孫金豪梁坤倫王海鶴

（1.黃河科技學院，河南 鄭州 450000；2.鄭州大學第一附屬中學，河南 鄭州 450000）

信陽水牛促生長激素釋放激素基因第4外顯子的PCR擴增及變異檢測

孫金豪1梁坤倫1王海鶴2

（1.黃河科技學院，河南 鄭州 450000；2.鄭州大學第一附屬中學，河南 鄭州 450000）

本研究以52頭中國信陽水牛血樣為材料，提取基因組DNA，采用聚合酶鏈反應-單鏈構象多態(tài)性技術（PCR-SSCP），對信陽水牛的生長素釋放激素（GHRH）基因中第4外顯子的突變情況進行檢測。經SSCP檢測發(fā)現，不同個體的PCR反應產物銀染后有兩種不同的帶型，分別命名為AA型和AB型。針對不同帶型所對應的個體PCR產物進行測序，結果表明，在該基因（GI:194719389）的第4外顯子70bp處發(fā)現A→G突變，A→G導致Thr轉化為Ala，在該基因的第4內含子6bp處發(fā)現A→C突變。

信陽水牛；GHRH基因；SNP；DNA提??；PCR-SSCP

信陽水牛為我國河南省的沼澤型水牛。曾經，信陽水牛是農業(yè)生產的主要動力，兼具肉用價值。隨著農業(yè)機械化的普及，信陽水牛的數量驟然下降。

國際水牛聯合會于第六屆世界水牛聯合會議中指出新世紀水牛的發(fā)展應秉持“奶用為主，肉用為輔”的原則，會議認為水奶牛業(yè)將會成為一項新產業(yè)［1］。對家畜在常規(guī)育種的基礎上進一步進行分子水平的選育，可以加速遺傳進展。通過用分子育種的方法，篩選與信陽水牛產奶產肉性狀密切相關的基因，挖掘其影響信陽水牛乳肉性能的分子生物學機制是當前信陽水牛育種亟須解決的問題。

正常情況下，生長激素釋放激素（growth hormone releasing hormone，GHRH）是在已知的促進生長激素（growth hormone，GH）的分泌過程中最為重要的一種激素。GHRH作為GH的正調控因子，促進GH的合成和分泌，通過GH間接的影響動物的生長速度和乳腺蛋白質的合成［2］。有研究表明，GHRH基因位于牛的13號染色體上，其全基因序列長度為9356bp，并且該基因有5個外顯子和4個內含子組成。Hodate等報道，給奶牛注射GHRH14天后，實驗組比對組產奶量高11%~19%。給牛注射GHRH類似物，可提高血清中GH和IGF-I的濃度，連續(xù)注射24天，產奶量增加30%。Hyun Sub Cheng等人在對朝鮮肉牛的基因進行研究時，發(fā)現了其GHRH基因5'端區(qū)存在一個單核苷酸的多態(tài)性（SNP），該SNP對朝鮮肉牛的產肉性能及肉質性狀造成了一定的影響。但是在對信陽水牛進行研究的過程中，并沒有形成關于GHRH基因影響水牛產肉性能的相關報道。本研究應用PCR-SSCP結合測序技術，對信陽水牛GHRH基因的第4外顯子的突變情況以及其產肉的性能、性狀存在的關聯性進行檢測分析，以推動信陽水牛乳肉產業(yè)的科學快速發(fā)展。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 采集來自信陽光山牛場的52頭信陽水牛血液樣本，采血方式為靜脈采血，為保證結果的準確性，所使用的血液樣本均不存在親緣關系。以-20℃的溫度保存檸檬酸鈉抗凝（ACD）方便備用。

1.1.2 主要試劑 Platinum Tap DNA聚合酶，貨號C10966-018，選購自杭州沃森生物技術有限公司；2× Reaction Mix，選購自天根生化科技（北京）有限公司；PCR Marker DL2000，北京三博遠志生物技術有限責任公司；Tris飽和酚、蛋白酶K、丙烯酰胺、二甲基甲酰胺等其他試劑均選購自上海欣百諾生物科技有限公司。

1.1.3 儀器設備 實時熒光定量PCR儀（型號：TL988-Ⅰ型，48孔）；電泳儀（型號：6C）；水平電泳槽（型號：JY-SPBT）；垂直板電泳槽（型號：DYC-350L）；凝膠成像系統（型號ZF-258型）；高速離心機（型號：Mini Spin）；移液槍（型號：Finnpipette）。

1.2 方法

1.2.1 常用試劑及緩沖液的配制 所有溶液和緩沖液均采用蒸餾水配置并高壓滅菌。①8%聚丙烯酰胺（PAGE）凝膠（兩板膠）：40%丙烯酰胺貯液10mL，10× TBE 10mL，10%過硫酸胺500μL，TEMED 50μL，加雙蒸水至50mL，輕輕搖晃使其混勻；②顯色液（2%NaOH）：取無水NaOH 10g，加入到500mL蒸餾水中，使其溶解，用時加入37%甲醛1mL，現配現用；其他試劑和溶液的配制均參照相關文獻的方法進行。

1.2.2 全血基因組DNA提取 用酚氯仿抽提法，從冷凍血樣中提取基因組DNA，溶于TE中，4℃保存。

1.2.3 引物設計 根據牛GHRH基因DNA序列，引用Primer5.0生物軟件設計引物表（引物序列由河南中大生物工程有限公司合成）

1.2.4 PCR擴增 PCR擴增總體積為15μL，其中2× Reaction Mix為7.5μL、Platinum Tap DNA聚合酶為0.15 μL、上游引物GHRH 4S為0.2μL、下游引物GHRH 4A為0.2μL、無菌水為5.95μL、DNA模板為1μL。

1.2.5 PCR產物電泳檢測 將5μLPCR產物與1μL緩沖液均勻混合，點樣于濃度為1.5%瓊脂糖（0.21g瓊脂糖，14mL 0.5×TBE緩沖液）在膠孔中進行凝固，電壓= 50V，電泳=50min，進行溴化乙錠染色，在紫外燈下觀察結果，利用凝膠成像系統拍照，保存結果。

1.2.6 聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳 SSCP具體操作步驟參照相關文獻的方法進行。

1.2.7 分析圖像 用凝膠成像分析系統進行照相分析。用EB對瓊脂糖凝膠進行染色，用紫外線照相。用AgNO3/NaOH對聚丙烯酰胺進行染色和顯色，用白光照相。

1.2.8 DNA序列測定 經SSCP分析后，將不同基因型個體的PCR擴增產物和對應的上、下游引物送交至河南中大生物工程有限公司進行后續(xù)工作。

2 結果

2.1 信陽水牛GHRH基因第4外顯子區(qū)的PCR凝膠電泳檢測

信陽水牛GHRH基因第4外顯子區(qū)的PCR凝膠電泳檢測結果，見圖1。

所合成的引物擴增基因組，用濃度為1.5%的瓊脂糖對其產物進行檢測，將擴增片段擴增至331bp，保持條帶清晰且特異性良好，無引物帶和雜帶可直接用于SSCP分析。

2.3 信陽水牛GHRH基因的第4外顯子區(qū)PAGE凝膠電泳檢測

信陽水牛GHRH基因的第4外顯子區(qū)PAGE凝膠電泳檢測結果，見圖2。

根據電泳圖發(fā)現了2種基因型，一種為純合子（AA型），一種為雜合子（AB型），并未發(fā)現BB型。

2.3 信陽水牛GHRH基因的第4外顯子區(qū)PCR產物的測序結果

信陽水牛GHRH基因的第4外顯子區(qū)PCR產物的測序結果（見圖3、4），由圖3、4可知，AB型在GHRH基因的7066位點（第4外顯子區(qū)）發(fā)現A→G突變，導致Thr轉化為Ala（見圖5）；在該基因的7122位點（第4內含子區(qū)）發(fā)現A→C突變。

3 討論與結論

生長激素釋放激素（GHRH）是經由下丘腦分泌得到的一種多肽物質，它是一種生長激素正性調控因子，具有促進垂體合成以及分泌生長激素的作用。研究表明，注射GHRH可顯著改善動物生長速度和肉質情況。

有研究表明，直接測序法在Hanwoo牛的GHRH基因中發(fā)現了12個SNP，并發(fā)現了-4241>T、CW（cold carcass weight）和EMA（longissimus muscle area）有明顯的關聯性，-4241>T的遺傳效應為基因劑量依賴。Moody等人的研究結果表明，牛GHRH基因的外顯子3存在一個GHRH-HaeⅢ多態(tài)位點。而且，赫福特牛和安格斯牛的A等位基因頻率分別為0.07和0.70。但在本次研究中，僅在信陽水牛群體中發(fā)現了AA、AB兩種類型的個體。

通過對荷斯坦牛進行研究，發(fā)現AA個體的乳脂產量較高；而Girolando奶牛的AB型個體泌乳期則明顯高于BB型個體。Curi等人進行的肉牛GHRH外顯子3HaeⅢ多態(tài)與生長和屠宰性狀相關性分析中，未發(fā)現其存在明顯相關性?，F有研究結果表明GHRH基因是在動物生長發(fā)育和泌乳過程中一項重要的候選基因。在本研究中，發(fā)現信陽水牛GHRH外顯子4和內含子4內存在部分突變，通過性狀關聯分析將發(fā)現該突變是否影響信陽水牛的乳肉性能。本研究的PCR擴增產物只包含部分內含子，有可能在未擴增到的內含子里仍然存在部分突變位點，這些突變有可能也影響信陽水牛的乳肉性能，有待進一步研究。

［1］王雷，丁春華，欒爽艷.我國水牛奶業(yè)的發(fā)展現狀與開發(fā)前景［J］.中國奶牛，2008（4）：8-10.

［2］李芳芳.廣西巴馬小型豬促生長激素釋放激素成熟肽基因克隆及其真核表達質粒對小鼠生長效應的研究［D］.廣西大學，2007.

PCR Am plification and M utation Detection of GHRH Gene Based on 4th Exon Sequences for Xinyang Buffalo

Sun Jinhao1Liang Kunlun1Wang Haihe2
（1.Huanghe Scienceand Technology College,Zhengzhou Henan 4500003;2.No.1Middle School Affiliated to Zhengzhou University,Zhengzhou Henan 450000）

This study was aimed to detect SNPs of GHRH gene on 4th Exon Sequences gene in 52 blood samples from Xinyang buffalo,using themethod of PCR-SSCP to extract DNA.The results from PCR-SSCP showed that there were two different band type in different after PCR reaction products silver staining of different individuals,named as AA and AB types respectively.The results from sequencing showed that A→G mutation which caused Thr trans?ferred to Ala at70 in exon4 of the gene（GI:194719389）and A→Cmutation at6 in intron4 were detected.

Xinyang buffalo;GHRH gene;SNP;DNA extraction;PCR-SSCP

S823

A

1003-5168（2015）06-0114-3

2015-5-20

孫金豪（1986.4-），男，本科，助教，研究方向：生物化學。