張 雯 張乃生

(1.東北林業(yè)大學野生動物資源學院動物醫(yī)學系，哈爾濱 150040;2.吉林大學動物醫(yī)學學院，長春 130062)

奶牛乳腺炎是乳腺組織炎癥的統(tǒng)稱，以乳腺組織中性粒細胞和巨噬細胞大量聚集、吞噬和消除病原微生物，乳腺組織炎癥性因子表達上調(diào)為基本特征，特別是在圍產(chǎn)期和泌乳早期乳腺炎發(fā)病率較高，嚴重影響乳腺健康、產(chǎn)乳量和牛乳品質(zhì)。硒(Se)是重要的食源性微量元素，以硒蛋白的形式存在于機體中。試驗和臨床數(shù)據(jù)表明，硒對奶牛乳腺炎的防治具有積極作用。在炎癥反應(yīng)中，核因子 κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)和促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)信號轉(zhuǎn)導增強，硒通過調(diào)節(jié) NF-κB和MAPK等信號轉(zhuǎn)導途徑，調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)基因的表達和促進重建免疫穩(wěn)態(tài)而使機體恢復健康［1］。因此，更好地了解飼糧硒水平與奶牛乳腺炎的關(guān)系以及硒在炎癥調(diào)控中的作用機制，對于改善奶牛乳腺健康具有重要的生產(chǎn)意義。

1 硒在動物體內(nèi)的存在和功能

硒作為機體必需微量元素，以硒代半胱氨酸(selenocysteine，Secys)的形式存在于硒蛋白(selenoproteins，SePs)中，作為其活性中心發(fā)揮作用，它的生物學功能主要是抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和參與新陳代謝。Secys由傳統(tǒng)終止密碼子UGA編碼，與位于3'－非翻譯區(qū)(UTR)的硒代半胱氨酸插入序列(Secys-insertion sequence，SECIS)共翻譯［2］。谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPX)是被發(fā)現(xiàn)的第1個硒蛋白，隨著進一步的研究發(fā)現(xiàn)，硒作為主要的抗氧化元素存在于多種具有催化氧化還原反應(yīng)的蛋白酶中［3］。推測動物體內(nèi)含有硒蛋白30～50種，包括GPX，硫氧還蛋白還原酶(TRxR)，硒蛋白 P、W、T、V、H、M、K、S等多種類型的硒蛋白。

2 飼糧硒水平和奶牛乳腺炎的關(guān)系

反芻動物嚴重缺硒可導致營養(yǎng)性肌病，又稱白肌病(white muscle disease，WMD)。臨界水平的硒缺乏在成年奶牛中常見，長期處于臨界水平的缺硒，增加了奶牛罹患乳腺炎和子宮內(nèi)膜炎的風險［4］。1984年，Smith首次研究了硒和維生素E對臨床型奶牛乳腺炎的影響，80頭奶牛隨機分成4組飼喂添加硒或維生素E的飼糧，結(jié)果表明，添加維生素E組顯著降低臨床型奶牛乳腺炎的發(fā)病率，可降低37%，而單獨加硒組不能降低臨床型乳腺炎的發(fā)病率，但可使臨床癥狀減輕46%，合用組則減輕70%，據(jù)推測硒缺乏與奶牛乳腺炎的持續(xù)發(fā)生和反復發(fā)作有關(guān)［5］。隨后的多項研究表明，硒缺乏與乳中高體細胞數(shù)(somatic cell count，SCC)和泌乳早期易患臨床型乳腺炎有直接關(guān)系［6－8］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，當硒添加量每天達16 mg時，反而提高了奶牛臨床型乳腺炎的發(fā)病率，因此硒添加量超過臨界閾值時對機體有損傷作用［6］。奶牛乳中硒含量與奶牛罹患金黃色葡萄球菌型乳腺炎風險呈負相關(guān)，飼糧中添加硒降低了放牧奶牛乳腺內(nèi)感染病原菌的幾率，同時降低了泌乳早期較高的乳中體細胞數(shù)［9］。每千克飼糧干物質(zhì)添加亞硒酸鈉0.05～0.35 mg，在奶牛泌乳14～16周通過乳頭管人工感染大腸桿菌，加硒組未發(fā)生臨床型乳腺炎，而對照組發(fā)生了較為嚴重的乳腺炎癥狀［10］。不同硒源對經(jīng)產(chǎn)荷斯坦奶牛乳腺炎的影響研究結(jié)果顯示，與基礎(chǔ)飼糧組對比，從產(chǎn)前30 d到產(chǎn)后3個月每日飼喂亞硒酸鈉、富硒益生菌或益生菌的奶牛，其乳腺炎陽性率分別下降了30%、35%和20%，乳中體細胞數(shù)也有所降低［11］。營養(yǎng)學中關(guān)于飼糧硒的添加量，美國科學委員會(National Research Council，NRC)建議為0.3 mg/kg DM，德國營養(yǎng)生理學會(German Society for Nutritional Physiology，GfE)推薦 0.15 ～0.2 mg/kg DM，英國的推薦使用量是0.1 mg/kg DM［1］。多項研究均已表明，飼糧中添加適量的硒，能夠最大限度地降低乳腺炎、白肌病和呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率［12］。在奶牛乳腺炎中研究較深入的硒蛋白是GPX1，它具有保護吞噬細胞免受氧化損傷的作用，其在血液中的含量與乳中體細胞數(shù)呈負相關(guān)，因此，GPX1的抗氧化作用對亞臨床乳腺炎的發(fā)病率和臨床型乳腺炎的疾病嚴重程度均具有一定的治療作用［13］。最新研究表明，飼糧加硒可以顯著提高超氧化物歧化酶(SOD)的活性(16.01 U/mL)，與乳腺炎組(12.85 U/mL)和正常組(14.78 U/mL)相比顯著提高。臨床添加硒，特別是與維生素E合用時，提高了GPX活性，同時增強了血液和乳中多形核白細胞(polymorph nuclear neutrophils，PMNs)的吞噬活性和吞噬指數(shù)，與單獨的恩諾沙星治療組相比，加硒組顯著提高了乳腺中性粒細胞抗炎作用，降低了乳中體細胞數(shù)，提高了奶牛對乳腺內(nèi)感染的抗病能力［14］。

3 硒對奶牛乳腺炎的調(diào)節(jié)作用及其機制

3.1 調(diào)控機體免疫反應(yīng)

硒對機體的有益作用歸結(jié)于其對動物機體免疫反應(yīng)的優(yōu)化和炎癥反應(yīng)的調(diào)控。先天性免疫對預防乳腺感染發(fā)揮著首要作用。奶牛患有乳腺炎時，巨噬細胞第一時間發(fā)揮其吞噬活性殺滅細菌，同時釋放細胞因子和花生四烯酸代謝產(chǎn)物，促進血液中性粒細胞向炎癥組織的遷徙，共同抵抗病原繼續(xù)入侵并形成局部炎癥病灶將感染盡可能局限在可控范圍內(nèi)［15］。早期的研究表明，硒缺乏導致奶牛血液和乳中中性粒細胞和巨噬細胞抗微生物感染能力降低，因此硒對先天性免疫的研究多集中在其對中性粒細胞或巨噬細胞的影響上［16］。當乳腺受大腸桿菌刺激后，乳中中性粒細胞呈指數(shù)級迅速提高到105個/mL，中性粒細胞主要通過產(chǎn)生活性氧殺滅病原，硒缺乏降低中性粒細胞活性氧的含量，補硒提高了其趨化性和向炎癥部位遷移的能力，增強了其氧化反應(yīng)，進而提高了殺菌效力。在一側(cè)乳房注射15～40 CFU的大腸桿菌，制備奶牛乳腺炎人工感染模型，感染4 d內(nèi)，缺硒組泌乳量減少程度、完全喪失泌乳能力的時間以及乳頭組織病變和壞死的程度均較高硒組較早較快出現(xiàn)，且病變嚴重;在感染后的20 h內(nèi)，缺硒組的乳中細菌繁殖速度、細菌數(shù)、體細胞數(shù)，血液中性粒細胞數(shù)和乳腺巨噬細胞數(shù)均較高硒組顯著增多［17］。并且，飼喂較高硒水平飼糧的奶牛血液中性粒細胞的產(chǎn)過氧化物和殺菌能力比飼喂正常飼糧和缺硒飼糧的奶牛更強［18］。

飼糧硒水平和硒蛋白不僅通過優(yōu)化先天性免疫調(diào)控機體免疫穩(wěn)態(tài)，而且可以通過影響獲得性免疫，調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)。當先天性免疫不能完全清除入侵的病原體，或感染的病原微生物從局部巨噬細胞和中性粒細胞擴散、逃逸后，獲得性免疫則發(fā)揮特異性免疫反應(yīng)，通過免疫記憶快速增殖、活化淋巴細胞，產(chǎn)生免疫抗體，結(jié)合游離的病原形成抗原抗體復合物，最終通過和先天性免疫系統(tǒng)的合作將入侵微生物全部清除或?qū)⒉≡⑸锵拗朴诰植靠煽胤秶鷥?nèi)［16，19］。與飼糧硒水平正常的奶牛相比，硒缺乏奶牛血液和淋巴系統(tǒng)內(nèi)特定的淋巴細胞亞群的分化成熟能力降低［20］，硒缺乏奶牛外周血淋巴細胞的增殖反應(yīng)降低，由5－脂氧合酶途徑產(chǎn)生的花生四烯酸的生物合成能力降低。因此推測5－脂氧合酶代謝途徑的阻抑可能是淋巴細胞增殖率降低和缺硒奶?？共∧芰档偷脑蛑?，外源添加硒則可有效增強外周血和脾臟淋巴細胞的增殖能力，以及機體抵抗和清除病原感染的能力［21］。T細胞更易受到硒缺乏的影響，這可能與T細胞細胞膜的流動性高以及不飽和脂肪酸含量較高有關(guān)［22］。人體和小鼠試驗均驗證了硒調(diào)節(jié)T細胞的免疫反應(yīng)依賴于白細胞介素(IL)-2及其受體信號通路的活化［23］。硒營養(yǎng)對體液免疫同樣具有促進作用。在羊上的試驗證明，飼糧中添加硒可以有效提高患腐蹄病羊?qū)ν庠囱{蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)的免疫反應(yīng)，提高了KLH的抗體效價和中性粒細胞的殺菌能力［24］。最近在成年母牛和犢牛的大腸桿菌疫苗免疫試驗中證實了硒對獲得性免疫的增強作用，血清抗體水平和TRxR-2基因表達水平與飼糧硒水平呈正相關(guān)，而IL-8受體、L－選擇素和TRxR-1的基因表達水平與飼糧硒水平呈負相關(guān)，因此，營養(yǎng)補硒不僅提高了牛用疫苗的效力，一定程度上提高了牛的生產(chǎn)效率［25］。

3.2 調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞黏附和炎癥浸潤

硒的其中另外一個重要抗炎機制為其調(diào)節(jié)單核細胞與內(nèi)皮細胞的黏附及炎癥浸潤。內(nèi)皮細胞調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)通過物理和化學途徑調(diào)節(jié)，既可以通過調(diào)節(jié)血管張力和血流變化來調(diào)控血液中中性粒細胞向炎癥感染區(qū)域的遷移，作為促炎細胞因子的源細胞和靶細胞，血管內(nèi)皮細胞也通過自分泌和內(nèi)分泌黏附分子、炎性細胞因子和類花生酸等免疫相關(guān)因子調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。硒營養(yǎng)直接影響血管內(nèi)皮細胞功能和乳腺內(nèi)皮細胞［22］。在硒貧瘠培養(yǎng)基上培養(yǎng)牛乳腺內(nèi)皮細胞和主動脈內(nèi)皮細胞，血小板活化因子(platelet activating factor，PAF)的生物合成增加。PAF的合成增加與氧化應(yīng)激造成的血管內(nèi)皮損傷有關(guān)，硒營養(yǎng)變化也調(diào)節(jié)其他具有血管調(diào)節(jié)活性的脂類介質(zhì)的合成，如花生四烯酸的生物合成。有研究認為，飼糧硒水平可能通過影響花生四烯酸的新陳代謝進而調(diào)節(jié)淋巴細胞增殖和其他免疫反應(yīng);與正常大鼠相比，硒缺乏大鼠的淋巴細胞產(chǎn)生前列腺素(prostaglandins，PGs)的能力顯著降低，導致磷脂酶D(phospholipase D，PLD)活性減弱，磷脂酸和甘油二醛合成減少，蛋白激酶(protein kinase C，PKC)活性降低;添加PGs可逆轉(zhuǎn)這些結(jié)果，PLD活性增強;硒缺乏的牛內(nèi)皮細胞，細胞內(nèi)花生四烯酸的2個代謝途徑環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)途徑和脂氧合酶(lipoxidase，LOX)途徑均發(fā)生改變;與硒含量較豐富的細胞相比，硒缺乏血管內(nèi)皮細胞中前列腺素I2(PGI2)、前列腺素F2a(PGF2a)和前列腺素E2(PGE2)的基因表達水平顯著降低，而參與炎癥性疾病的病理生理學相關(guān)的炎癥因子血栓素B2(thromboxane B2，TXB2)和15－過氧羥基二十碳四烯酸(15-hydroperoxyeicosatetraenoic acid，15-HPETE)的生物合成顯著增加［26－27］。因此 15-HPETE的基因表達上調(diào)是硒缺乏時內(nèi)皮細胞凋亡的分子基礎(chǔ)［28］?；加写竽c桿菌型乳腺炎的硒缺乏奶牛，其花生四烯酸的代謝也有類似的變化［11］。在硒缺乏時，花生四烯酸的代謝路徑變化可能與奶牛乳腺炎病理學進程有關(guān)。

單核細胞與血管內(nèi)皮細胞間的黏附是由L－選擇素介導的，L－選擇素通過其N端C型凝集素樣結(jié)構(gòu)與其多種配體唾液酸化路易糖X(sialyl Lewisx，sLex)、硫酸肝素和硫苷脂等結(jié)合介導中性粒細胞與血管內(nèi)皮細胞最初的滯留和滾動，介導白細胞遷移到炎癥部位以及經(jīng)淋巴結(jié)高內(nèi)皮微靜脈(HEV)歸巢未致敏的淋巴細胞［26］?；|(zhì)金屬蛋白酶通過酶解作用使細胞表面L－選擇素的表達急劇下調(diào)，而使血漿中產(chǎn)生高水平的可溶性L－選擇素(sL-selection)，可溶性L－選擇素抑制淋巴細胞向內(nèi)皮細胞的黏附［29］。研究表明，硒誘導單核細胞L－選擇素脫落，抑制了單核細胞向巨噬細胞的分化，同時導致可溶性L－選擇素水平相應(yīng)增加［30－31］。大腸桿菌型乳腺炎可導致中性粒細胞向炎癥組織的遷移延遲，補硒可以提高其遷移速率。血管黏附分子如細胞間黏附分子－1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)的過表達可能影響白細胞跨膜轉(zhuǎn)移進而加重炎癥性疾病的病理進程，硒缺乏奶牛乳腺內(nèi)皮細胞在促炎因子腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)或過氧化氫(H2O2)的作用下，血管黏附分子的基因表達迅速上調(diào)，中性粒細胞黏附力提高，使白細胞向炎癥區(qū)域的遷移發(fā)生延遲，進而降低炎癥的強度［16］。

3.3 調(diào)控NF-κB和MAPK信號轉(zhuǎn)導通路

在免疫和炎癥反應(yīng)中，NF-κB和MAPK是至關(guān)重要的2類轉(zhuǎn)錄因子，它們的活化往往伴隨著IL-6 和 TNF-α 的基因表達上調(diào)［32－33］。NF-κB 的經(jīng)典信號轉(zhuǎn)導途徑中當細胞受外界信號如活性氧刺激后，激活NF-κB抑制蛋白(IκB)激酶復合物，使IκBα的部分位點氨基酸磷酸化，進而泛素化，使NF-κB的核定位序列(nuclear localization signal，NLS)暴露，介導 NF-κB 入核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄功能，如結(jié)合炎性細胞因子的啟動子而使炎性因子基因活化、表達［34］。此外，核內(nèi) NF-κB 的轉(zhuǎn)錄活性可被終止，一是通過NF-κB啟動子區(qū)的一段序列刺激IκBα的重新合成，繼而與核內(nèi)的NF-κB結(jié)合并把NF-κB帶到胞質(zhì)中;二是通過共轉(zhuǎn)錄因子交換的方式如組氨酸去乙酰化酶(histone deacetylases，HDAC)取代組氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltranferase，HAT)，減弱 NF-κB 復合體和 DNA 結(jié)合能力，同時使IκBα更容易結(jié)合到NF-κB上。在激活的后期，p65二聚體可以通過泛素化途徑被降解。這種負反饋調(diào)節(jié)機制是獨特的，代表著在炎癥進程中，NF-κB發(fā)揮有限性調(diào)節(jié)，一旦負反饋途徑被阻斷，多個促炎因子如細胞因子和黏附分子等將同步表達增加。然后，黏附分子將從外周淋巴系統(tǒng)招募中性粒細胞和T細胞至炎癥處，高表達IL-1β、IL-6 和 TNF-α 基因，更進一步刺激 NF-κB 信號活化，導致炎性疾病擴散［34－36］。

MAPK信號通路在細胞增殖分化、炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、細胞凋亡等生命活動中起重要作用［32］。細胞凋亡信號激酶(apoptosis-signaling kinase，ASK-1)是MAPK通路的上游激動劑，還原型硫氧還蛋白與ASK-1結(jié)合，抑制其活化，當硫氧還蛋白由于TRxR活性降低轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸问綍r，ASK-1被激活，導致p38和c-Jun氨基末端激酶(JNK)以及細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)的磷酸化，啟動下游信號轉(zhuǎn)導機制，進而調(diào)控免疫細胞的增殖、凋亡以及炎癥反應(yīng)。

硒的抗炎機理主要是其對靶細胞的信號轉(zhuǎn)導調(diào)控作用。研究表明，補硒通過抑制MAPK信號途徑顯著地降低了細菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的主要促炎因子TNF-α和 COX-2的基因表達［37－38］。TNF-α 是黏附分子的強力誘導劑，ICAM-1、內(nèi)皮白細胞黏附分子－1(endothelial leukocyte adhesion molecule-1，ELAM-1)和血管細胞黏附分子－1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)等招募白細胞跨越血管內(nèi)皮層到達炎癥區(qū)域促進內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)［29］。這種背景下，NF-κB對黏附分子基因的轉(zhuǎn)錄是必不可少的。向人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothe-lial cells，HUVECS)添加亞硒酸鈉，顯著降低TNF-α誘導的黏附分子的表達，并呈劑量依賴性。因此，硒水平的提高可以通過GPX抑制NF-κB的活化并減輕炎癥反應(yīng)［29］。LPS刺激的巨噬細胞添加外源硒后，主要由COX-1誘導形成的15－脫氧－Δ12，14－ 前列腺素 J2(15-deoxyΔ12，14-prostaglandin J2，15d-PGJ2)基因表達增加，并呈時間依賴性［39］。這可能是機體通過抑制促炎基因的表達調(diào)控氧化還原反應(yīng)，并進行自我保護的一種適應(yīng)性機制。有研究證實，過表達GPX基因通過抑制IκBα磷酸化和使NF-κB核移位來降低活性氧含量，使IκBα半衰期減半并加速其降解。硒水平增加阻抑了編碼炎癥因子的反式激活基因的表達，因此在抑制NF-κB的基礎(chǔ)上抑制了急性期反應(yīng)蛋白(CRP)的釋放。近年來，藥物刺激乳腺上皮細胞研究其對MARK途徑的報道逐漸增多［40］，微量元素硒、鋅等對乳腺上皮細胞的炎癥調(diào)節(jié)機制研究少有報道，筆者從小鼠乳腺炎模型、小鼠乳腺細胞炎癥模型研究硒對炎癥信號的調(diào)節(jié)作用，研究結(jié)果表明，外源添加亞硒酸鈉，顯著抑制MARK通路活化，降低了p38、JNK和ERK的磷酸化并呈劑量依賴性，促炎和炎性細胞因子誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、COX-2和TNF-α等基因呈劑量效應(yīng)表達下降［41］。

4 小結(jié)

目前奶牛飼糧中補充外源性硒主要是為了預防機體硒元素的缺乏，防止白肌病等硒營養(yǎng)性疾病的發(fā)生。硒，特別是與維生素E聯(lián)合應(yīng)用能夠預防乳腺炎的發(fā)生，并一定程度上降低臨床型和隱性乳腺炎的發(fā)病率以及發(fā)病程度。因此，解析硒的抗乳腺炎機制，特別是闡明不同類型細菌感染后的抗炎機制將為臨床補硒治療措施的科學性提供理論基礎(chǔ)。硒通過復雜而有序的方式調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，現(xiàn)有研究結(jié)果僅明晰了部分調(diào)控機制。今后對哪些硒蛋白參與抑制乳腺炎癥進程?硒蛋白是如何精細地調(diào)控炎癥相關(guān)因子的分泌?炎癥信號轉(zhuǎn)導通路中的哪些分子起主要調(diào)節(jié)作用等都需要進行系統(tǒng)而深入的研究。

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