郭 磊,胡 佳,肖文娟,劉春林*
(1 作物資源創(chuàng)新與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)沙 410128; 2 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,長(zhǎng)沙 410128)
擬南芥AtLCR67干擾質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因植株的鑒定
郭 磊1,胡 佳1,肖文娟2,劉春林1*
(1 作物資源創(chuàng)新與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)沙 410128; 2 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,長(zhǎng)沙 410128)
種子發(fā)育過程是植物整個(gè)生長(zhǎng)周期最重要的階段,涉及到一系列功能物質(zhì)的合成和轉(zhuǎn)化,是由各種相互關(guān)聯(lián)的基因共同控制完成的,因此,研究該階段特異性表達(dá)的基因?qū)ρ芯糠N子發(fā)育過程非常重要。以種子特異性表達(dá)的基因AtLCR67為研究對(duì)象,通過構(gòu)建RNAi干擾質(zhì)粒,借助根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法,將AtLCR67基因的RNAi表達(dá)框轉(zhuǎn)到擬南芥基因組中;經(jīng)過PPT抗性篩選與PCR鑒定,成功獲得了8株轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)其中的3株進(jìn)一步作RT-PCR檢測(cè),顯示有2株中的AtLCR67基因表達(dá)被完全抑制,另一株的基因表達(dá)水平被抑制了大約70%,結(jié)果完全實(shí)現(xiàn)了設(shè)計(jì)目標(biāo);同時(shí)還發(fā)現(xiàn)T2代植株有晚花表型。這兩株轉(zhuǎn)基因植株為進(jìn)一步研究AtLCR67功能與作用機(jī)制提供了良好的遺傳材料。
擬南芥;AtLCR67基因;RNAi質(zhì)粒;遺傳轉(zhuǎn)化;基因沉默
LCR(LOW-MOLECULAR-WEIGHTCYSTEINE-RICH)家族在擬南芥中有86個(gè)成員,其家族蛋白通常含有一段信號(hào)肽序列,一般都屬于分泌蛋白,分子量較小,都不超過12 kDa。多序列比對(duì)結(jié)果表明,除都含有8個(gè)高度保守的半胱氨酸外,家族成員的同源性較低。除LCR27和LCR71外,LCR家族其他基因都在靠近5′端有一段長(zhǎng)約75~275 bp的內(nèi)含子序列[1]。LCR家族基因成員眾多,但是功能已知的不多。目前,在LCR家族中,了解的基因功能有兩個(gè)方面:植物防御和自交不親和。擬南芥LCR基因家族包含DEFL (Defensin-like)亞家族,稱為類防御蛋白,這一類蛋白與病原菌抗性相關(guān),又稱為抗菌肽[2]。此外,LCR基因家族中還包含一些編碼PCP蛋白(Pollen coat protein)成員的亞家族。PCP蛋白是一種富含半胱氨酸的小分子量花粉外包壁蛋白,能與SLG(S-locus glycoprotein)和SLR1(S locus-related 1)相互作用,使成熟的花粉可以粘著在柱頭上順利完成花粉管的萌發(fā)以及受精[3],避免了自交不親和現(xiàn)象(self-incompatibility,SI)。AtLCR67(AT1G75830),又名AtPDF1.1,為擬南芥(Arabidopsisthaliana)LCR家族中DEFL亞家族的一員。氨基酸序列親緣關(guān)系分析結(jié)果,將AtLCR67聚類到DEFL亞家族,編碼了一種PR(pathogenesis-related) 蛋白,屬于植物防御(PDF)家族。AtLCR67在種子中特異性表達(dá)[4],且在擬南芥種子發(fā)育過程中的第8~10階段表達(dá)量最高,在干種子與吸脹種子中有表達(dá),其它組織中不表達(dá)(http://www. arabidopsis.org/)。但是有研究證實(shí)用真菌感染擬南芥的葉片,在感染的部位AtLCR67會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)[5],這表明AtLCR67在特殊情況下可以在種子之外起作用。此外,由于AtLCR67在正常生長(zhǎng)情況下只在種子中表達(dá),推測(cè)該基因很可能會(huì)參與擬南芥的胚胎發(fā)育或種子中儲(chǔ)存物的代謝物合成過程。總之,有關(guān)AtLCR67的確切功能至今尚不清楚。本研究采用RNAi原理[6],通過構(gòu)建AtLCR67干擾質(zhì)粒,并且對(duì)哥倫比亞野生型擬南芥Col-0進(jìn)行轉(zhuǎn)化,并通過篩選獲得了穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株,從而為深入研究AtLCR67基因的功能提供基礎(chǔ)材料。
1.1 材料
擬南芥(Arabidopsisthaliana)哥倫比亞生態(tài)型Col-0,大腸桿菌(Escherichiacoli) DH5α,根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101,OMEGA公司質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒,干擾載體pNapin-pFGC5941(為Napin2基因的啟動(dòng)子替換了原有的CaMV35S啟動(dòng)子)、T載體pMD-19,由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物發(fā)育與表觀遺傳調(diào)控實(shí)驗(yàn)室提供。
1.2 方法
1.2.1 擬南芥的生長(zhǎng)
用純水拌營(yíng)養(yǎng)土,將擬南芥種子播于裝有營(yíng)養(yǎng)土的小缽中,封保鮮膜保濕,避光4℃處理3 d,轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)室培養(yǎng)3 d后揭膜[7],生長(zhǎng)條件22~25℃[8],長(zhǎng)日照(16 h/8 h),定期澆灌1/4MS營(yíng)養(yǎng)液。
1.2.2 pAtLCR67RNAi質(zhì)粒設(shè)計(jì)
從TAIR(http://www.arabidopsis.org/)網(wǎng)站上查到AtLCR67的CDS序列,經(jīng)過同源性比對(duì),選取了自ATG開始,特異性強(qiáng)的98 bp序列作為干擾片段。選擇經(jīng)改造的帶有Napin啟動(dòng)子的pFGC5941為基礎(chǔ)載體。目標(biāo)片段克隆引物序列如下:
pLCR67RNAiF:5′-GCTCTAGACCATGGATGGCTAAGTCTGC TACCATC-3′(下劃線標(biāo)記為XbaI和NcoI酶切位點(diǎn))
pLCR67RNAiR:5′-CGGGATCCGGCGCGCCC ACAACTTCTGT GCTTCCAC-3′(下劃線標(biāo)記為AscI和BamHI 酶切位點(diǎn))
擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為128 bp。
1.2.3 pAtLCR67RNAi質(zhì)粒構(gòu)建
用Trizol[9]法提取擬南芥Col-0開花后10 d果莢的RNA。反轉(zhuǎn)錄出cDNA,并以此為模板,用引物pLCR67RNAiF/pLCR67RNAiR擴(kuò)增出LCR67干擾片段。切膠回收后連接到T-載體pMD-19上,通過熱激法[10]轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α,PCR檢測(cè)出陽性克隆送測(cè)序。用NcoI和AscI雙酶切測(cè)序正確的pMD-19-LCR67 RNAi和Napin-pFGC5941,回收目的片段和目的載體,T4連接酶16℃連接過夜,獲得連接有正向干擾片段的Napin-pFGC5941載體,通過熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α,PCR檢測(cè)出陽性克隆,擴(kuò)大培養(yǎng)后用OMEGA公司質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。XbaI和BamHI雙酶切測(cè)序正確的pMD-19-LCR67RNAi反向片段和連有正向片段的Napin-pFGC5941?;厥漳康钠魏湍康妮d體,T4連接酶16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,并通過酶切驗(yàn)證確定載體構(gòu)建成功。
1.2.4 擬南芥轉(zhuǎn)化
提取質(zhì)粒通過凍融法[11]將構(gòu)建好的質(zhì)粒pAtLCR67RNAi轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌GV3101中,進(jìn)行菌落PCR鑒定和雙酶切驗(yàn)證。挑取正確的克隆于10 mL含有慶大霉素(30 mg/L)、卡那霉素(50 mg/L)、利福平(100 mg/L)的YEB培養(yǎng)基中,28℃、200 rpm培養(yǎng)36 h。再將培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)至新50 mL YEB中擴(kuò)大培養(yǎng);用浸花法[12]轉(zhuǎn)化Col-0。浸染后的植株黑暗處理24 h后移到長(zhǎng)日照條件下生長(zhǎng)。待T0代種子成熟后,密集播種在裝有營(yíng)養(yǎng)土的缽子中,待真葉長(zhǎng)出后,用噴壺噴施1 mg/L PPT,每天1次,連續(xù)7 d,篩選到抗性苗后,將其單株移栽到新的缽子中培養(yǎng),為T1代植株。
1.2.5 轉(zhuǎn)基因植株AtLCR67干擾效果鑒定
用Trizol法提取T1代植株開花后10 d的果莢RNA,反轉(zhuǎn)出cDNA,通過RT-PCR比較AtLCR67在T1植株與Col-0的表達(dá)情況,從而判定pAtLCR67RNAi載體的干擾效果。若RT-PCR結(jié)果證實(shí)pAtLCR67RNAi干擾效果明顯,可進(jìn)行定量PCR實(shí)驗(yàn),更加精確的了解其干擾程度。
1.2.6 轉(zhuǎn)化子的鑒定與表型觀察
經(jīng)過篩選得到的T1代植株在長(zhǎng)日照條件下培養(yǎng)兩周后取其莖生葉,用CTAB法[13]提取其DNA為模板,以pLCR67RNAiF為上游引物,取pFGC5941上Intron的一段序列設(shè)計(jì)的Intron703R為下游引物,進(jìn)行PCR檢測(cè)。Intron703R序列為:5′-CTCCATCTTATTCCCTCCGTTTCAC-3′。根據(jù)PRC結(jié)果確定抗性苗是否為轉(zhuǎn)基因植株,并對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的表型進(jìn)行觀察。
2.1 干擾質(zhì)粒的構(gòu)建
從Col-0開花后10 d的果莢中提取RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA后,用設(shè)計(jì)好的引物pLCR67RNAiF/ pLCR67RNAiR擴(kuò)增出用于干擾的目的片段。目的片段連接到中間載體pMD-19上,測(cè)序,選擇測(cè)序正確的菌落提取質(zhì)粒。利用NcoI/AscI和XbaI/BamHI兩組雙酶切,先后將干擾片段正反向插入到CHAS intron的兩側(cè),構(gòu)建AtLCR67基因的RNAi質(zhì)粒。通過PCR方法,及用NcoI/AscI,XbaI/BamHI兩組雙酶切pAtLCR67RNAi載體,結(jié)果與預(yù)期一致(圖1A),表明AtLCR67RNAi質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖1B)。
圖1 干擾質(zhì)粒 pAtLCR67RNAi酶切驗(yàn)證及載體示意圖注:A圖為酶切驗(yàn)證圖,M.Mark;1.NcoI和AscI雙酶切;2.XbaI和BamHI雙酶切;3.未酶切對(duì)照。B圖為pAtLCR67RNAi載體示意圖。
2.2 擬南芥轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子檢測(cè)
將構(gòu)建好的pAtLCR67RNAi質(zhì)粒通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法轉(zhuǎn)化Col-0,收集T0代種子于營(yíng)養(yǎng)土中密集種植,噴施PPT進(jìn)行篩選,獲得8株抗性苗。用CTAB法提取1~8號(hào)抗性苗的DNA,以pLCR67RNAiF和Intron703R為引物進(jìn)行PCR檢測(cè)(圖2),結(jié)果顯示T1代1~8株抗性苗均為轉(zhuǎn)基因植株。
圖2 抗性苗PCR檢測(cè)結(jié)果注:M.Mark;1~8.陽性轉(zhuǎn)化子;+.陽性對(duì)照;—.陰性對(duì)照;WT.空白對(duì)照。
2.3 pAtLCR67RNAi干擾效果鑒定
用Trizol法提取T1代1,2,3號(hào)突變體和Col-0開花后10 d的果莢RNA,反轉(zhuǎn)出cDNA,通過qPCR比較AtLCR67在pAtLCR67RNAiT1代 1,2,3號(hào)植株與Col-0的表達(dá)情況,從而判定pAtLCR67RNAi載體的干擾效果。
結(jié)果顯示,1~3號(hào)轉(zhuǎn)化子中AtLCR67基因沒有表達(dá),而Col-0中有表達(dá)(圖3),說明pAtLCR67RNAi結(jié)構(gòu)對(duì)AtLCR67的干擾效果十分顯著。
圖3 pAtLCR67RNAi轉(zhuǎn)基因植株LCR67的表達(dá)
為了確定RNAi是否完全抑制了該基因的表達(dá),增加了qPCR實(shí)驗(yàn)(圖4)。結(jié)果表明pAtLCR67RNAi結(jié)構(gòu)在1號(hào),3號(hào)植株中使AtLCR67表達(dá)完全沉默。qPCR所用引物及序列如下:
q-ACTIN2-F:5′-CTTGCACCAAGCAGCATGAA-3′
q-ACTIN2-R:5′-CCGATCCAGACACTGTACTTCCTT-3′
q-LCR67F:5′-ATGGCTAAGTCTGCTACCATC-3′
q-LCR67R:5′-CACAACTTCTGTGCTTCCAC-3′
圖4 pAtLCR67RNAi 1,2,3號(hào)轉(zhuǎn)基因植株LCR67 qPCR結(jié)果
2.4 pAtLCR67RNAi轉(zhuǎn)基因植株與Col-0表型對(duì)比
觀察pAtLCR67RNAiT1轉(zhuǎn)基因植株與同時(shí)種植的Col-0表型差異,發(fā)現(xiàn)其開花時(shí)間比Col-0晚7~10 d(圖5A)。為了排除人為篩選環(huán)境的影響,故收取T1代1號(hào)植株種子,單株種在小缽中,經(jīng)過PCR檢測(cè)確定其為轉(zhuǎn)基因植株后(圖5B),與同時(shí)種植的Col-0對(duì)比觀察,發(fā)現(xiàn)AtLCR67RNAi-1 T2代植株也有晚花表型(圖5C)。
圖5 pAtLCR67RNAi轉(zhuǎn)基因植株表型觀察注:A圖為pAtLCR67RNAi T1代植株與Col-0表型對(duì)比。B圖為pAtLCR67RNAi-1 T2代植株P(guān)CR檢測(cè)電泳圖,圖中M為Mark;1~3,7~13為陽性轉(zhuǎn)化子;4~6為陰性轉(zhuǎn)化子;+為陽性對(duì)照;—為陰性對(duì)照;WT為空白對(duì)照。C圖為pAtLCR67RNAi-1 T2代植株與Col-0表型對(duì)比。
AtLCR67是擬南芥LCR家族的一員,由于AtLCR67特異在種子中表達(dá),推測(cè)AtLCR67很可能與擬南芥的胚胎發(fā)育或種子中儲(chǔ)藏物的合成代謝相關(guān)。進(jìn)一步驗(yàn)證AtLCR67的功能,必須有該基因表達(dá)沉默的材料,而AtLCR67沒有可用的T-DNA插入突變體資源,故本實(shí)驗(yàn)利用RNAi技術(shù),構(gòu)建了特異沉默AtLCR67的干擾載體。實(shí)驗(yàn)早期通過比對(duì),發(fā)現(xiàn)AtLCR67與AT2G26020、AT5G44420同源性較高,但這兩個(gè)基因均特異性在幼葉中表達(dá),而AtLCR67特異性在種子中表達(dá),且本干擾載體啟動(dòng)子為種子特異性表達(dá)基因Napin2啟動(dòng)子,故可以保證該干擾片段只沉默AtLCR67。干擾載體pAtLCR67RNAi構(gòu)建成功后浸花轉(zhuǎn)化擬南芥Col-0,經(jīng)過篩選及PCR檢測(cè)獲得8株轉(zhuǎn)基因植株。通過RT-PCR實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)pAtLCR67RNAi載體的干擾效果顯著,隨后通過qPCR進(jìn)一步證實(shí)在1號(hào)、3號(hào)轉(zhuǎn)基因植株中AtLCR67被完全沉默,說明1號(hào)與3號(hào)材料可以作為AtLCR67基因沉默材料,這為深入研究AtLCR67的功能做好了基礎(chǔ)材料的準(zhǔn)備。之后將對(duì)AtLCR67沉默突變體胚胎發(fā)育或種子中儲(chǔ)藏物的合成代謝進(jìn)行研究,以證實(shí)AtLCR67是否參與這些生物過程。另外,值得一提的是,在對(duì)pAtLCR67RNAi轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行表型觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)相對(duì)于Col-0有晚花表型。為了排除篩選環(huán)境造成的影響,對(duì)T1代種子直接種植,經(jīng)過PCR篩選出轉(zhuǎn)基因植株,再與同時(shí)種植的Col-0對(duì)比,晚花表型依然存在。AtLCR67表達(dá)降低后導(dǎo)致植株出現(xiàn)晚花的原因尚不清楚,可能是胚胎發(fā)育或種子中儲(chǔ)藏物的合成代謝變化導(dǎo)致,具體機(jī)理需后續(xù)研究。
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The RNAi Plasmid Construction ofAtLCR67 and Identification of Transgenic Plants
GUO Lei1,HU Jia1,XIAO Wen-juan2,LIU Chun-lin1*
(1 Hunan Provincial Key Laboratory for Crop Germplasm Innovation and Utilization,Hunan Agircultural University,Changsha,Hunan 410128,China;2 College of Bioscience and Biotechnology,Hunan Agircultural University,Changsha,Hunan 410128,China)
The processing of seed development is the most important stage for the whole life of plant growth,it depends on the synthesis and transformation of different kinds of metabolic controlled by corresponding genes.So study on the genes specifically expressed during seed developing stage is very important to understand the processing of seed development.AtLCR67 gene only expresses during the seed development stage was used as material,the RNAi expression box ofAtLCR67 gene was transferred toArabidopsisthalianagenome via construction of RNAi plasmid and agrobacterium-mediated transformations.Through resistance selection of PPT and PCR identification,eight transgenic plants were gained.The RT-PCR results of 3 plants selected from the transgenic plants showed that theAtLCR67 gene was silenced completely in 2 plants,and the expression level ofAtLCR67 gene was inhibited by about 70% in another one,which suggested the expression box ofAtLCR67 gene RNAi worked.By the way,the late-flowering phynotype of T2generation transgenic plants was found during the experiment.The two transgenic plants in whichAtLCR67 gene was silenced completely were the good materials for further research on function and action mechanism ofAtLCR67.
Arabidopsisthaliana;AtLCR67 gene;RNAi plasmid;genetic transformation;gene silence
2015-01-29
郭 磊(1989-),男,山西靈石人,碩士研究生,Email:guolei0418@126.com。
*通信作者:劉春林,博士,教授,Email:liucl@hunau.edu.cn。
國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31071455)。
Q78
A
1001-5280(2015)03-0221-05
10.3969/j.issn.1001-5280.2015.03.01