王 丹，馬瑞麗，張 蓉，蘇兆亮，湯 建*，歐陽(yáng)臻

(江蘇大學(xué) 1.藥學(xué)院； 2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

虎刺提取物對(duì)CCl4致肝損傷的保護(hù)作用

王 丹1，馬瑞麗1，張 蓉1，蘇兆亮2，湯 建1*，歐陽(yáng)臻1

(江蘇大學(xué) 1.藥學(xué)院； 2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

目的：研究虎刺提取物對(duì)CCl4致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用及與所含蒽醌類(lèi)化合物之間的量效關(guān)系。方法：小鼠分為模型組，正常組，陽(yáng)性藥組(聯(lián)苯雙酯)，石油醚部位組、乙酸乙酯部位組、水部位組和75%乙醇提取物組。正常組小鼠每日灌胃(ig)生理鹽水10 mL·kg-1，陽(yáng)性對(duì)照組聯(lián)苯雙酯200 mg·kg-1，藥物組按300 mg·kg-1(高劑量組)、150 mg·kg-1(低劑量組)劑量給藥。連續(xù)給藥6天后小鼠按劑量10 mL·kg-1腹腔注射(ip)0.1 % CCl4花生油溶液，心臟取血，測(cè)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性，并取肝臟做組織切片觀察其病理學(xué)形態(tài)變化。采用高效液相(HPLC)法初步分析，采用醋酸-甲醇顯色法測(cè)定各樣品中總蒽醌的含量。結(jié)果：與模型組相比，虎刺水部位(300 mg·kg-1) 能明顯降低小鼠血清中ALT、AST的含量(p<0.01)，水部位(150 mg·kg-1) 和75%乙醇提取物(300 mg·kg-1) 也能降低ALT、AST的含量(p<0.05)。病理切片發(fā)現(xiàn)水部位和總提物能明顯減輕肝組織病理學(xué)癥狀。結(jié)論：虎刺提取物具有明顯的肝保護(hù)作用，其中水部位活性最強(qiáng)，保護(hù)活性可能與蒽醌化合物有關(guān)。

虎刺；CCl4致肝損傷；總蒽醌；HPLC

虎刺 (Damnacanthusindicus)，又名繡花針，小黃連，分布于長(zhǎng)江流域及以南地區(qū)，中醫(yī)上主要用于治療肝炎、風(fēng)濕痹痛、黃疸水腫等病癥[1-2]，同時(shí)也是瑤藥中具有代表性的藥材之一，用于治療肝炎、身體虛弱及小兒疳積等[3]。該植物中報(bào)道較多的是以大黃素為代表的蒽醌類(lèi)化合物[4-7]。

本實(shí)驗(yàn)研究虎刺75%乙醇提取物以及三種萃取部位的保肝活性，以及各部位中總蒽醌化合物的含量，以期發(fā)現(xiàn)虎刺中蒽醌類(lèi)化合物含量與保肝活性的關(guān)系，對(duì)虎刺的開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

虎刺藥材于2009年9月購(gòu)于亳州藥材市場(chǎng)(產(chǎn)地 湖南)，經(jīng)江蘇大學(xué)藥學(xué)院歐陽(yáng)臻教授鑒定為茜草科虎刺屬植物Damnacanthusindicus(Linn.) Gaertn. f.。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品和大黃素標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品鑒定所)；聯(lián)苯雙酯(國(guó)藥集團(tuán))；清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；CCl4(分析純)；甲醇(色譜純)和雙蒸水。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2102PCS型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司； LC-20A高效液相色譜儀，日本島津；精密電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；LOOYE ZX98-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海魯伊工貿(mào)有限公司；酶標(biāo)儀，MolecuLar Device公司。

2 方 法

2.1 樣品的制備

200 g虎刺藥材粉碎至10～20目，加至75%乙醇1 000 mL中，回流提取2 h×3，提取液合并、濃縮至無(wú)醇味 (約200 mL)，取其中20 mL濃縮液蒸除溶劑，得到3.0 g浸膏。其余部分分別用150 mL×3石油醚、乙酸乙酯萃取，蒸除溶劑后得石油醚部位0.3 g，乙酸乙酯部位2.6 g。剩余水部位上HP20大孔吸附樹(shù)脂，3 BV水洗除去無(wú)機(jī)鹽、黏液和寡糖等雜質(zhì)，再用3 BV 90%乙醇洗脫，收集該部位，蒸除溶劑、凍干得粉末4.0 g。樣品冷藏于-20℃冰箱中備用。

2.2 保肝活性測(cè)試

參照文獻(xiàn)[8-9]，88只ICR小鼠(20±2)g，雌雄各半，隨機(jī)分成 11組，每組8只，分別為模型組，正常對(duì)照組，聯(lián)苯雙酯組，石油醚部位高、低劑量組，乙酸乙酯部位高、低劑量組，水部位高、低劑量組和總提物高、低劑量組，ig給藥。模型組和正常對(duì)照組小鼠每日生理鹽水10 mL·kg-1，陽(yáng)性對(duì)照組每日聯(lián)苯雙酯200 mg·kg-1，其它藥物組按300 mg·kg-1(高劑量組)、150 mg·kg-1(低劑量組)劑量給藥。每日一次，連續(xù)6天。于末次給藥或生理鹽水后4 h，除正常組小鼠ip生理鹽水10 mL·kg-1外，其余六組小鼠分別ip 0.1 % CCl4花生油溶液10 mL·kg-1(0.2 mL/只)。禁食，自由飲水，18 h 后心臟取血，3500 r/min 離心10 min，取上清液，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，于450 nm下測(cè)定ALT，AST指標(biāo)。同時(shí)做肝臟病理組織學(xué)檢測(cè)，石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察肝臟病理組織學(xué)改變。

2.3 總蒽醌含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[10]制備標(biāo)準(zhǔn)品大黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：A=51.184C-0.0013 (R2=0.9999)，濃度0.1～2.0 μg·mL-1范圍內(nèi)線(xiàn)性良好。供試液(1 mg/mL, 甲醇)各1 mL于10 mL容量瓶中，加0.5% 醋酸鎂-甲醇溶液至刻度，搖勻。同時(shí)，以0.5%醋酸鎂-甲醇溶液為空白對(duì)照，在511 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算即得總蒽醌的含量。

2.4 樣品的HPLC分析

GraceSmart RP 18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫：25 ℃，流動(dòng)相A：雙蒸水，流動(dòng)相B：色譜甲醇，梯度洗脫 (0 min，25% B；25 min，60% B；35 min，100% B；45 min，100% B)，流速： 0.8 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm，進(jìn)樣量 20 μL。樣品 25 mg溶于25 mL容量瓶中，進(jìn)樣前 0.45 μm濾膜過(guò)濾。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié) 果

3.1 對(duì)血清ALT、AST活性的影響

如表1所示，虎刺水部位高劑量組(300 mg·kg-1)小鼠血清中ALT和AST值分別為(66.16±9.83)U·L-1和(35.21±5.15)U·L-1，顯著低于模型組小鼠血清中ALT、AST值(p<0.01)，接近陽(yáng)性對(duì)照藥。水部位低劑量組(150 mg·kg-1)小鼠血清中ALT和AST值分別為(71.14±8.21)U·L-1和(38.91±3.51)U·L-1，與模型組相比具有顯著差異(p<0.05)，抑制作用接近75% 乙醇提取物高劑量組(300 mg·kg-1)。

表1 虎刺提取物對(duì)小鼠血清ALT、AST的影響

注：與模型組比較*p<0.05，**p<0.01。

數(shù)據(jù)表明，虎刺水部位對(duì)CCl4所致小鼠急性肝損傷有較好的保護(hù)作用。75% 乙醇提取物對(duì)CCl4所致小鼠急性肝損傷也顯現(xiàn)出一定的保護(hù)作用。虎刺乙酸乙酯部位抑制小鼠血清中ALT、AST作用較弱，低劑量組(150 mg·kg-1)的ALT、AST值接近于模型組。而石油醚部位能明顯的升高小鼠血清中ALT、AST值，較模型組還高，說(shuō)明石油醚部位可能對(duì)肝臟有損傷作用。

3.2 組織病理學(xué)檢查

正常組小鼠肝小葉完整，肝索排列規(guī)則未見(jiàn)炎性細(xì)胞，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，細(xì)胞排列整齊，大小均勻，分界清楚，細(xì)胞核大而圓，核質(zhì)分布均勻，核仁清晰。模型組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝索結(jié)構(gòu)排列紊亂，肝竇明顯擴(kuò)張，血管附近有明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)疏松，呈氣球樣變性，表現(xiàn)為以中央靜脈為中心的局灶性肝細(xì)胞變性、壞死。而陽(yáng)性藥物組較模型組肝竇擴(kuò)張及炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)不明顯，肝細(xì)胞的胞質(zhì)均勻，氣球樣變性不常見(jiàn)。同時(shí)，水部位組肝小葉結(jié)構(gòu)基本完整，肝組織排列較整齊，腫脹、變性壞死程度明顯減輕，壞死灶區(qū)明顯減少；乙酸乙脂部位組(300 mg·kg-1)較模型組癥狀減輕，但仍可觀察到疏松胞質(zhì)，氣球樣病變的肝細(xì)胞。表明水部位和乙酸乙酯部位對(duì)CCl4致肝損傷小鼠具有保護(hù)作用，而水部位組藥效強(qiáng)于乙酸乙酯部位。需注意的是，石油醚部位(300 mg·kg-1)與模型組相比，小葉內(nèi)壞死廣泛，仍然嚴(yán)重，無(wú)明顯減輕，說(shuō)明石油醚部位組無(wú)保肝作用。150 mg·kg-1給藥組小鼠組織切片在病理學(xué)變化不明顯(圖片未列出)。

圖1 肝臟組織病理切片 (HE,×100)

3.3 各部位蒽醌成分的含量

四種樣品的總蒽醌含量見(jiàn)表2，剩余水部位中總蒽醌含量最高，為7.67 mg·g-1(相對(duì)于萃取物，下同)，75%乙醇提取物和乙酸乙酯部位中總蒽醌含量較低，分別為3.68 mg·g-1和3.25 mg·g-1。石油醚部位游離蒽醌的含量為6.69 mg·g-1。

表2 不同部位總蒽醌的含量

3.4 樣品的HPLC分析

四種樣品的HPLC圖見(jiàn)圖2?？芍兔?、乙酸乙酯和剩余水部位中，化合物分離和富集的效果較好，從HPLC圖可以看出，這三個(gè)部位重合的程度較低，并且較好的保留了75%乙醇提取物中的化學(xué)成分。

圖2 四種樣品高效液相色譜圖

4 討 論

本課題研究了虎刺75% 乙醇提取物以及石油醚、乙酸乙酯和剩余水部位的保肝活性以及與所含總蒽醌的量效關(guān)系。結(jié)果表明：水部位具有良好的保肝作用，能夠顯著的降低血清中ALT和AST的水平，而石油醚部位升高血清中ALT和AST的水平。由此可見(jiàn)，虎刺中的保肝活性成分主要集中在水部位。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，75%乙醇提取物、乙酸乙酯部位和剩余水部位的保肝活性與所含的總蒽醌呈正相關(guān)。但石油醚部位雖然含有較多的游離蒽醌，卻升高血清中ALT和AST的水平，表明石油醚部位可能含有損傷肝臟的物質(zhì)，這為虎刺的合理使用提供了依據(jù)。后續(xù)的工作中將對(duì)虎刺的剩余水部位做進(jìn)一步研究，確證保肝活性成分。同時(shí)研究石油醚部位，發(fā)現(xiàn)可能損傷肝臟的物質(zhì)基礎(chǔ)。

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Protective Effect from Different Extracts ofDamnacanthusindicusagainst CCl4-induced Liver Injury in Mice

Wang Dan1, Ma Ruili1, Zhang Rong1, Su Zhaoliang2, Tang Jian1*, Ouyang Zhen1

(1.School of Pharmacy； 2.School of Medical Science and Laboratory Medicine, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

Aim：To study the protective effect from different extracts ofDamnacanindicusagainst CCl4-induced acute liver injury in mice, as well as the relationship with the contents of total anthraquinones. Methods：Mice were divided into 11 groups. Mice in model and normal groups were administrated (ig) with saline at 10 mL·kg-1daily. Mice in positive group were administrated (ig) bifendate, 200 mg·kg-1. Tested groups were administrated (ig) at 300 mg·kg-1(high dose group) and 150 mg·kg-1(low dose group), respectively. After consecutive 6 days, the mice were administrated (ip) with CCl4solution in peanut oil at 10 mL·kg-1. The aspartate aminotransferase (ALT), alanine aminotransferase (AST) levels in cardiac blood serum were tested. The liver biopsy morphology was evaluated. Each sample was analyzed for determining the content of total anthraquinones and chemical profile. Results：Water-soluble fraction (300 mg·kg-1) could significantly deduced ALT, AST levels (p<0.01). Water-soluble fraction (150 mg·kg-1) and 75% ethanol extract (300 mg·kg-1) could lower ALT, AST levels to some degree (p<0.05). Water-soluble fraction and 75% ethanol extract could significantly reduce areas of necrosis of liver tissue. Conclusion：The water-soluble fraction had remarkable protective effects on liver injury, which could be associated with the contents of total anthraquinones.

Damnacanthusindicus; liver injury; total anthraquinones; HPLC

2015-05-12

江蘇省鎮(zhèn)江市社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目(SH2014062)；博士后基金(2012M521023)。

王丹，女，碩士研究生， 主要從事中藥化學(xué)成分及藥理活性研究。

*通訊作者：湯建，男，博士，副教授。E-mail：jt.u@hotmail.com

10.3969/j.issn.1006-9690.2015.06.006

R285

A

1006-9690(2015)06-0020-04