武明欣 王際英 李寶山 張德瑞 蔡勝昌 王世信 孫永智 張利民*

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306;2.山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省海洋資源與環(huán)境研究院，煙臺(tái) 264006;3.山東升索漁用飼料研究中心，煙臺(tái) 265500)

飼用酶制劑是一種以酶為主要功能性因子，通過(guò)特定生產(chǎn)工藝加工而成的飼料添加劑。飼用酶制劑可刺激內(nèi)源消化酶分泌，降低腸道食糜黏度，提高飼料轉(zhuǎn)化率;減少或消除飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子;提高機(jī)體免疫抵抗能力，促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物健康生長(zhǎng)［1］。目前，酶制劑在飼料中的應(yīng)用主要集中于畜禽方面，在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用僅見(jiàn)于草魚(yú)［2－3］、異育銀鯽［4－5］、尼羅羅非魚(yú)［6］、大黃魚(yú)［7－8］等少數(shù)種類，在刺參上的應(yīng)用鮮有報(bào)道。

刺參屬海參綱(Holothuroidea)，海參科(Holothuriidae)。近年來(lái)隨著刺參食用和藥用價(jià)值不斷被發(fā)現(xiàn)［9］，其越來(lái)越受到養(yǎng)殖者和消費(fèi)者青睞。隨著刺參養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，各種病害及環(huán)境脅迫影響也愈漸顯著，給刺參養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大損失。酶制劑作為一種綠色環(huán)保、無(wú)藥物殘留的新型飼料添加劑，可有效提高養(yǎng)殖動(dòng)物的生長(zhǎng)性能和疾病抵抗能力，得到了許多研究者的關(guān)注［10］。刺參飼料中含有大量的纖維素和半纖維素，很難被直接吸收利用。酶制劑能破壞植物細(xì)胞壁，將植物纖維分解為容易被吸收利用的小分子多糖或葡萄糖，促進(jìn)內(nèi)源酶的分泌，提高飼料利用率［11］。本試驗(yàn)擬通過(guò)研究幾種單體酶及其復(fù)合酶對(duì)刺參生長(zhǎng)、體成分、免疫能力及氨氮脅迫下免疫酶活力和熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)含量的影響，以期為酶制劑在刺參配合飼料中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，促進(jìn)綠色飼料添加劑的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)5個(gè)組，分別為對(duì)照組、木聚糖酶組、纖維素酶組、淀粉酶組和復(fù)合酶組，每個(gè)組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)放養(yǎng)體重(4.02±0.04)g的幼參40頭。試驗(yàn)所用木聚糖酶、纖維素酶和淀粉酶活力分別為10 000、1 000、2 000 U/g。共配制粗蛋白質(zhì)含量為20%的5種試驗(yàn)飼料，首先配制不添加酶制劑的基礎(chǔ)飼料作為對(duì)照，然后分別以0.04%木聚糖酶、0.10% 纖維素酶、0.01% 淀粉酶、0.15%復(fù)合酶(由0.04%木聚糖酶、0.10%纖維素酶和0.01%淀粉酶組成)等量替代基礎(chǔ)飼料中的α－淀粉。飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。固體原料超微粉碎過(guò)200目標(biāo)準(zhǔn)篩，按配比稱重，加入新鮮魚(yú)油及適量蒸餾水混勻，用小型顆粒飼料擠壓機(jī)制成直徑為0.3 cm的顆粒，60℃烘干，用小型粉碎機(jī)破碎，篩選粒度在80～100目之間的顆粒備用。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(air-dry basis) %

續(xù)表1

1.2 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗(yàn)在山東省海洋資源與環(huán)境研究院東營(yíng)試驗(yàn)基地循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行，試驗(yàn)用刺參為該基地當(dāng)年繁育的同一批參苗。試驗(yàn)開(kāi)始前，將1 000頭刺參幼參放養(yǎng)于養(yǎng)殖系統(tǒng)中，暫養(yǎng)15 d，期間投喂基礎(chǔ)飼料，待其完全適應(yīng)飼養(yǎng)條件后，選擇體質(zhì)健壯、體重(4.02±0.04)g的刺參幼參600頭，平均放養(yǎng)于15個(gè)圓柱形玻璃鋼養(yǎng)殖桶中。每種飼料投喂3個(gè)養(yǎng)殖桶，試驗(yàn)期為56 d。試驗(yàn)在微流水環(huán)境中進(jìn)行，采用充氣增氧，保證溶氧濃度＞7 mg/L，控制水溫在18～20 ℃，pH 7.8～8.2，鹽度24 ～26，亞硝酸氮濃度 ＜0.05 mg/L、氨氮濃度 ＜0.05 mg/L。養(yǎng)殖試驗(yàn)持續(xù)56 d，每天投喂2次(08:00、16:30)，日投喂量為刺參體重的2%，根據(jù)試驗(yàn)刺參攝食情況及時(shí)調(diào)整投喂量。每隔2 d吸底1次，用虹吸法將殘餌及糞便吸出。

1.3 樣品收集

試驗(yàn)結(jié)束后，禁食48 h，記錄每桶刺參總數(shù)并稱量總重，用于成活率、增重率及特定生長(zhǎng)率的計(jì)算。每桶取10頭刺參，用濾紙輕輕吸干體表水分，稱體重，待其自然舒展后量體長(zhǎng)，用于肥滿度的計(jì)算。用2 mL無(wú)菌注射器抽取體腔液后，置冰盤上解剖，分別稱量體壁與腸道重量，并測(cè)量腸道長(zhǎng)度。體腔液在4℃條件下，以3 000 r/min離心15 min，取上清液分裝于2 mL的離心管中，同體壁、腸道樣品一同保存于－80℃冰箱，待測(cè)。

1.4 氨氮脅迫試驗(yàn)

樣品收集后，封閉循環(huán)水系統(tǒng)，用氯化銨(NH4Cl)調(diào)節(jié)養(yǎng)殖水氨氮濃度約為5 mg/L，繼續(xù)飼養(yǎng)試驗(yàn)刺參 5 d，并分別在試驗(yàn)的 0、24、48、72、96、120 h采集試驗(yàn)刺參的體腔液，用于免疫酶活力和HSP70含量的測(cè)定。

1.5 測(cè)定指標(biāo)和方法

1.5.1 生長(zhǎng)指標(biāo)

1.5.2 飼料及體壁基本營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定

飼料及體壁基本營(yíng)養(yǎng)成分采用常規(guī)方法測(cè)定:干物質(zhì)含量采用105℃烘干至恒重法(GB/T 6435—2006);粗蛋白質(zhì)含量采用杜馬斯燃燒法(Leco-FP528);粗脂肪含量采用索氏抽提法(GB/T 6433—1994);粗灰分含量采用550℃馬福爐灼燒法(GB/T 6438—2007);木聚糖含量采用分光光度法;粗纖維含量采用過(guò)濾法(GB/T 6434—2006);淀粉含量采用旋光法(GB/T 20194—2006);能量采用燃燒法(PARR，6100)。

1.5.3 免疫酶活力的測(cè)定

溶菌酶(LZM)活力采用空白對(duì)照比濁法測(cè)定;超氧化物歧化酶(SOD)活力采用羥胺法測(cè)定，定義為每毫升反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為1個(gè)活力單位(U);過(guò)氧化氫酶(CAT)活性采用可見(jiàn)光分光光度計(jì)法測(cè)定，定義為每毫升體腔液每秒鐘分解1μmol的過(guò)氧化氫(H2O2)的量為1個(gè)活力單位(U)。以上指標(biāo)均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.5.4 HSP70 含量的測(cè)定

HSP70含量采用上海拜沃生物科技有限公司的試劑盒以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法進(jìn)行測(cè)定。將標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣品加入到純化的海參HSP70單克隆抗體包被的微孔板中，加入酶聯(lián)親和物，37℃孵育60 min，洗滌除去未結(jié)合的成分。依次加入底物 A 和 B，底物 3，3'，5，5'－ 四甲基聯(lián)苯胺(TMB)在辣根過(guò)氧化物酶(HRP)催化下先轉(zhuǎn)化為藍(lán)色后變?yōu)辄S色。在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度(OD)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的OD值計(jì)算樣品中HSP70的含量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007及SPSS 11.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，差異顯著(P＜0.05)時(shí)用Duncan氏法進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果

2.1 酶制劑對(duì)刺參生長(zhǎng)性能的影響

由表2可見(jiàn)，飼料中添加木聚糖酶、纖維素酶和復(fù)合酶均能顯著提高刺參的增重率和特定生長(zhǎng)率(P＜0.05)，且添加木聚糖酶和復(fù)合酶的促生長(zhǎng)效果尤其明顯，其增重率分別比對(duì)照組提高了17.38%和20.75%。木聚糖酶組的臟體比和腸長(zhǎng)比均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，纖維素酶組的臟體比顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，淀粉酶組的肥滿度顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，復(fù)合酶組的肥滿度、臟體比、腸體比和腸長(zhǎng)比均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。飼料中添加單體酶和復(fù)合酶對(duì)成活率也有一定提高，但影響不顯著(P＞0.05)。

表2 酶制劑對(duì)刺參生長(zhǎng)性能的影響Table 2 Effects of enzyme preparation on growth performance of Apostichopus japonicus

2.2 酶制劑對(duì)刺參體壁基本營(yíng)養(yǎng)成分的影響

由表3可見(jiàn)，飼料中添加不同酶制劑對(duì)刺參體壁水分含量無(wú)顯著影響(P＞0.05)，但添加木聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶和復(fù)合酶均顯著提高了體壁粗蛋白質(zhì)和粗灰分的含量(P＜0.05)，添加淀粉酶和復(fù)合酶均顯著提高了體壁粗脂肪的含量(P＜0.05)。

表3 酶制劑對(duì)刺參體壁基本營(yíng)養(yǎng)成分的影響Table 3 Effects of enzyme preparation on basal nutritional components of body wall of Apostichopus japonicas %

2.3 酶制劑對(duì)刺參免疫能力的影響

由表4可見(jiàn)，飼料中添加木聚糖酶、纖維素酶和復(fù)合酶均顯著提高了體腔液中過(guò)氧化氫酶的活力(P＜0.05);添加淀粉酶顯著提高了體腔液中溶菌酶、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶活力(P＜0.05)。體腔液中溶菌酶和超氧歧化酶活力均以淀粉酶組最高，過(guò)氧化氫酶活力以復(fù)合酶組最高。

表4 酶制劑對(duì)刺參體腔液中免疫酶活力的影響Table 4 Effects of enzyme preparation on immune enzyme activities in coelomic fluid of Apostichopus japonicus

2.4 酶制劑對(duì)氨氮脅迫下刺參體腔液中免疫酶活力和HSP70含量的影響

由圖1可見(jiàn)，氨氮脅迫過(guò)程中各組刺參體腔液中溶菌酶活力的總體趨勢(shì)是先升高后降低，對(duì)照、木聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶、復(fù)合酶組最大值分別出現(xiàn)在72、72、96、96 和 96 h。其中，淀粉酶、復(fù)合酶組的最大值要高于其余各組。氨氮脅迫過(guò)程中各組刺參體腔液中SOD活力均先升高，并均在24 h達(dá)到最大值，之后降低并于48 h后趨于穩(wěn)定，且其穩(wěn)定值略低于初始值。氨氮脅迫過(guò)程中各組刺參體腔液中CAT活力均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，并均在96 h達(dá)到最大值，其中淀粉酶組的最大值要高于其他各組。

氨氮脅迫下，試驗(yàn)初期復(fù)合酶組刺參體腔液中HSP70含量明顯高于其他各組。木聚糖酶組刺參體腔液中HSP70的含量呈現(xiàn)一直升高的趨勢(shì)，其余各組均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。復(fù)合酶組體腔液中HSP70含量比其他組率先達(dá)到最高點(diǎn)，且在96 h后趨于穩(wěn)定。對(duì)照、纖維素酶、淀粉酶組體腔液中HSP70含量于96 h達(dá)到最大值。除纖維素酶組外，其余加酶組體腔液中HSP70含量的最大值均高于對(duì)照組。

圖1 氨氮脅迫過(guò)程中刺參體腔液溶菌酶、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶活力及HSP70含量的變化Fig.1 Changes of LZM，SOD and CAT activities and HSP70 content in coelomic fluid under the stress of ammonia nitrogen of Apostichopus japonicus

3 討論

3.1 酶制劑對(duì)刺參生長(zhǎng)性能和體成分的影響

本研究表明，飼料中添加酶制劑顯著提高了刺參的增重率和特定生長(zhǎng)率，這與在鯽魚(yú)［12］、尼羅羅非魚(yú)［13－15］、黃河鯉［16］和大西洋鮭［17］上的研究結(jié)果相一致。酶制劑促進(jìn)刺參生長(zhǎng)，可能有以下幾方面原因:1)飼料中添加木聚糖酶能有效降低腸道食糜黏度，降解非淀粉質(zhì)抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高養(yǎng)殖動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，從而改善養(yǎng)殖動(dòng)物的生產(chǎn)性能［18－19］。2)纖維素酶能破壞細(xì)胞壁、降低飼料密集黏度，同時(shí)刺激內(nèi)源酶的分泌，從而提高水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的消化吸收［20］。3)飼料中添加淀粉酶起作用的主要為α－淀粉酶和糖化酶。α－淀粉酶為內(nèi)切酶，將淀粉大分子水解成易溶解的中等和低分子物質(zhì)，有利于糖化酶的水解。糖化酶為內(nèi)切酶，其活性的高低直接影響到動(dòng)物的生長(zhǎng)［21］。4)復(fù)合酶綜合了幾種單體酶的作用，又不僅僅是單個(gè)酶作用的復(fù)合。鄧岳松［22］在研究中發(fā)現(xiàn)由纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶等組成的復(fù)合酶對(duì)飼料中的一些抗?fàn)I養(yǎng)因子具有滅活作用，可消除草魚(yú)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收困難，從而提高魚(yú)體的生長(zhǎng)性能。黃峰等［23］研究表明，添加復(fù)合酶促進(jìn)異育銀鯽生長(zhǎng)的效果稍好于單一添加木聚糖酶，這可能得益于復(fù)合酶的疊加效應(yīng)和協(xié)同效應(yīng)。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，添加復(fù)合酶的促生長(zhǎng)效果優(yōu)于添加單體酶。

本研究表明，飼料中添加酶制劑對(duì)刺參體壁粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分含量均有顯著影響。這與王俊麗等［13］、黃燕華等［24］的研究結(jié)果相一致。飼料中添加木聚糖酶能提高腸道蛋白酶活力，增加腸道內(nèi)游離氨基酸和小肽數(shù)量，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成和積累。同時(shí)，添加木聚糖酶降低了腸道食糜黏度，腸道活動(dòng)增強(qiáng)，從而促進(jìn)了對(duì)脂肪的吸收，增加了體壁中脂肪的沉積。添加木聚糖酶使腸道中低聚木糖增加，低聚木糖的代謝降低了腸道pH，增強(qiáng)了鈣鹽的溶解性，促進(jìn)了鈣的吸收，從而提高了粗灰分的含量［13］。而鐘國(guó)防等［6］、張璐等［7］的研究證明，飼料中添加酶制劑對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物的基本營(yíng)養(yǎng)成分均無(wú)顯著影響。這可能與添加酶的種類、活力及養(yǎng)殖動(dòng)物種類有關(guān)。

3.2 酶制劑對(duì)刺參免疫能力的影響

刺參沒(méi)有完善的特異性免疫，溶菌酶、超氧化物歧化酶及過(guò)氧化氫酶在其免疫及抗氧化過(guò)程中起著重要作用［25］。溶菌酶活力的高低直接反映出溶菌能力的強(qiáng)弱［26］，超氧化物歧化酶活力與生物體免疫水平密切相關(guān)［27］，過(guò)氧化氫酶保護(hù)機(jī)體組織免受損害［25］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加酶制劑對(duì)刺參各免疫指標(biāo)均有促進(jìn)作用。其中，木聚糖酶組體腔液中溶菌酶和過(guò)氧化氫酶活力與對(duì)照組相比有顯著提高;淀粉酶體腔液中溶菌酶、超氧化物歧化酶及過(guò)氧化氫酶活力均較對(duì)照組有顯著提高。這與黃燕華等［24］、鐘國(guó)防等［15］、黃峰等［4－5］的研究結(jié)果一致。黃燕華等［24］研究證實(shí)，飼料中添加淀粉酶能顯著提高對(duì)蝦血清超氧化物歧化酶活力。鐘國(guó)防等［15］研究表明，在尼羅羅非魚(yú)飼料中添加木聚糖酶和復(fù)合酶能顯著提高魚(yú)體肝臟和脾臟中超氧化物歧化酶和溶菌酶活力。目前關(guān)于刺參體腔液中溶菌酶、超氧化物歧化酶及過(guò)氧化氫酶正?；盍Ψ秶难芯坎⒉怀渥悖绕涫敲富盍ι叩臋C(jī)理尚不清楚，因此不能單純依據(jù)酶活力來(lái)評(píng)定其免疫及抗氧化能力的強(qiáng)弱，但是在大菱鲆等魚(yú)類上的研究表明，魚(yú)體抗病能力的提高往往伴隨著溶菌酶、超氧化物歧化酶及過(guò)氧化氫酶活力的升高［28］，由此可以推測(cè)在一定范圍內(nèi)，上述3種酶活力的升高提高了機(jī)體的抗逆性。

3.3 酶制劑對(duì)氨氮脅迫下刺參體腔液中免疫酶活力和HSP70含量的影響

熱休克蛋白是一種應(yīng)激反應(yīng)的指示器，它能使細(xì)胞處于保護(hù)狀態(tài)，它的產(chǎn)生能使細(xì)胞抵抗致死性損傷，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)外界損害的耐受力［25］。本試驗(yàn)過(guò)程中，在5 mg/L的氨氮濃度脅迫下，各組刺參體腔液中免疫酶活力均表現(xiàn)出一定的上升趨勢(shì)。這主要是由于氨氮脅迫增強(qiáng)了刺參體內(nèi)水解系統(tǒng)的活性，表現(xiàn)出明顯的毒物興奮作用［29］。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加酶制劑能提高刺參的免疫性能，因此在短時(shí)間內(nèi)各加酶組表現(xiàn)出比對(duì)照組更迅速和強(qiáng)烈的免疫抵抗反應(yīng)。隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，刺參自身的水解系統(tǒng)活性降低，抵抗力下降［25］，因此各組免疫酶活力隨后表現(xiàn)出下降趨勢(shì)。氨氮脅迫72 h內(nèi)，各組刺參體腔液中HSP70含量均呈上升趨勢(shì)。這說(shuō)明，刺參通過(guò)提高HSP70的表達(dá)量，增強(qiáng)抗逆性，以適應(yīng)氨氮脅迫的環(huán)境［25］。氨氮脅迫開(kāi)始前(即0 h)，復(fù)合酶組刺參體腔液中HSP70的含量明顯高于其他各組，其次為木聚糖酶組。氨氮脅迫48 h內(nèi)，纖維素酶、淀粉酶和復(fù)合酶組刺參體腔液中HSP70含量與對(duì)照組相比表現(xiàn)出較快的升高，且復(fù)合酶組更早的達(dá)到最高點(diǎn)。這可能與酶制劑促進(jìn)刺參自身免疫和脅迫抵抗有關(guān)。

4 結(jié)論

①飼料中適量添加木聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶或其復(fù)合酶均能提高刺參的生長(zhǎng)，提高免疫能力，并對(duì)刺參體壁粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分的含量也有一定影響，且木聚糖酶的促生長(zhǎng)作用更明顯，而淀粉酶的促免疫作用更明顯。

②氨氮脅迫下，飼料中適量添加聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶或其復(fù)合酶均能使刺參更迅速和強(qiáng)烈的表現(xiàn)出免疫抵抗反應(yīng)。

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