胡國(guó)才 黃 靜 吳曉玉

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，南昌市發(fā)酵應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330045)

早期斷奶對(duì)仔豬生長(zhǎng)發(fā)育帶來一系列不良影響，造成其食欲差、消化不良、腹瀉等仔豬早期斷奶綜合征。產(chǎn)生這一后果的生理基礎(chǔ)是由于斷奶應(yīng)激影響仔豬腸道組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)、消化道微生態(tài)區(qū)系的平衡。同時(shí)斷奶應(yīng)激也嚴(yán)重影響免疫系統(tǒng)和酶系統(tǒng)發(fā)育及健全［1］。越來越多的研究表明乳酸菌類微生態(tài)制劑具有減少哺乳和斷奶仔豬消化道疾病發(fā)生、提高機(jī)體免疫力的功效，從而有效緩解早期斷奶應(yīng)激引起的仔豬免疫功能下降，是仔豬生產(chǎn)中一種理想的飼料添加劑［2-3］。

嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus，L.acidophilus)是少數(shù)可以存活并定植于腸道內(nèi)的益生菌之一，其在腸道內(nèi)的定植能力強(qiáng)于其他微生物。它能競(jìng)爭(zhēng)性地定植于小腸上皮細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)菌素和有機(jī)酸，維持腸道內(nèi)低pH環(huán)境，促進(jìn)腸道中微生 態(tài) 環(huán) 境 的 正 常 化［4-6］。Lin 等［7］、Lin 等［8］、Aween等［9］研究證實(shí) L.acidophilus可抑制大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、葡萄球菌、枯草桿菌等的生長(zhǎng)。L.acidophilus ATCC4356通過降低氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)可減弱小鼠動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程［10］。新生的腸道無菌仔豬喂飼L.acidophilus菌劑時(shí)，可顯著提高能量與脂肪代謝的轉(zhuǎn)錄組水平［11］;適當(dāng)劑量 L.acidophilus NCFM(3.2×106CFU)可增強(qiáng)新生仔豬對(duì)胃腸炎病毒(輪狀病毒)的免疫力，仔豬回腸、脾臟和血液的輪狀病毒特異性抗體、免疫球蛋白G(lgG)抗體分泌細(xì)胞(ASCs)、記憶B細(xì)胞均明顯提高［12］。鑒于乳酸桿菌在腸道黏膜定殖具有宿主特異性，即土著菌株比外來菌株更易于定殖黏膜細(xì)胞，且引起黏膜免疫反應(yīng)所需菌量顯著低于外來益生菌所需的劑量［13-14］，而其中的L.acidophilus較其他乳桿菌更易定植于腸道上皮細(xì)胞，形成屏障，抑制病原菌的生長(zhǎng)［15-17］，本研究擬從仔豬糞便中分離篩選L.acidophilus，并對(duì)其進(jìn)行馴化，使其作為微生態(tài)制劑在仔豬生長(zhǎng)發(fā)育與防御腸道疾病中發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集

采集江西農(nóng)業(yè)大學(xué)養(yǎng)豬場(chǎng)未使用過任何抗生素藥物的15日齡仔豬新鮮糞便。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母粉5 g/L，磷酸鉀(K2HPO4)2 g/L，檸檬酸二銨2 g/L，乙酸鈉 5 g/L，葡萄糖 20 g/L，吐溫80 g/L 1 mL，七水硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.58 g/L，四水硫酸錳(MnSO4·4H2O)0.25 g/L，pH 5.5。

生理生化鑒定培養(yǎng)基:包括牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基、明膠液化培養(yǎng)基、V-P試驗(yàn)培養(yǎng)基、PY基礎(chǔ)培養(yǎng)基、PYG培養(yǎng)基、硝酸鹽液體培養(yǎng)基、吲哚試驗(yàn)培養(yǎng)基、碳水化合物培養(yǎng)基等均按參考文獻(xiàn)［18］配制。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 豬腸道L.acidophilus的分離純化

稱取采集的樣品1 g，置于含99 mL 0.85%無菌生理鹽水的三角瓶中，振蕩15 min，使樣品充分混勻，10倍系列梯度稀釋至10-7，配制成不同稀釋度菌懸液。分別用不同稀釋度的菌懸液涂布于MRS平板培養(yǎng)基，37℃，培養(yǎng)48 h。

挑取MRS平板培養(yǎng)基上疑似乳酸菌單菌落，革蘭氏染色，鏡檢。選取革蘭氏陽(yáng)性、桿狀單菌落，在MRS平板培養(yǎng)基上劃線，37℃，培養(yǎng)48 h。重復(fù)上述步驟4次。最后，平板單菌落至斜面培養(yǎng)，保存。

1.2.2 豬腸道L.acidophilus的鑒定

1.2.2.1 形態(tài)特征觀察

將上述分離純化菌株分別劃線至PY基礎(chǔ)培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48 h。觀察單菌落形態(tài)特征。經(jīng)革蘭氏染色后，光學(xué)顯微鏡觀察菌體形態(tài)特征。

1.2.2.2 生理生化特性鑒定

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［19］、《乳酸細(xì)菌分類鑒定及試驗(yàn)方法》［18］，對(duì)上述分離純化的L.acidophilus疑似菌株進(jìn)行生理生化特測(cè)定與分析。

1.2.2.3 高效液相測(cè)定發(fā)酵液乳酸含量

測(cè)試菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基，搖瓶轉(zhuǎn)速180 r/min，在 37℃ 下培養(yǎng) 48 h。發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/min離心后，取上清液，用超純水適當(dāng)稀釋，即得待測(cè)液。

色譜條件:使用Aminex HPX-87H分析柱，流動(dòng)相為0.005 mol/L硫酸，柱溫50℃，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量 15 μL［20］。

1.2.2.4 16S rDNA 序列分析

采用細(xì)菌16S rRNA通用引物(7f:5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’;1540r:5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)，引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(25 μL):dNTPmix(每個(gè)10 mmol/L)0.5 μL，10× Taq reaction Buffer 2.5 μL，Taq(5 U/μL)0.2 μL，模板1 μL，正向、反向引物各 0.5 μL，ddH2O 14.8 μL。反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55℃ 35 s，72℃ 90 s，循環(huán)35次，72℃ 8 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，測(cè)序由該公司完成。

菌株測(cè)序后的序列信息用BLAST軟件分析，選擇GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比較。用分子進(jìn)化遺傳學(xué)分析(molecular evolutionary genetics analysis，MEGA)6.0軟件分析處理所測(cè)菌株序列與下載同源性較高序列，構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 菌株La-5耐酸性能馴化

以菌株La-5為出發(fā)菌制成菌懸液。取100 mL菌懸液，6 000 r/min離心15 min，收集菌體。菌體轉(zhuǎn)入pH=4.5的MRS液體培養(yǎng)基馴化，搖瓶培養(yǎng)24 h后，取50 mL馴化培養(yǎng)液離心，沉淀菌體再轉(zhuǎn)入pH=5.5的MRS液體培養(yǎng)基富集，再搖瓶培養(yǎng)12 h。按上述方式，依次用 pH 為 4.0、3.5、3.0、2.5、2.0 和1.5 的 MRS 培養(yǎng)基馴化，pH=5.5 的 MRS培養(yǎng)基富集。最后，富集菌液用平板涂布純化，挑取單菌落斜面保藏。經(jīng)耐酸馴化后的菌株命名為菌株La-5a。

取20 mL菌株La-5與La-5a的菌懸液，離心，沉淀菌體分別接入 pH 為 1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0和5.5的MRS培養(yǎng)基，搖瓶培養(yǎng)4 h。采用pH=5.5的MRS培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)，測(cè)定不同pH的MRS培養(yǎng)液的活菌數(shù)。以pH=5.5的MRS為對(duì)照組，其他6個(gè)pH的MRS為試驗(yàn)組，計(jì)算菌株存活率，并繪制活菌數(shù)、存活率與pH的關(guān)系圖。

1.2.4 菌株La-5a耐膽鹽性能馴化

取菌株La-5a菌懸液100 mL，按1.2.3方法離心，沉淀菌體轉(zhuǎn)入含0.1%膽鹽MRS液體培養(yǎng)基馴化，搖瓶培養(yǎng)24 h后，離心，沉淀菌體轉(zhuǎn)入無膽鹽MRS液體培養(yǎng)基，搖瓶富集培養(yǎng)12 h。按上述方法，依次用含 0.3%、0.5%、0.7% 和 1.0% 膽鹽MRS培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶馴化、無膽鹽MRS培養(yǎng)基搖瓶富集。最后，富集菌液用平板涂布純化，挑取單菌落斜面保藏。經(jīng)耐膽鹽馴化后的菌株命名為菌株La-5b。

取20 mL菌株La-5和La-5b的菌懸液，離心，沉淀菌體分別接入含膽鹽 0、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40% 和 0.50% 的 MRS 培養(yǎng)基，搖瓶培養(yǎng)4 h。采用平板計(jì)數(shù)法，利用MRS瓊脂培養(yǎng)基，測(cè)定不同膽鹽含量MRS培養(yǎng)液中的活菌數(shù)。以膽鹽含量0為對(duì)照組，其他6個(gè)膽鹽含量為試驗(yàn)組，計(jì)算菌株存活率，并繪制活菌數(shù)、存活率與膽鹽含量的關(guān)系圖。

1.2.5 菌株La-5b耐熱性能馴化

取菌株La-5b菌懸液50 mL，離心，沉淀菌體轉(zhuǎn)入含MRS液體培養(yǎng)基150 mL三角瓶中，置40℃水浴熱激馴化處理30 min后，取20 mL菌液離心，沉淀菌體轉(zhuǎn)入MRS液體培養(yǎng)基，富集培養(yǎng)24 h。按上述方法，依次再用 45、50、55、60、65 和70℃水浴熱激馴化和富集。最后，富集菌液用平板涂布純化，挑取單菌落斜面保藏。經(jīng)高溫馴化后的菌株命名為L(zhǎng)a-5c。

分別取菌株La-5和La-5c菌懸液20 mL，離心，沉淀菌體轉(zhuǎn)入含100 mL MRS液體培養(yǎng)基的三角瓶，再將三角瓶分別置于 37、40、45、50、55、60、65和70℃水浴熱激處理30 min。采用平板計(jì)數(shù)法，用MRS平板培養(yǎng)基，測(cè)定不同溫度處理后的活菌數(shù)。以37℃為對(duì)照組，其他7個(gè)溫度為試驗(yàn)組，計(jì)算菌株存活率，并繪制活菌數(shù)、存活率與溫度的關(guān)系圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌形態(tài)特征

利用MRS平板培養(yǎng)基從15日齡仔豬糞便中共分離42株具有乳酸菌典型菌落形態(tài)特征的菌株。經(jīng)多次劃線純化、革蘭氏染色、鏡檢，獲得13株菌落直徑較大、長(zhǎng)勢(shì)較好的桿狀菌株，分別編號(hào)為菌株La-1至La-13(圖1)。其菌落特征為:大部分菌落乳白色，少數(shù)透明(菌株La-1、La-3和La-7);邊緣整齊;大部分凸起，少數(shù)無凸起(菌株La-3、La-7、La-9 和 La-12)、濕潤(rùn)。

圖1 分離純化菌株La-5與La-1的形態(tài)特征圖Fig.1 The morphologic character of strains La-1 and La-5 screened by isolating and purifying(1 000 × )

2.2 生理生化特性的鑒定

參照文獻(xiàn)［18］、［19］，對(duì)分離純化的13株進(jìn)行初步鑒定，結(jié)果表明，菌株 La-1、La-2、La-4、La-5、La-6、La-7、La-8、La-9 和 La-10 的過氧化氫酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)以及氧化酶試驗(yàn)均為陰性。菌株La-3和La-11吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性，其他試驗(yàn)均為陰性。菌株La-12硝酸鹽還原試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)及氧化酶試驗(yàn)為陽(yáng)性，其他試驗(yàn)均為陰性。菌株La-13硝酸鹽還原試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)為陽(yáng)性，其他試驗(yàn)均為陰性。綜合試驗(yàn)結(jié)果排除菌株La-3、La-11、La-12和La-13為乳酸桿菌屬。

對(duì)剩余9 株菌株 La-1、La-2、La-4、La-5、La-6、La-7、La-8、La-9和La-10進(jìn)行碳水化合物產(chǎn)酸發(fā)酵試驗(yàn)(表1)。結(jié)果表明，菌株 La-5、La-6、La-8和La-9的4株菌發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)酸特性與L.acidophilus的完全相同。比較菌株La-5，La-6，La-8和La-9生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)及形態(tài)，菌株La-5在MRS瓊脂平板上的長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于其他3株，單菌落較大而飽滿，菌體為較粗長(zhǎng)桿狀，且其發(fā)酵48 h的MRS培養(yǎng)液pH低于其他3株菌株。進(jìn)一步采用高效液相法對(duì)其發(fā)酵液產(chǎn)乳酸、乙酸性能進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖2。La-5菌株發(fā)酵液經(jīng)過濾、3倍稀釋后，高效液相測(cè)定乳酸含量為 11.52 g/L，乙酸為 2.99 g/L，表明該菌具有發(fā)酵產(chǎn)乳酸的能力。因此選擇菌株La-5為后續(xù)研究菌株。

表1 乳酸菌的碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸結(jié)果Table 1 The results of carbohydrates reaction by lacto acid bacteria

2.3 菌株La-5 16S r RNA序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

利用細(xì)菌引物7f/1540r對(duì)菌株La-5的16S rRNA擴(kuò)增、測(cè)序。獲得基因片段大小為1 430 bp。在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行16S rRNA序列比對(duì)，與菌株La-5(登錄號(hào):KJ850588)相似度最高的菌株 L.acidophilus(NR075045、NR117812)，相似性達(dá)100%。利用MEGA 6.06構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株La-5進(jìn)化地位(圖3)。菌株La-5與 L.acidophilus(NR075045、NR117812)處于同一支，自展值100%，說明這一亞支穩(wěn)定性好。結(jié)合菌株La-5的形態(tài)特征、生理生化檢測(cè)結(jié)果，將該菌株鑒定為L(zhǎng).acidophilus。

2.4 菌株La-5耐酸性能馴化

對(duì)分離篩選的菌株La-5采用稀鹽酸調(diào)整MRS液體培養(yǎng)基酸度，模擬動(dòng)物胃酸，進(jìn)行菌株耐酸性能馴化(1.2.3方法)，以提高其耐受胃酸環(huán)境的能力，保證足量活菌進(jìn)入腸道發(fā)揮益生作用。經(jīng)不同pH處理4 h后，利用平板計(jì)數(shù)法，分別測(cè)定出發(fā)菌株La-5和馴化后菌株La-5a，的活菌數(shù)及存活率(圖4)。結(jié)果表明:經(jīng)耐酸馴化后獲得的菌株La-5a在同等酸度條件下，其活菌數(shù)與存活率均高于原始菌株La-5，特別在低酸度(pH=1.5～3)時(shí)，馴化后菌株存活率明顯高于原始菌株，高出36% ～44%，但極低pH(1.5)對(duì)菌株La-5a仍具有一定抑制作用，存活率為37%，原始菌株為0.6%。

圖2 菌株La-5發(fā)酵液L－乳酸、乙酸的液相色譜圖Fig.2 Chromatogram of L-lactic acid and acetic acid of fermentation broth by strain La-5

圖3 菌株La-5 16S r RNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.3 The phylogenetic tree of strain La-5 based on 16S rRNA gene sequences

圖4 在不同pH條件下處理4 h后菌株的活菌數(shù)(Ⅰ)及存活率(Ⅱ)Fig.4 Viable counts(Ⅰ)and survival rate(Ⅱ)of strains La-5 and La-5a under the condition of different pH for 4 h

2.5 菌株La-5a耐膽鹽能力馴化

采用耐酸性菌株La-5a為出發(fā)菌株，用含膽鹽的MRS培養(yǎng)基進(jìn)行耐膽鹽性能馴化。經(jīng)馴化后菌株La-5b與原始菌株La-5在不同膽鹽濃度下處理4 h后的生長(zhǎng)情況見圖5。菌株La-5b對(duì)膽鹽耐受能力明顯優(yōu)于菌株La-5。膽鹽濃度達(dá)0.5%時(shí)，前者存活率仍有27.30%，而后者僅為4.03%;動(dòng)物小腸膽汁鹽濃度在0.03% ～0.3%之間波動(dòng)，在此范圍內(nèi)馴化菌株存活率為85%～90%之間，而菌株La-5為28% ～53%，兩者差異明顯。

圖5 在不同膽鹽含量條件下處理4 h后菌株La-5和La-5b的活菌數(shù)(Ⅰ)及存活率(Ⅱ)Fig.5 Viable counts(Ⅰ)and survival rate(Ⅱ)of strains La-5 and La-5b under the condition of different bile salt concentrations for 4 h

2.6 菌株La-5b耐熱性能馴化

膽鹽馴化后菌株La-5b 經(jīng)耐熱性處理后(1.2.5方法)，與原始菌株 La-5比較，在 45～50℃之間其存活率明顯高于原始菌株，50℃時(shí)菌株La-5c存活率為 66.1%，而菌株 La-5 ＜0.01%;當(dāng)溫度達(dá)55℃處理30 min后，前者仍有7.5%的存活率;甚至高達(dá)70℃處理后，還有極少量菌生存，而原始菌株在溫度達(dá)50℃處理后，已無法檢測(cè)到生存菌株(圖6)。

3 討論

1900年，L.acidophilus首次從人體胃腸道分離，并命名為Bacillus acidophilus。1970年Hanson和Moquot修改為現(xiàn)在的名稱。隨著細(xì)菌鑒定及特征性描述方式方法的發(fā)展，L.acidophilus的種群分類經(jīng)歷了多次修訂，并在紛繁多樣的乳酸桿菌類群中歸為亞群中的一個(gè)種［21］。該菌為革蘭陽(yáng)性、桿狀細(xì)菌，通過糖酵解(EMP)途徑厭氧發(fā)酵產(chǎn)乳酸［22］，根據(jù)生物合成途徑有關(guān)基因組分析，認(rèn)為L(zhǎng).acidophilus為營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)菌，其生長(zhǎng)繁殖需提供14種氨基酸，同時(shí)不能合成多種輔酶因子及維生素(包括核黃素、維生素B6，煙酰胺、生物素、葉酸等)［23］，菌株也因此需采用營(yíng)養(yǎng)豐富的 MRS(deMan、Rogosa和Sharpe)為其常規(guī)培養(yǎng)基。

早在1971年 Van der Waaij等［24］證實(shí)胃腸道菌群是一個(gè)復(fù)雜、穩(wěn)定的生境，對(duì)外源微生物具有清除能力。Lidbeck等［25］給受試者每天飲用含L.acidophilus發(fā)酵牛奶，其腸道乳酸菌含量明顯提高，但一旦停止飲用，乳酸菌數(shù)量又回復(fù)到原有水平。Vinderola等［13］用外源、內(nèi)源 L.acidophilus等益生菌喂飼小鼠，表明內(nèi)源性乳酸菌激活小鼠腸道黏膜免疫反應(yīng)所需飼喂菌量(104個(gè)/d)遠(yuǎn)小于外源益生菌(107個(gè)/d)。鑒于乳酸菌在腸道內(nèi)定殖的復(fù)雜性以及宿主種屬的特異性，本文采集養(yǎng)豬場(chǎng)的未使用過任何抗生素藥物的15日齡仔豬新鮮糞便，利用MRS培養(yǎng)基選擇性地富集乳酸菌，再采用平板劃線法培養(yǎng)單菌落，多次分離純化乳酸菌。通過對(duì)分離純化菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化檢測(cè)、產(chǎn)乳酸性能測(cè)定、16S rDNA序列分析以及建立系統(tǒng)發(fā)育樹，最后確定豬源腸道菌株 La-5為 L.acidophilus。

圖6 在不同溫度條件下處理30 min后菌株La-5和La-5c的活菌數(shù)和存活率Fig.6 Viable counts(Ⅰ)and survival rate(Ⅱ)of strains La-5 and La-5b under the condition of different temperatures for 30 min

哺乳仔豬胃內(nèi)pH為4.0左右，斷奶后升至5.5～6.0，以后逐步下降，60日齡后可達(dá)到正常水平，為 2.0 ～3.5［26］。哺乳仔豬的膽囊內(nèi)膽汁分泌量很少，膽汁量在出生后3周內(nèi)緩慢增加，小腸內(nèi)膽鹽濃度在 0.03% ～0.30% 波動(dòng)［27］。而食物進(jìn)入豬胃后，完全排空的時(shí)間3～15日齡約為l.5 h，1 月齡為3 ～5 h，2 月齡為 16 ～19 h［28］。因此，一方面，經(jīng)喂飼的微生態(tài)菌劑必須能耐受胃腸的低胃酸及高濃度膽鹽，才能到達(dá)動(dòng)物腸道，定殖于上皮細(xì)胞黏膜，發(fā)揮益生效應(yīng)。另一方面乳酸菌適宜生長(zhǎng)溫度為37℃，高溫不利于菌株的生長(zhǎng)及產(chǎn)酸，甚至導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。而菌劑的發(fā)酵生產(chǎn)過程中，提高發(fā)酵溫度可降低生產(chǎn)能耗、減少染菌;同時(shí)乳酸菌制品的加工過程如巴氏消毒等易造成活菌數(shù)大量減少，因此改良菌株對(duì)環(huán)境的耐受性已引起國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。吳惠芬等［29］研究分離自仔豬腸道的乳酸菌L5和L7對(duì)低pH和膽鹽的耐受性，表明在pH為1.5和2.5條件下經(jīng)處理30 min后，菌株數(shù)量顯著下降;當(dāng)膽鹽濃度高于0.2%時(shí)，2個(gè)菌株的生長(zhǎng)極差;菌株L5在50℃下可成活，且呈正常生長(zhǎng)趨勢(shì)，但對(duì)80℃及以上的耐熱能力顯著降低。楊桂梅等［30］研究2株分離自豬腸道的益生性屎腸球菌E1和E7對(duì)pH、膽鹽及溫度的耐受特性，結(jié)果顯示菌株E1和E7在pH=2作用2 h后仍能檢測(cè)到活菌;膽鹽濃度升高至0.6%時(shí)，活菌數(shù)降到102.5 CFU/mL。

細(xì)菌的逆境生存機(jī)制之一是適應(yīng)反應(yīng)，即當(dāng)細(xì)胞暴露于適度逆境下，細(xì)菌可獲得對(duì)更嚴(yán)峻逆境的抗逆性。此種應(yīng)激反應(yīng)使細(xì)菌獲得在致死環(huán)境下生存的可能。另一逆境生存機(jī)制是交叉保護(hù)。逆境條件下，細(xì)菌不僅獲得對(duì)該逆境的抗性，同時(shí)表現(xiàn)出對(duì)另一不相關(guān)逆境的抗性。在與不斷變化的周圍環(huán)境抗?fàn)庍M(jìn)程中，細(xì)菌已擁有對(duì)逆境進(jìn)行檢測(cè)、監(jiān)控和反應(yīng)精致系統(tǒng)［31-32］。根據(jù)細(xì)菌此種特性，采用漸進(jìn)式改變菌株生長(zhǎng)環(huán)境，馴化篩選抗逆性優(yōu)良菌株，具有目標(biāo)明確、操作簡(jiǎn)便以及篩選的菌株遺傳性狀穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，在工業(yè)生產(chǎn)上是一種行之有效的育種技術(shù)。本研究通過逐步提高培養(yǎng)基的酸度、膽鹽濃度及培養(yǎng)高溫，淘汰抵抗性弱的菌株，富集耐受低pH、高濃度膽鹽及高溫的變異株，使菌株在 pH=1.5～3內(nèi)存活率達(dá)38% ～47%，在膽鹽濃度0.03% ～0.3%時(shí)存活率在85% ～90%之間，在50℃時(shí)仍有66%的存活率。

革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐酸性機(jī)制包括應(yīng)激蛋白表達(dá)、質(zhì)子泵過量表達(dá)、質(zhì)子消耗代謝途徑修飾等［33］。Van de Guchte 等［34］認(rèn)為乳酸桿菌的耐酸性是通過消耗質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力進(jìn)行酸應(yīng)激反應(yīng)，依賴ATP將質(zhì)子外排至胞外，質(zhì)子移位膜 ATP酶(F0F1-ATP酶)既可利用質(zhì)子合成 ATP，也能經(jīng)ATP水解將質(zhì)子外排。L.acidophilus處于低pH條件下，atp基因轉(zhuǎn)錄被激活，引起F0F1-ATP酶活性增強(qiáng)，而使菌株的耐酸性增強(qiáng)［34］。添加外源性天冬氨酸也能增加干酪乳桿菌(L.casei)耐酸性，原因在于天冬氨酸使細(xì)胞糖酵解和三羧酸循環(huán)途徑的中間產(chǎn)物含量升高，從而產(chǎn)生更多的ATP，其通過水解將胞內(nèi)質(zhì)子排出胞外［35］。在德氏乳桿菌保加利亞菌(Lactobacillus delbrueckii sub sp.bulgaricus)中，酸性階段菌株的組氨酸激酶和應(yīng)答調(diào)控蛋白均被誘導(dǎo)表達(dá)。由此構(gòu)建該菌株應(yīng)答調(diào)控蛋白JN675228/JN675229的基因突變體，顯示突變菌株的耐酸性強(qiáng)于對(duì)照菌株［36-37］。同樣乳酸菌對(duì)膽鹽的應(yīng)激反應(yīng)也是一個(gè)復(fù)雜的生理過程。Lee等［38］研究指出膽鹽濃度達(dá)1.2 g/L以上時(shí)，對(duì)羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)生長(zhǎng)有明顯抑制作用，通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示在不同濃度膽鹽培養(yǎng)基生長(zhǎng)的菌株蛋白質(zhì)組成存在明顯差異，其中包括糖代謝、核苷酸代謝、氨基酸合成以及轉(zhuǎn)錄翻譯等蛋白質(zhì)。在膽鹽培養(yǎng)基中，菌株L.reuteri CRL 1098的細(xì)胞膜與細(xì)胞壁存在部分剝離，細(xì)胞收縮等現(xiàn)象。膽鹽抗性菌株 L.delbrueckii sub sp.lactis 200的10對(duì)小鼠腸道黏附性減弱。研究證實(shí)在膽鹽存在下，蛋白質(zhì)延長(zhǎng)因子Tu的表達(dá)被抑制，此因子與腸道黏附蛋白質(zhì)的合成有關(guān)［39-41］。L.acidophilus等益生菌多為不含芽孢的厭氧或兼性厭氧菌，抗逆性差。因此，優(yōu)質(zhì)的益生菌不僅應(yīng)具備在生產(chǎn)、儲(chǔ)存條件下保證有大量活菌數(shù)的特性，同時(shí)須能通過宿主胃環(huán)境，克服其腸道其他菌的拮抗與抑制作用，競(jìng)爭(zhēng)性地以充足活菌到達(dá)腸道，并能定殖于腸黏膜。本研究馴化的菌株La-5c較從仔豬腸道分離純化的原始菌株La-5的耐酸、膽鹽及高溫能力有大幅度提高。但該菌株能否在仔豬腸道黏膜定殖、對(duì)仔豬的生長(zhǎng)發(fā)育與抗病性的影響以及喂飼仔豬的適宜劑量等還有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

從仔豬新鮮糞便分離純化的菌株La-5采用形態(tài)、生理生化、16S rRNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育樹分析，確定為L(zhǎng).acidophilus。通過逐步馴化后，馴化菌株La-5c對(duì)酸、膽鹽、高溫的耐受能力明顯高于原始菌株La-5。

［1］ 程學(xué)慧，彭健.早期斷奶仔豬腸道損傷與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控［J］.飼料博覽，2001(9):26-28.

［2］ CHYTILOVá M，MUDRO?OVá D，NEMCOVá R，et al.Anti-inflammatory and immunoregulatory effects of flax-seed oil and Lactobacillus plantarum-BiocenolTMLP96 in gnotobiotic pigs challenged with enterotoxigenic Escherichia coli［J］.Research in Veterinary Science，2013，95(1):103-109.

［3］ TRASINO S E，DAWSON H D，URBAN J F，Jr.，et al.Feeding probiotic Lactobacillus paracasei to Ossabaw pigs on a high-fat diet prevents cholesteryl-ester accumulation and LPS modulation of the Liver X receptor and inflammatory axis in alveolar macrophages［J］.The Journal of Nutritional Biochemistry，2013，24(11):1931-1939.

［4］ 趙瑞香，李元瑞，郭洋.嗜酸乳桿菌抑菌特性的研究［J］.中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2001，13(6):318-319.

［5］ SCAPIN D，GRANDO W F，ROSSI E M，et al.Antagonistic activity of Lactobacillus acidophilus LA10 against Salmonella enterica serovar Enteritidis SE86 in mice［J］.Brazilian Journal of Microbiology，2013，41(1):57-61.

［6］ NAKAZATO G，PAGANELLI F L，LAGO JC，et al.Lactobacillus acidophilus decreases Salmonella Typhimurium invasion in vivo［J］.Journal of Food Safety，2011，31(2):284-289.

［7］ LIN W H，YU B，JANG SH，et al.Different probiotic properties for Lactobacillus fermentum strains isolated from swine and poultry［J］.Anaerobe，2007，13(3/4):107-113.

［8］ LIN C K，TSAIH C，LIN PP，et al.Lactobacillus acidophilus LAP5 able to inhibit the Salmonella choleraesuis invasion to the human Caco-2 epithelial cell［J］.Anaerobe，2008，14(5):251-255.

［9］ AWEEN M M，HASSAN Z，MUHIALDIN B J，et al.Antibacterial activity of Lactobacillus acidophilus strains isolated from honey marketed in malaysia against selected multiple antibiotic resistant(MAR)gram-positive bacteria［J］.Journal of Food Science，2012，77(7):M364-M371.

［10］ CHEN L H，LIU W W，LI Y M，et al.Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 attenuates the atherosclerotic progression through modulation of oxidative stress and inflammatory process［J］.International Immunopharmacology，2013，17(1):108-115.

［11］ KUMAR A，VLASOVA A N，LIU Z，et al.In vivo gut transcriptome responses to Lactobacillus rhamnosus GG and Lactobacillus acidophilus in neonatal gnotobiotic piglets［J］.Gut Microbes，2014，5(2):152-164.

［12］ LIU F N，WEN K，LI G H，et al.Dual functions of Lactobacillus acidophilus NCFM as protection against rotavirus diarrhea［J］.Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition，2014，58(2):169-176.

［13］ VINDEROLA C G，MEDICI M，PERDIGóN G.Relationship between interaction sites in the gut，hydrophobicity，mucosal immunomodulating capacities and cell wall protein profiles in indigenous and exogenous bacteria［J］.Journal of Applied Microbiology，2004，96(2):230-243.

［14］ AFRC R F.Probiotics in man and animals［J］.Journal of Applied Bacteriology，1989，66(5):365-378.

［15］ SAREM-DAMERDJI L，SAREM F，MARCHAL L，et al.In vitro colonization ability of human colon mucosa by exogenous Lactobacillus strains［J］.FEMS Microbiology Letters，1995，131(2):133-137.

［16］ BERNET M F，BRASSART D，NEESER J R，et al.Lactobacillus acidophilus LA 1 binds to cultured human intestinal cell lines and inhibits cell attachment and cell invasion by enterovirulent bacteria［J］.Gut，1994，35(4):483-489.

［17］ YUN B，OH S，GRIFFITHS M W.Lactobacillus acidophilus modulates the virulence of Clostridium difficile［J］.Journal of Dairy Science，2014，97(8):4745-4758.

［18］ 凌代文，東秀珠.乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法［M］.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，1999:，117-127.

［19］ 東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)［M］.北京:科學(xué)出版社，2001:，289-294.

［20］ 田芬，陳俊亮，霍貴成.嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌的主代謝產(chǎn)物分析［J］.中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2013，13(6):220-226.

［21］ ANJUM N，MAQSOOD S，MASUD T，et al.Lactobacillus acidophilus:characterization of the species and application in food production［J］.Critical Reviews in Food Science and Nutrition，2014，54(9):1241-1251.

［22］ KANDLER O，WEISS N.Genus Lactobacillus Beijerinck 1901，212A-L［C］//SNEATH P H A，MAIR N C，SHARPE M E，et al.Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology.Vol.2.Baltimore:The Williams and Wilkins Co.1986:1209-1234.

［23］ ALTERMANN E，RUSSELL W M，AZCARATEPERIL M A，et al.Complete genome sequence of the probiotic lactic acid bacterium Lactobacillus acidophilus NCFM［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2005，102(11):3906-3912.

［24］ VAN DER WAAIJ D，BERGHUIS-DE VRIES J M，LEKKERKERK-VAN DER WEES J E C.Colonization resistance of the digestive tract in conventional and antibiotic-treated mice［J］.Journal of Hygiene，1971，69(3):405-411.

［25］ LIDBECK A，GUSTAFSSON J，NORD C E.Impact of Lactobacillus acidophilus supplements on the human oropharyngeal and intestinal microflora［J］.Scandinavian Journal of Infectious Diseases，1987，19(5):531-537.

［26］ 周其家，朱翔宇.仔豬消化環(huán)境與營(yíng)養(yǎng)代謝調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用［J］.畜牧獸醫(yī)科技信息，2011(5):56-57.

［27］ 容庭，何前，陳莊，等.屎腸球菌及其在仔豬生產(chǎn)上的研究現(xiàn)狀［J］.飼料工業(yè)，2008，29(22):55-57.

［28］ 趙曉明，李世丁，郭鳳英.早期斷奶仔豬消化道環(huán)境變化與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控［J］.飼料工業(yè)，2003，24(4):45-46.

［29］ 吳惠芬，毛勇勝，姚文，等.2株豬源乳酸菌對(duì)低pH值和膽鹽耐受性及熱穩(wěn)定性研究［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，24(3):265-268.

［30］ 楊桂梅，朱永紅，蘇娜，等.2株豬源益生性腸球菌對(duì)酸和膽鹽及熱的耐受性研究［J］.北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，23(4):29-32.

［31］ FOSTER J W，HALL H K.Inducible pH homeostasis and the acid tolerance response of Salmonella typhimurium［J］.Journal of Bacteriology，1991，173(16):5129-5135.

［32］ HECKER M，SCHUMANN W，V?LKER U.Heatshock and general stress response in Bacillus subtilis［J］.Molecular Microbiology，1996，19(3):417-428.

［33］ COTTER PD，HILL C.Surviving the acid test:responses of gram-positive bacteria to low pH［J］.Microbiology and Molecular Biology Reviews，2003，67(3):429-453.

［34］ VAN DE GUCHTE M，SERROR P，CHERVAUX C，et al.Stress responses in lactic acid bacteria［J］.Antonie Van Leeuwenhoek，2002，82(1/4):187-216.

［35］ WU C D，ZHANG J，DU G C，et al.Aspartate protects Lactobacillus casei against acid stress［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2013，97(9):4083-4093.

［36］ 劉偉，崔艷華，曲曉軍.乳酸菌雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2011(5):38-42.

［37］ CUI Y H，LIU W，QU X J，et al.A two component system is involved in acid adaptation of Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus［J］.Microbiological Research，2012，167(5):253-261.

［38］ LEE K B，LEE H G，CHOIC Y J.Proteomic analysis of the effect of bile salts on the intestinal and probiotic bacterium Lactobacillus reuteri［J］.Journal of Biotechnology，2008，137(1/2/3/4):14-19.

［39］ TARANTO M P，PEREZ-MARTINEZ G，F(xiàn)ONT DE VALDEZ G.Effect of bile acid on the cell membrane functionality of lactic acid bacteria for oral administration［J］.Research in Microbiology，2006，157(8):720-725.

［40］ BURNS P，SáNCHEZ B，VINDEROLA G，et al.Inside the adaptation process of Lactobacillus delbrueckii subsp lactis to bile［J］.International Journal of Food Microbiology，2010，142(1/2):132-141.

［41］ SICILIANO R A，CACACE G，MAZZEO M F，et al.Proteomic investigation of the aggregation phenomenon in Lactobacillus crispatus［J］.Biochimica et Biophysica Acta(BBA):Proteins and Proteomics，2008，1784(2):335-342.