周希彬，黃一飛，吳志鴻，焦小杰

牛心包生物補(bǔ)片對(duì)后鞏膜加固區(qū)的生物力學(xué)特性及其作用機(jī)制

周希彬1，黃一飛2，吳志鴻1，焦小杰1

目的 應(yīng)用不同交聯(lián)程度的牛心包生物補(bǔ)片行后鞏膜加固術(shù)，觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物鞏膜加固區(qū)的力學(xué)特性，并進(jìn)一步探討后鞏膜加固術(shù)的作用機(jī)制。方法 健康成年純種新西蘭白兔48只，雌雄不拘。體重2.2～2.5 kg，隨機(jī)分為4組，每組12只。A組使用未交聯(lián)的牛心包生物補(bǔ)片；B 組使用中度交聯(lián)的牛心包生物補(bǔ)片；C組使用高度交聯(lián)的牛心包生物補(bǔ)片；D組使用人鞏膜組織。分別分為術(shù)后2、4、12、24周觀察期。手術(shù)前常規(guī)裂隙燈、間接檢眼鏡檢查，排除有眼部疾患的動(dòng)物。同期手術(shù),各組術(shù)眼為左眼。后鞏膜加固材料為長(zhǎng)條形，5 mm×20 mm，每眼植入1條。手術(shù)前后觀察外眼(結(jié)膜水腫、炎性反應(yīng))、前節(jié)、眼底情況。各組手術(shù)后2、4、12、24周取標(biāo)本，摘除眼球,洗凈血污,切取植片包括其附著的鞏膜。應(yīng)用BOSE ElectroForce動(dòng)態(tài)力學(xué)試驗(yàn)儀對(duì)各不同交聯(lián)度牛心包補(bǔ)片及各實(shí)驗(yàn)組鞏膜加固區(qū)進(jìn)行生物力學(xué)檢測(cè)。結(jié)果 隨植入時(shí)間的延長(zhǎng)，A、D組組織逐漸被降解吸收，至24周時(shí)已大部被吸收。B、C組組織無(wú)明顯降解。A、D組術(shù)后4、12周鞏膜加固區(qū)的彈性模量和剛度與術(shù)后2周相比明顯增大，剛度及強(qiáng)度則隨著術(shù)后時(shí)間延長(zhǎng)而下降。B、C組術(shù)后24周鞏膜加固區(qū)的彈性模量較其余各時(shí)間點(diǎn)減少，術(shù)后12周與24周組剛度明顯降低，尤其以術(shù)后24周組剛度最弱。術(shù)后24周 B、C組剛度及強(qiáng)度明顯高于A、D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 交聯(lián)后的牛心包機(jī)械強(qiáng)度大大提高，中、高度交聯(lián)的牛心包均可用于后鞏膜加固術(shù)，其遠(yuǎn)期效果優(yōu)于人鞏膜及未交聯(lián)的牛心包。

牛心包；交聯(lián)；生物力學(xué)；后鞏膜加固

病理性近視又稱變性近視，是以眼軸過(guò)度增長(zhǎng)造成眼底后極部損害為特征的高度近視[1]。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，后鞏膜加固術(shù)是目前治療病理性近視的唯一有效方法[2，3]。本研究制備不同交聯(lián)程度的牛心包，與人鞏膜組織對(duì)照，分析其生物力學(xué)特性，期望為臨床提供來(lái)源豐富、安全可靠的后鞏膜加固材料，以促進(jìn)病理性近視手術(shù)治療的開(kāi)展。

1 材料與方法

1.1 后鞏膜加固材料 (1)制備不同交聯(lián)度的牛心包。將新鮮牛心包除盡脂肪組織，用無(wú)菌生理鹽水于冰浴中反復(fù)沖凈血污、漂洗。Triton-X-100/PBS溶液脫細(xì)胞處理后，分別以0.625%及0.25%戊二醛對(duì)其進(jìn)行交聯(lián)處理得到高強(qiáng)度及中等強(qiáng)度組交聯(lián)牛心包；僅做脫細(xì)胞處理的牛心包材料作為未交聯(lián)牛心包，制備后的牛心包雙層密閉塑料袋無(wú)菌包裝，γ射線滅菌后備用。(2)95%乙醇保存的新鮮人異體鞏膜組織(由301醫(yī)院眼科提供)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康成年純種新西蘭白兔48只，雌雄不拘,體重2.2～2.5 kg(動(dòng)物均由解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。隨機(jī)分為4組，每組12只。A 組使用未交聯(lián)的牛心包生物補(bǔ)片；B 組使用中度交聯(lián)的牛心包生物補(bǔ)片；C組使用高度交聯(lián)的牛心包生物補(bǔ)片；D組使用人鞏膜組織。均取左眼為手術(shù)眼。

1.3 手術(shù)方法 術(shù)前將保存的牛心包組織置于500 ml生理鹽水中浸泡5 min，沖洗3遍；人鞏膜組織于生理鹽水中浸泡復(fù)水。將后鞏膜加固材料裁剪為長(zhǎng)條形，5 mm×20 mm，每眼植入一條。氯胺酮50 mg/kg加地西泮10 mg/kg肌內(nèi)注射麻醉，愛(ài)爾卡因眼液表面麻醉。常規(guī)消毒、鋪無(wú)菌巾。開(kāi)瞼器開(kāi)瞼。自鼻側(cè)經(jīng)下方至顳側(cè)角膜緣打開(kāi)結(jié)膜,在鞏膜表面用鞏膜分離器鈍性分離至后部，暴露內(nèi)、外直肌及下斜肌，并分離之，勾取并分離下斜肌，將加固條帶從下斜肌腹下穿過(guò)外直肌及下直肌, 拉緊縫合固定于鞏膜表面。結(jié)膜傷口縫合,結(jié)膜囊內(nèi)涂妥布霉素地塞米松眼膏。

1.4 觀察指標(biāo)及方法 手術(shù)后左氧氟沙星滴眼液滴眼，4次/d，持續(xù)7 d。手術(shù)后7 d內(nèi)每天觀察結(jié)膜傷口愈合情況，有無(wú)結(jié)膜水腫、炎性反應(yīng)，植入物有無(wú)排異蝕出，瞳孔大小及用間接檢眼鏡檢查眼底視神經(jīng)是否損傷等。7 d后改為每7 d檢查1 次，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。 各組分別于手術(shù)后2、4、12、24 周，靜脈氯胺酮50 mg/kg加地西泮10 mg/kg肌肉注射麻醉，開(kāi)瞼器開(kāi)瞼，沿角膜緣360°剪開(kāi)球結(jié)膜并向后分離，同時(shí)分離眼球筋膜，取兔眼標(biāo)本。取材后過(guò)量注射地西泮處死動(dòng)物。取加固植片及手術(shù)后兔鞏膜行厚度及力學(xué)性能測(cè)試。用皮革測(cè)厚儀(PS83,蘇州電子儀器公司)測(cè)定加固植片及手術(shù)后兔鞏膜各3個(gè)試條，在每個(gè)試條的固定兩點(diǎn)測(cè)定厚度，取平均值作為該試條的厚度。應(yīng)用BOSE ElectroForce動(dòng)態(tài)力學(xué)試驗(yàn)儀(S4800，美國(guó)Bose corporatron公司)對(duì)試條行極限抗拉強(qiáng)度試驗(yàn)，所有試件均直接于常溫室內(nèi)進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試條件如下：試樣速度10 mm/min ，臨界載荷5 N。試樣標(biāo)距10～18 mm ，試件寬度均為2.5 mm。試件拉斷后，實(shí)驗(yàn)結(jié)束。采用Excel進(jìn)行求解，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合整理后繪制載荷-位移曲線，確定載荷位移曲線中的線性部分。用slope函數(shù)確定剛度,用max函數(shù)確定斷裂強(qiáng)度(圖1)。設(shè)條帶試件被實(shí)驗(yàn)部分長(zhǎng)度為L(zhǎng)，寬度記為W，厚度記為T，則橫截面面積S=T×W；剛度為線性階段的斜率：K(N/mm)=載荷增量/試件變形量；試件材料線性階段的彈性模量(E):彈性模量(MPa)=剛度×試件長(zhǎng)度/橫截面積，即E=KL/S。斷裂強(qiáng)度(Nmax)為試件被拉斷時(shí)的最大拉力。

圖1 鞏膜加固區(qū)試件BOSE ElectroForce動(dòng)態(tài)力學(xué)試驗(yàn)儀載荷-位移曲線

AB段基本呈線性關(guān)系，隨后材料發(fā)生屈服，C點(diǎn)載荷達(dá)到最大，此點(diǎn)即為試件被拉斷時(shí)的最大拉力即斷裂強(qiáng)度(Nmax)

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.5醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件中的單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床及大體形態(tài)觀察 術(shù)眼術(shù)后有輕微的結(jié)膜充血、水腫。術(shù)后2周術(shù)眼結(jié)膜充血、水腫完全消退，外觀與正常眼無(wú)明顯差別。觀察期內(nèi)未見(jiàn)分泌物增多，無(wú)植入物蝕出，未見(jiàn)炎性肉芽腫，眼底檢查未見(jiàn)視網(wǎng)膜出血、水腫，視神經(jīng)無(wú)水腫、萎縮。動(dòng)物進(jìn)食及活動(dòng)無(wú)異常。

術(shù)后第2周各組植片貼附欠平整，部分與鞏膜間有間隙，易與之分離。各組植片質(zhì)軟、邊緣整齊，與新鮮組織類似，色澤無(wú)明顯變化。術(shù)后第4周各組植片貼附平整，易與鞏膜分離。A 組植片質(zhì)軟、疏松，邊緣欠整齊，植片表面與筋膜粘連，易分離；D組植片質(zhì)軟、邊緣整齊；B、C組牛心包植片色澤無(wú)明顯變化，植片質(zhì)軟，邊緣整齊。術(shù)后第12周 A、D 組植片明顯變薄，肉眼能分辨植入物形態(tài)，植片質(zhì)軟、色澤與鞏膜相似，植片與鞏膜融合嚴(yán)密，分離困難。B、C組植入的牛心包植片無(wú)變薄，植片已經(jīng)鈣化變硬，色黃，與鞏膜嚴(yán)密附著分離困難。各組植片平復(fù)整齊無(wú)變形。術(shù)后第24周 A、D 組肉眼不能分辨植入物形態(tài)，植片大部分已經(jīng)降解吸收，僅殘留有部分組織，附著于鞏膜表面，或與筋膜組織粘連。B、C組植入的牛心包植片與鞏膜嚴(yán)密附著不能分離和移動(dòng)，植片質(zhì)硬、色黃，肉眼仍能分辨清晰，植片平復(fù)整齊無(wú)變形。

2.2 加固區(qū)鞏膜生物力學(xué)測(cè)試結(jié)果 各組不同時(shí)間點(diǎn)各種試件的彈性模量、斷裂強(qiáng)度及剛度見(jiàn)表1～3。

由表1可見(jiàn)，B、C組術(shù)后24周鞏膜加固區(qū)的彈性模量較其余各時(shí)間點(diǎn)減少。術(shù)后2周及24周各組之間彈性模量相近，但B、C組明顯高于A、D組。由表2可見(jiàn)，A、D組強(qiáng)度隨著術(shù)后時(shí)間延長(zhǎng)而下降，術(shù)后4周、12周及24周B、C組斷裂強(qiáng)度明顯高于A、D組。由表3可見(jiàn)，B、C組術(shù)后12周、24周組剛度明顯降低，尤其以術(shù)后24周組測(cè)得的剛度最弱，但術(shù)后2周、4周及24周B、C組斷裂強(qiáng)度明顯高于A、D組。

表1 不同材料組后鞏膜加固術(shù)后2～24周鞏膜加固區(qū)彈性模量比較 (n= 3；MPa； ±s)

注:A組使用未交聯(lián)的牛心包生物補(bǔ)片；B組使用中度交聯(lián)的牛心包生物補(bǔ)片；C組使用高度交聯(lián)的牛心包生物補(bǔ)片；D組使用人鞏膜組織。與本組2周相比較，①P<0.05；與本組其余各時(shí)間點(diǎn)比較，②P<0.05；與本組2周、4周比較，③P<0.05；術(shù)后2周B、C組與A、D組相比較，④P<0.05

表2 不同材料組后鞏膜加固術(shù)后2～24周鞏膜加固區(qū)斷裂強(qiáng)度比較 (n= 3；N；±s)

注:A組使用未交聯(lián)的牛心包生物補(bǔ)片；B 組使用中度交聯(lián)的牛心包生物補(bǔ)片；C組使用高度交聯(lián)的牛心包生物補(bǔ)片；D組使用人鞏膜組織。與本組其余時(shí)間點(diǎn)相比較，①P<0.05； B組術(shù)后2周、4周相比較，②P<0.05； C組術(shù)后2周與4周、12周之間相比較，③P<0.05；與本組其余時(shí)間點(diǎn)相比較，④P<0.05；術(shù)后4周、12周、24周B、C組與A、D組相比較，⑤P<0.05

表3 不同材料組后鞏膜加固術(shù)后2～24周鞏膜加固區(qū)剛度比較 (n= 3；N/mm ；±s)

注:A 組使用未交聯(lián)的牛心包生物補(bǔ)片；B 組使用中度交聯(lián)的牛心包生物補(bǔ)片；C組使用高度交聯(lián)的牛心包生物補(bǔ)片；D組使用人鞏膜組織。①與本組其余時(shí)間點(diǎn)相比較P<0.05；②與本組其余時(shí)間點(diǎn)相比較P<0.05，二者相比較P<0.05；③術(shù)后2周、4周、24周B、C組與A、D組相比較P<0.05；④術(shù)后12周，A、C組相比較P<0.05

3 討 論

牛心包生物補(bǔ)片生物耐受性良好，無(wú)明顯毒性，作為異種生物材料是安全的[4-7]。

本研究應(yīng)用不同交聯(lián)程度的牛心包生物補(bǔ)片行后鞏膜加固術(shù)，并與臨床上最常采用的人鞏膜組織對(duì)照，觀察其降解及生物力學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)術(shù)后第24周人鞏膜與未交聯(lián)的牛心包植片大部分已經(jīng)降解吸收，僅殘留有部分組織，附著于鞏膜表面，或與筋膜組織粘連。說(shuō)明人鞏膜與未交聯(lián)的牛心包植入宿主體內(nèi)后，易被降解吸收，本研究未觀察到其與宿主鞏膜融合。此結(jié)果或可解釋，臨床上之所以出現(xiàn)后鞏膜加固術(shù)后遠(yuǎn)期效果不滿意，概因植片降解所致。因而人鞏膜與未交聯(lián)的牛心包早期植片組織內(nèi)部雖有新生血管長(zhǎng)入，能促進(jìn)局部血液循環(huán)，改善局部脈絡(luò)膜營(yíng)養(yǎng)，但遠(yuǎn)期因降解而起不到鞏膜加固作用。本研究亦發(fā)現(xiàn)，用人鞏膜及未交聯(lián)的牛心包行后鞏膜加固術(shù)，抵抗拉伸變形的能力隨術(shù)后時(shí)間延長(zhǎng)減弱，術(shù)后24周則均恢復(fù)至術(shù)前水平。說(shuō)明隨著組織的降解吸收其生物力學(xué)方面顯示加固作用亦隨之消減，證明人鞏膜及未交聯(lián)的牛心包并非滿意的后鞏膜加固材料。

本研究發(fā)現(xiàn)，中、高度交聯(lián)的牛心包組織彈性模量、斷裂強(qiáng)度及剛度明顯高于其他材料，尤以高度交聯(lián)的牛心包組織為最高。說(shuō)明經(jīng)交聯(lián)后的牛心包抵抗拉伸變形的能力及強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，且隨交聯(lián)度增加而增高。未經(jīng)交聯(lián)的牛心包組織抵抗拉伸變形的能力與兔鞏膜組織及人鞏膜組織相近。已知的研究表明牛心包的強(qiáng)度與其膠原纖維的構(gòu)架是直接相關(guān)的，并且由于膠原纖維排列走向的多樣性，導(dǎo)致牛心包的強(qiáng)度具有各向異性[8]，交聯(lián)后膠原纖維排列更加致密，強(qiáng)度增加。牛心包經(jīng)交聯(lián)后，膠原纖維排列構(gòu)架更加致密有序，這是其機(jī)械強(qiáng)度增加組織學(xué)基礎(chǔ)。

未交聯(lián)的牛心包應(yīng)用于后鞏膜加固術(shù)，術(shù)后4周、12周組鞏膜加固區(qū)的彈性模量和剛度與術(shù)后2周組相比明顯增大，剛度及強(qiáng)度隨著術(shù)后時(shí)間延長(zhǎng)而下降，說(shuō)明在術(shù)后抵抗拉伸變形的能力隨術(shù)后時(shí)間延長(zhǎng)減弱，這與材料的降解有關(guān)。而應(yīng)用中、高度交聯(lián)的牛心包行后鞏膜加固術(shù)，術(shù)后24周組鞏膜加固區(qū)的彈性模量較其余各組減少，術(shù)后12周與24周組剛度明顯降低，尤其以術(shù)后24周組剛度最弱。而中、高度交聯(lián)的牛心包在術(shù)后第24周牛心包植片組織無(wú)明顯降解，與鞏膜嚴(yán)密附著不能分離和移動(dòng)，生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用中、高度交聯(lián)的牛心包行后鞏膜加固術(shù)后鞏膜加固區(qū)在術(shù)后24周抵抗拉伸變形的能力及強(qiáng)度仍然明顯增強(qiáng)，說(shuō)明植片能起到對(duì)抗拉伸變形的作用，應(yīng)用于后鞏膜加固術(shù)是可行的。

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(2014-11-19收稿 2015-01-20修回)

(責(zé)任編輯 梁秋野)

Biomechanical properties of bovine pericardium in posterior sclera reinforcement operation

ZHOU Xibin1, HUANG Yifei2， WU Zhihong1, and JIAO Xiaojie1.

1.Department of Ophthalmology, General Hospital of Armed Police Forces，Beijing 100039, China;2. Department of Ophthalmology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

Objective To evaluate the biomechanical properties of bovine pericardium (BP) after posterior sclera reinforcement operation (PSR)，and to investigate the mechanism of PSR further in the experimental animal and to provide reference for further clinical test and application. Methods Forty-eight New Zealand albino rabbits, weighing 2.2 to 2.5 kg, underwent posterior sclera reinforcement operation of the left eye. All eyes were examined preoperatively by slit lamp biomicroscopy and indirect ophthalmoscopy, and only healthy eyes were included in the experiment. Animals were randomized into 4 groups. For each group, one type of material was surgically implanted at the back of the globe. Group A: uncrosslinked BP(UBP) group, 12 rabbits; group B: moderate crosslinked BP MBP group, 12 rabbits. Group C: high crosslinked BP HBP group, 12 rabbits. Group D: human sclera group, 12 rabbits. The eyes were enucleated at the 2nd, 4th, 12th and 24th week after surgery respectively. The mechanic properties of four groups were evaluated by the BOSS ElectroForce BioDynamic test instruments. Results The patches in group A and D degraded with time and degraded mostly at the time of 24th week after surgery. The patches were intact in group B and C. Statistically significant difference in modulus of elasticity of implanted area of sclera samples was noticed between the time of 4th, 12th week and 2nd week after surgery in group A and D, and the stiffness and breaking strength decreased with time. The modulus of elasticity of implanted area of sclera in group B and C decreased at the 24th week after surgery, the stiffness decreased at the 12th and 24th week after surgery, especially at the time of 24th week. Statistically significant difference in stiffness and breaking strength was noticed between groups A, D and groups B, C at the time of 24th week after surgery. Conclusions The study revealed that MBP and HBP effectively enhances the anti-deformation capacity of the posterior sclera in rabbits and surpasses the BP without crosslink and human sclera . The MBP and HBP may add to our repertoire in preventing the development of progressive myopia.

Bovine pericardium; crosslink; Rabbits; Biomechanics; Scleroplasty

周希彬，博士，主治醫(yī)師，E-mail:xibinzhou@163.com

1.100039 北京，武警總醫(yī)院眼科；2.100853 北京，解放軍總醫(yī)院眼科

黃一飛，E-mail: 301yk@sina.com

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