戚曉利，吳玉德，梁英輝，穆 丹，申 健，韓誠武，田 蕾，盧孟柱

(1.佳木斯大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 佳木斯154007；2. 中國林業(yè)科學(xué)研究院 林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗室，北京100091)

擬南芥Atlg52910突變體的鑒定與初步分析

戚曉利1,2，吳玉德1，梁英輝1，穆 丹1，申 健1，韓誠武1，田 蕾1，盧孟柱2

(1.佳木斯大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 佳木斯154007；2. 中國林業(yè)科學(xué)研究院 林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗室，北京100091)

在篩選與維管發(fā)育相關(guān)的擬南芥突變體過程中，發(fā)現(xiàn)擬南芥DUF1218家族At1g52910基因突變體的花器官明顯異常。通過基因型分析篩選到純合突變體，TAIL-PCR分析結(jié)果表明突變體為Ds單位點(diǎn)插入突變，突變體后代表型出現(xiàn)分離現(xiàn)象，暗示有其它突變位點(diǎn)存在。

擬南芥；Atlg52910；TAIL-PCR；花器官變異

擬南芥在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下也能形成類似“木材”的維管組織[1-3]，因而可以借助擬南芥豐富的基因資源研究木材形成的分子機(jī)制。課題組利用前期建立的毛白楊次生維管系統(tǒng)再生實(shí)驗體系，通過擬南芥表達(dá)譜芯片分析再生過程中的基因表達(dá)變化，獲得差異表達(dá)基因[4]。對差異表達(dá)基因的擬南芥突變體進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)一個屬于DUF1218基因家族Atlg52910的突變體出現(xiàn)了明顯的表型變化，主要表現(xiàn)為花器官變異。為了探明這些變異是否是因為外源基因插入引起的，對突變體的進(jìn)行純雜鑒定和遺傳分析，用TAIL-PCR方法擴(kuò)增出T-DNA插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列。

1 材料和方法

1.1 材料

擬南芥突變體ET139購自擬南芥突變體資源中心(The Nottingham Arabidopsis Stock Centre，NASC)；野生型擬南芥(ArabidopsisthalianaLandberg)種子由中國林業(yè)科學(xué)研究院林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥的基因組DNA提取

采用CTAB法[5]。

1.2.2 純合突變體的鑒定

采用三引物法。PCR所用引物出自SIAGnAL(http://signal.salk.Edu/isectprimers.html)，引物分別為：Ds3：5′-ACCCGACCGGATCGTATCGGT-3′；LP：5′-CGGTCACAAGTCTCTTGACATTTTCGTC-3′；RP：5′-CTTGTTCTGGATCTCACTACTCACTA-3′。PCR反應(yīng)條件：94 ℃，5min；(94 ℃，30 sec，56 ℃，30 sec；72 ℃，1min)35個循環(huán)；72 ℃，7 min，1.0%瓊脂糖膠電泳分析。

1.2.3 TAIL-PCR

利用TAIL-PCR從突變體DNA中擴(kuò)增插入位點(diǎn)的旁側(cè)序列，參考 Liu等報道的方法[6]。

1.2.4 測序及序列分析

PCR產(chǎn)物直接與pGEM-T Easy(Promega)克隆載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，每個樣品挑選2個陽性克隆送到上海生工生物工程有限公司測序。將測序后的基因序列與擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.arabidopsis.org/servlets/sv)比對。

2 結(jié)果和分析

2.1Atlg52910的突變體花器官的變異

擬南芥為十字花科植物，花器官構(gòu)造通常包含4輪，從外到內(nèi)依次為花萼、花瓣、雄蕊和心皮。Atlg52910突變體ET139變異主要表現(xiàn)為不同程度的花瓣缺失。根據(jù)花瓣缺失程度的大小，可以分為花瓣部分缺失和花瓣完全缺失(圖1)，同一植株發(fā)育后期個別花出現(xiàn)花瓣(圖1-c)。

圖1 突變體ET139花器官的變異

2.2 純合突變體的鑒定

利用擬南芥突變體庫提供的檢測方法(http://signal.salk.edu/tdnaprimers.html)，對Ds插入引起的突變進(jìn)行純雜合檢測。在插入位點(diǎn)兩端設(shè)計引物L(fēng)P和RP，二者組合能在野生背景下擴(kuò)增出1153bp片段，而RP與Ds上的Ds3引物組合能夠擴(kuò)增出637bp片段。分別提取突變體表型正常與異常葉片基因組DNA，進(jìn)行PCR分析，野生型只能擴(kuò)出1153bp片段，突變體只能擴(kuò)出637bp片段，表明突變體均為純合體(圖2)。

圖2 突變體PCR純雜檢測

2.3 突變體遺傳分析

突變純合體經(jīng)多代種植后突變表型穩(wěn)定出現(xiàn)，表明其表型具有遺傳基礎(chǔ)，非偶然現(xiàn)象。同一突變體后代表型出現(xiàn)分離現(xiàn)象，除出現(xiàn)突變表型外，有正常表型的植株出現(xiàn)，說明表型并非由Ds插入Atlg52910引起的。

2.4 TAIL-PCR

為了明確是否Ds有其它插入位點(diǎn)，采用引物組合從Ds3′端和5′分別進(jìn)行TAIL-PCR擴(kuò)增側(cè)翼序列，發(fā)現(xiàn)在Ds3-1(Ds5-1)/Ds3-2(Ds5-2)/Ds3-4(Ds5-4)和AD組合條件下可以獲得清晰的條帶，且第3輪擴(kuò)增產(chǎn)物比第2輪擴(kuò)增產(chǎn)物偏小，符合TAIL-PCR技術(shù)的原理(圖3)。將第3輪PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，回收目的條帶并克隆轉(zhuǎn)化測序。隨機(jī)引物選用了13種AD1～AD13，圖3中顯示Ds3′端引物與TAIL-PCR隨機(jī)引物AD1～AD8 PCR電泳結(jié)果。在陽性克隆測序后獲得了大小不同的側(cè)翼序列，其結(jié)果一致，檢測出的側(cè)翼序列均為Atlg52910，沒有發(fā)現(xiàn)其它插入位點(diǎn)。Ds插入其第二外顯子中(圖4)，與TAIR網(wǎng)站上公布結(jié)果相符。

圖3 TAIL-PCR結(jié)果的電泳分析

圖4 Ds插入Atlg52910位點(diǎn)的示意圖

Atlg52910由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成，Ds插入位點(diǎn)在第2外顯子處，下劃線代表Ds插入位點(diǎn)兩端11bp反向重復(fù)序列。

3 討 論

利用植物基因突變的方法研究植物基因的功能是認(rèn)識生命活動機(jī)理的一種有效途徑。植物基因突變后失去功能或功能發(fā)生改變，有可能使某些代謝途徑部分或完全發(fā)生變化，從而產(chǎn)生相應(yīng)的可見的表型變化，據(jù)此就可以推測出突變基因的功能，而突變基因的鑒定是研究突變體的首要任務(wù)。本課題組在突變體篩選過程中獲得一花器官異常Ds轉(zhuǎn)座突變體，純雜鑒定發(fā)現(xiàn)表型與基因型不一致，說明表型與Ds插入突變無關(guān)。通過TAIL-PCR克隆側(cè)翼序列，分析沒有發(fā)現(xiàn)其它的Ds插入位點(diǎn)。突變體多代種植后其突變表型穩(wěn)定出現(xiàn)，說明表型具有遺傳基礎(chǔ)，導(dǎo)致表型出現(xiàn)的遺傳因素尚需進(jìn)一步研究，可通過圖位克隆法獲析突變位點(diǎn)，該結(jié)果對于突變體后續(xù)變異研究有一定的意義。

[1] CHAFFEY N, CHOLEWA E, REGAN S，et al. Secondary xylem development in Arabidopsis a model for wood formation[J]. Physiologia Plantarum, 2002,114:594-600.

[2] KO J H, HAN K H, PARK S, et al. Plant body weight-induced secondary growth in Arabidopsis and its transcription phenotype revealed by whole-transcription profiling[J]. Plant Physiology,2004,135:1069-1083.

[3] LEV-YADUN S. Induction of sclereid differentiation in the pith of Arabidopsis thaliana (L.) Heynh[J]. Journal of Experimental Botany.1994,45:1845-1849.

[4] 楊海峰,王敏杰,趙樹堂,等.利用擬南芥基因芯片和突變體對木材形成相關(guān)基因的初步分析[J].林業(yè)科學(xué), 2011,47(12):36-42.

[5] DOYLE J J, DOYLE J L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue[J]. Phytochemical Bulletin, 1987, 19(1):11-15.

[6] LIU Y G, MITSUKAWA N, OOSUMI T, et al. Efficient isolation and mapping of Arabidopsis thaliana T-DNA insert junctions by thermal asymmetric interlaced PCR[J]. Plant Journal, 1995,8(3):457-463.

Identification and Preliminary Analysis of GeneAtlg52910 Mutants

Qi Xiaoli1,2, Wu Yude1, Liang Yinghui1, Mu Dan1, Shen Jian1, Han Chengwu1, Tian Lei1, Lu Mengzhu2

(1.College of Life Science, Jiamusi University, Jiamusi 154007, China；2.State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China)

In the screening associated with vascular development inArabidopsismutants (Atlg52910) process, a mutant of DUF1218 genes is obtained exhibiting floral aberrance. Homo-and heterozygosity identification was performed on mutants, and the results showed insertional mutant of theAtlg52910 gene is inconsistent with the mutant phenotype. The result of TAIL-PCR analysis did not find out the otherDsinsertion sites, which suggested there are other mutations existence.

Arabidopsisthaliana；Atlg52910；TAIL-PCR；floral aberrance

2015-04-18

佳木斯大學(xué)科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)項目(Sjz2012-19)；黑龍江省教育廳科學(xué)研究項目(12513091)；黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201410222040)。

戚曉利(1971—)，女(漢族)，副教授，博士。研究方向：分子生物學(xué)教學(xué)及科研。E-mail：qixiaoli3@tom.com

10.3969/j.issn.1006-9690.2015.06.005

Q78

A

1006-9690(2015)06-0018-02