(shù)和新型疫苗方面都作為首選的基因。近年來以VP60基因?yàn)榛A(chǔ)在RDHV病原學(xué)、診斷和預(yù)防等方面的研究成果比如RT-PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、膠體金免疫試紙等許多新的檢測診斷技術(shù)，以及其原核表達(dá)、真核表達(dá)產(chǎn)物的良好免疫原性試驗(yàn)都顯示出了非常廣闊的應(yīng)用前景，并且為RHD的快速診斷和新型疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)和提供了一些新的方法和思路。相信隨著人們對VP60蛋白基因研究的不斷深入，VP60在RHD防控的基礎(chǔ)性研究、診斷技術(shù)發(fā)展和新型疫苗研制等方面的重要作用會逐步顯現(xiàn)，也會以此為基礎(chǔ)找到更理想的RHD的防控方法，為我國養(yǎng)兔業(yè)持續(xù)健康穩(wěn)定發(fā)展提供保障。

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