胡良宇 吳佳誠(chéng) 王夢(mèng)芝 李鵬飛 馮 丹 張 軍

(揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009)

乳腺是具有合成和泌乳功能的特殊器官，它通過(guò)各種機(jī)制從血液中吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為其發(fā)育以及泌乳提供支持［1］。激素、營(yíng)養(yǎng)、遺傳、飼養(yǎng)管理等因素都不同程度地影響乳腺組織的發(fā)育［2］。乳腺對(duì)氨基酸的攝取、利用對(duì)乳蛋白的合成和乳產(chǎn)量的保證極為重要［3］。哺乳動(dòng)物母乳中90%以上的乳蛋白是乳腺上皮細(xì)胞以血液中的氨基酸為原料合成的，其中酪蛋白的含量最高，占了總蛋白含量的近80%。氨基酸作為主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，與乳腺的生長(zhǎng)發(fā)育及泌乳密切相關(guān)，就精氨酸(Arg)來(lái)說(shuō)，作為一種新生哺乳動(dòng)物的必需氨基酸，成年哺乳動(dòng)物的條件性必需氨基酸，不僅是乳蛋白合成的底物，還是調(diào)控乳蛋白合成的信號(hào)分子，調(diào)節(jié)乳蛋白合成的轉(zhuǎn)錄、翻譯［1］，在動(dòng)物體內(nèi)具有重要的生理、代謝調(diào)控和營(yíng)養(yǎng)作用。

Arg是目前發(fā)現(xiàn)的功能最多的一種氨基酸［4］。前人對(duì)乳腺限制性氨基酸攝取、利用的研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加適宜水平的Arg能夠有效提高平均日增重，改善動(dòng)物的生長(zhǎng)性能［5－6］;而且乳腺攝入的Arg顯著超過(guò)其分泌量，同時(shí)Arg代謝水平隨著細(xì)胞外 Arg 濃度的升高而升高［7－10］;Doepel等［11］試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)奶牛乳腺灌注Arg的試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，乳蛋白的產(chǎn)量顯著提高。以上研究結(jié)果提示過(guò)量保留于乳腺中的Arg除了用于乳蛋白的合成外，還有其他的代謝途徑或代謝調(diào)節(jié)功能;本課題組Chen等［12］對(duì)體外培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞的研究表明，體外培養(yǎng)添加Arg對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白的合成有一定的調(diào)節(jié)作用;Wang等［13］研究發(fā)現(xiàn)Arg通過(guò)哺乳動(dòng)物類帕霉素(mTOR)途經(jīng)調(diào)控酪蛋白的表達(dá);徐柏林［1］在Arg影響乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)酪蛋白合成的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，將Arg含量比對(duì)照組提高1倍時(shí)乳腺上皮細(xì)胞αs－酪蛋白和β－酪蛋白的含量達(dá)到最大，且促乳腺上皮細(xì)胞增殖效果最佳。以上研究都表明了Arg對(duì)體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖和其酪蛋白表達(dá)有一定的促進(jìn)作用，但對(duì)于Arg是否影響體內(nèi)乳腺組織的發(fā)育和其酪蛋白的表達(dá)尚不得而知。為此，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)向模式動(dòng)物——Wistar大鼠的基礎(chǔ)飼糧中添加Arg，研究Arg對(duì)其乳腺組織發(fā)育以及對(duì)乳腺酪蛋白合成的影響，以期為進(jìn)一步研究Arg影響奶牛乳腺泌乳及其代謝機(jī)制提供一些試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用同窩對(duì)照的方法，選擇同窩、健康、雌性受孕Wistar大鼠12只(揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)研究中心提供)，體重(260±10)g，各大鼠的生理狀況基本一致，隨機(jī)分成2組。試驗(yàn)大鼠單籠飼養(yǎng)，常規(guī)一致飼養(yǎng)管理和免疫程序，自然采光、通風(fēng)，自由采食、飲水。

試驗(yàn)大鼠基礎(chǔ)飼糧中粗蛋白質(zhì)、消化能等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)需要量參照 Reeves等［14］文獻(xiàn)，采用 AIN-93G大鼠純化飼糧標(biāo)準(zhǔn)，交由南通特羅菲公司配制。Arg組在基礎(chǔ)飼糧中添加與其等量的Arg(飼糧Arg含量1.280%，均以L-Arg計(jì))，對(duì)照組飼糧用谷氨酸替代精氨酸組中的精氨酸以平衡飼糧氮水平。試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

試驗(yàn)分預(yù)試期4 d(分娩前4天)，正試期為17 d(分娩后17天)。試驗(yàn)中有1只大鼠部分?jǐn)?shù)據(jù)不全。

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(DM basis)［14］

1.2 大鼠乳腺組織的采集及保存

正試期結(jié)束，采集12只大鼠的乳腺組織，后用生理鹽水沖洗，30 s內(nèi)投入液氮保存。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 大鼠體重、仔鼠窩重的測(cè)定

待大鼠產(chǎn)仔泌乳后，每日固定時(shí)間(16:00)用電子稱依次稱取大鼠體重、仔鼠窩重，記錄數(shù)據(jù)。稱重結(jié)束后將大鼠、仔鼠放置原處。連續(xù)稱重17 d。

1.3.2 乳腺腺泡面積的測(cè)定

通過(guò)明美數(shù)碼成像系統(tǒng)軟件(MC30)進(jìn)行測(cè)量。

1.3.3 乳腺總蛋白含量的測(cè)定

將乳腺組織樣本切割、裂解、離心提取，收集上清液。

乳腺總蛋白含量通過(guò)二喹啉甲酸(BCA)蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)(P0010S，碧云天生物技術(shù)研究所)自行測(cè)定，具體測(cè)定步驟參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3.4 乳腺α－酪蛋白、β－酪蛋白、κ－酪蛋白含量的測(cè)定

將乳腺組織樣本切割、裂解、離心提取，收集上清液。

通過(guò)大鼠酪蛋白酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒(上海聯(lián)碩生物科技有限公司)自行測(cè)定大鼠乳腺α－酪蛋白、β－酪蛋白、κ－酪蛋白含量。具體測(cè)定步驟參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。試驗(yàn)所得的各種蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)都高于0.99，可用于乳腺總蛋白以及各類酪蛋白含量的測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

用Excel對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用 SPSS 16.0軟件中 compare mean模塊的 independentsamples t-test過(guò)程進(jìn)行2個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極其顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠體重、仔鼠窩重

由表2可知，試驗(yàn)期末的大鼠體重和仔鼠窩重在組間雖然都沒(méi)有顯著性的差異(P＞0.05)，但Arg組的大鼠體重和新生仔鼠窩重在數(shù)值上都高于對(duì)照組。

由圖1可見(jiàn)，對(duì)照組和Arg組仔鼠窩重的增長(zhǎng)S曲線變化趨勢(shì)基本一致。1～8 d對(duì)照組與Arg組的仔鼠窩重增長(zhǎng)曲線接近重合，幾乎沒(méi)有差異;9～17 d Arg組的仔鼠窩重增長(zhǎng)速度略高于對(duì)照組，但沒(méi)有明顯的差異。

表2 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)大鼠體重和新生仔鼠窩重Table 2 Body weight rats and litter weight of newborn rats at the end of the experiment g

圖1 新生仔鼠窩重增長(zhǎng)曲線Fig.1 The growth curve of litter weight of newborn rats

2.2 乳腺組織發(fā)育

圖2 為分娩后大鼠的乳腺組織切片。由圖可見(jiàn)，相對(duì)于對(duì)照組，Arg組乳腺腺泡較為規(guī)則、一致，而且腺泡切面面積相對(duì)更大;對(duì)照組乳腺的腺泡則大小不一，部分發(fā)育不完全，腺泡切面面積也相對(duì)較小。

并且通過(guò)測(cè)量和計(jì)算2組腺泡切面面積可知(表3)，Arg組腺泡切面面積極顯著大于對(duì)照組(P＜0.01)，腺泡面積的增大為乳腺蛋白質(zhì)含量的提高提供了必要條件，進(jìn)一步說(shuō)明了Arg對(duì)大鼠乳腺蛋白質(zhì)合成的促進(jìn)作用。

2.3 乳腺蛋白質(zhì)含量

由表3可知，Arg組和試驗(yàn)組乳腺總蛋白含量差異不顯著(P＞0.05)。整體看來(lái)酪蛋白的合成水平都有增加的趨勢(shì)。其中Arg組β－酪蛋白含量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，而α－酪蛋白、κ－酪蛋白含量則未見(jiàn)顯著增加(P＞0.05)。

3 討論

為了達(dá)到試驗(yàn)飼糧為酪蛋白模式的設(shè)計(jì)，本試驗(yàn)采用了半純合技術(shù)進(jìn)行飼糧配制，基礎(chǔ)飼糧中采用酪蛋白為蛋白質(zhì)源，因此，其Arg和谷氨酸含量比例即是酪蛋白模式中的比例，也是泌乳動(dòng)物的理想模式。試驗(yàn)組增加其模式下的Arg含量，以突出在酪蛋白模式基礎(chǔ)上2倍量的Arg(徐柏林［1］前期乳腺上皮細(xì)胞體外試驗(yàn)所獲得的結(jié)果)是否在大鼠上有同樣的促進(jìn)作用;對(duì)照組則在酪蛋白的模式下，選擇添加了在體內(nèi)大量存在，可由其他氨基酸轉(zhuǎn)變而來(lái)的非限制性氨基酸谷氨酸以配制等氮飼糧。本試驗(yàn)中粗蛋白質(zhì)水平和能氮比在組間都基本一致，試驗(yàn)結(jié)果的差異應(yīng)主要來(lái)自于處理的差異。另有研究認(rèn)為，谷氨酸和Arg在體內(nèi)有一定的代謝相關(guān)，但基本與改變含量和比例有關(guān)。如陳明洪等［15］在飼糧中添加Arg或谷氨酸，改變2者含量和比例未能有效提高育肥豬生長(zhǎng)性能;黃新球等［16］對(duì)于Arg及N－氨甲酰谷氨酸(NCG)對(duì)斷奶小鼠生長(zhǎng)性能的研究表明，NCG引起機(jī)體內(nèi)Arg合成量的變化并不與NCG的添加量成正比:飼糧中添加0.05%NCG的比添加0.1%的血清游離Arg含量更高。以上試驗(yàn)表明了超過(guò)一定量或含有充足量的Arg和谷氨酸時(shí)并不能體現(xiàn)其代謝相關(guān)或促進(jìn)效應(yīng)。本試驗(yàn)飼糧中谷氨酸的含量分別為3.630%、5.550%，Arg的含量分別為1.280%、0.640%，遠(yuǎn)超過(guò)前人研究中體現(xiàn)促進(jìn)效應(yīng)的水平。綜上表明，在本試驗(yàn)供給基礎(chǔ)飼糧為泌乳動(dòng)物理想模式的條件下，谷氨酸主要作用是對(duì)照組的氮配平氨基酸。

圖2 大鼠乳腺腺泡組織切片F(xiàn)ig.2 The histological section of rat mammary gland

表3 精氨酸對(duì)大鼠乳腺蛋白質(zhì)含量及腺泡切面面積的影響Table 3 Effects of Arg on protein contents and acinar area of mammary gland in rats

Arg是組織蛋白質(zhì)最多的氮攜帶者［4］。飼糧中添加Arg后，可促進(jìn)氮沉積，母鼠可通過(guò)胎盤傳遞給胎兒更多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(氨基酸、氧氣等)，促進(jìn)胎盤和胎兒生長(zhǎng)發(fā)育［17－18］;在應(yīng)激、疾病和感染的情況下，Arg能促進(jìn)多種內(nèi)分泌激素(如生長(zhǎng)激素、胰島素、胰高血糖素等)的釋放，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成和抑制蛋白質(zhì)的分解，從而間接促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)［19－20］。Yao 等［21］在 7 日 齡 仔 豬 飼 糧 中 添 加0.6%的Arg，顯著提高了平均日增重，促進(jìn)了肌肉蛋白質(zhì)的合成;Corzo等［22］研究雄性肉雞Arg的需要時(shí)發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加Arg能夠顯著提高42～56日齡雄性肉仔雞的平均日采食量和平均日增重。本試驗(yàn)中，飼糧添加Arg大鼠體重雖然與對(duì)照組的差異不顯著但在數(shù)值上有所增加，仔鼠窩重也有增加的趨勢(shì)。這與上述研究結(jié)果有一定的一致性。

乳蛋白的合成量受乳腺組織發(fā)育狀況和基因調(diào)控及外在條件的影響。首先，乳腺組織需要發(fā)育完全，才可為合成、泌乳提供充分的生理基礎(chǔ)。乳腺組織在動(dòng)物體內(nèi)的增殖和分化受許多因素的影響，如激素、維生素、氨基酸、微量元素、生長(zhǎng)因子等［23］。Arg作為一種氨基酸營(yíng)養(yǎng)素，對(duì)乳腺細(xì)胞發(fā)育也有一定程度的促進(jìn)作用。何晉等［24］研究發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)液中Arg濃度的增加，Arg對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖起到了促進(jìn)作用;Bie等［25］研究結(jié)果表明，上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中Arg濃度為0.3 mmol/L較適宜上皮細(xì)胞的增殖及蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化。說(shuō)明Arg對(duì)不同細(xì)胞都有不同程度的促進(jìn)作用，以此類推，可以猜想Arg對(duì)乳腺細(xì)胞同樣具有促進(jìn)作用。同時(shí)，Arg的代謝產(chǎn)物一氧化氮(NO)具有擴(kuò)張血管的作用，因此Arg-NO途徑具有促進(jìn)乳腺及乳腺內(nèi)血管的生長(zhǎng)、提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取量、改善大鼠的乳腺組織發(fā)育進(jìn)而提高泌乳性能的作用［26］。

另外，添加Arg對(duì)外在因素的調(diào)控及酪蛋白基因的表達(dá)都會(huì)產(chǎn)生影響。近年來(lái)對(duì)影響乳腺上皮細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成因素的研究主要集中在對(duì)細(xì)胞中酪蛋白和乳清蛋白含量的檢測(cè)上［27－28］。氨基酸作為乳蛋白合成的前體物對(duì)促進(jìn)乳蛋白的合成應(yīng)有適當(dāng)?shù)谋壤c濃度，氨基酸的平衡性對(duì)于提高乳蛋白含量和合成效率具有現(xiàn)實(shí)意義［29－30］。激素就是一種典型的外在因素能對(duì)乳蛋白的合成產(chǎn)生重要影響。Arg則可通過(guò)促進(jìn)多種內(nèi)分泌激素(包括胰島素、生長(zhǎng)激素、催乳素、抗利尿激素和兒茶酚胺等)的釋放［4］，從而可以調(diào)節(jié)乳腺上皮細(xì)胞的增殖、凋亡和免疫，促進(jìn)泌乳和乳蛋白的合成［31－32］。同時(shí)基因水平的研究表明，Arg可通過(guò)調(diào)控乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶2－信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子5(Jak2-Stat5)、mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響酪蛋白基因的表達(dá)。其主要機(jī)制為激酶Jak2催化結(jié)合在受體上的Stat5蛋白發(fā)生磷酸化修飾，活化的Stat5蛋白以二聚體的形式進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與靶基因結(jié)合，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄［20］。徐柏林［1］以奶牛乳腺上皮細(xì)胞為模型研究發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的Arg能促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中αS1－酪蛋白、αS2－酪蛋白、β－酪蛋白、κ－酪蛋白基因的表達(dá)，且當(dāng)體外細(xì)胞培養(yǎng)液中Arg濃度為556.00 mg/L時(shí)，這4種基因的表達(dá)顯著上調(diào)。本試驗(yàn)中Arg組分娩后大鼠的乳腺腺泡較為規(guī)則、一致，腺泡切面面積極顯著大于對(duì)照組;添加Arg對(duì)大鼠乳腺β－酪蛋白的合成有顯著的促進(jìn)作用，對(duì)α－酪蛋白、κ－酪蛋白合成量也有所促進(jìn)，與上述研究結(jié)果有著一致性。由此可見(jiàn)，Arg能夠促進(jìn)乳腺腺泡發(fā)育和酪蛋白基因的表達(dá)，進(jìn)而表現(xiàn)為乳腺組織充分發(fā)育和酪蛋白的合成量的提高。

4 結(jié)論

飼糧添加Arg對(duì)大鼠乳腺組織發(fā)育及β－酪蛋白的合成有顯著的促進(jìn)作用。

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