馬 濤 刁其玉

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

表觀遺傳學(xué)一直是遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)，指在基因組序列不發(fā)生改變的情況下，基因的表達(dá)發(fā)生可遺傳的變異，是環(huán)境因素和細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)相互作用的結(jié)果，主要包括組蛋白乙?；⒘姿峄?、泛素化，DNA甲基化以及 microRNA調(diào)控等［1-2］。盡管目前已經(jīng)確定營(yíng)養(yǎng)素具有調(diào)控表觀遺傳的作用，但對(duì)于營(yíng)養(yǎng)素調(diào)控表觀遺傳內(nèi)在機(jī)制的研究相對(duì)較少，就畜禽而言，相關(guān)研究更是處在起步階段。

組蛋白是真核生物染色體的基本結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，是一類小分子堿性蛋白質(zhì)。決定組蛋白乙酰化狀態(tài)的酶有2類:組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase，HAT)和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)。HAT的作用是對(duì)組蛋白N端進(jìn)行乙?；揎?，使核小體結(jié)構(gòu)松散、激活基因轉(zhuǎn)錄;HDAC則對(duì)其N端進(jìn)行去乙酰化修飾，抑制基因轉(zhuǎn)錄［3］。目前在哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)的HDAC根據(jù)其與酵母的同源性可分為3種類型:Ⅰ型包括 HDAC1、HDAC2、HDAC3 和 HDAC8，分子質(zhì)量在42～45 ku，該類型全部位于細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控組蛋白乙?；揎?Ⅱ型包括HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC9 和 HDAC10，分子質(zhì)量為120～130 ku，主要位于細(xì)胞質(zhì)，但可在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核間穿梭，調(diào)控組蛋白及非組蛋白的乙?；揎?Ⅲ型則與細(xì)胞衰老和能量代謝的調(diào)節(jié)相關(guān)［4］。HAT和HDAC作用的平衡一旦被打破，即出現(xiàn)乙?；Ш猓瑢?dǎo)致腫瘤的發(fā)生。研究表明丁酸和部分植物提取物(如姜黃素、蘿卜硫素等)都能夠使組蛋白高度乙?；?，具有HDAC抑制劑的作用［5］。

1 丁酸對(duì)組蛋白乙?；挠绊?/h2>

揮發(fā)性脂肪酸(VFA)或短鏈脂肪酸(SCFA)是目前具有代表性的“營(yíng)養(yǎng)素—表觀遺傳—表現(xiàn)型”實(shí)例，SCFA為哺乳動(dòng)物胃腸道微生物發(fā)酵飼糧中碳水化合物后的產(chǎn)物，能夠?yàn)榉雌c動(dòng)物提供高達(dá)70%的能量需要［6］，其中乙酸和丙酸濃度往往較高，也是主要的能量來(lái)源，而丁酸濃度較低。研究表明丁酸除了作為一種能量來(lái)源外，還起到調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、死亡以及誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和凋亡的作用［7-9］。以丁酸為例，其能夠使細(xì)胞組蛋白高度乙?；?。

為研究細(xì)胞生長(zhǎng)是否受丁酸的抑制，Li等［10］使用2.5～10.0 mmol/L濃度的丁酸鈉處理牛腎(Madin Darby bovine kidney，MDBK)細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)丁酸鈉不僅導(dǎo)致細(xì)胞凋零，而且使細(xì)胞周期停滯在G1/S和M/G2的分界處，且隨丁酸濃度的升高，細(xì)胞凋零數(shù)量呈正相關(guān)升高(R2=0.948 2)。牛腎細(xì)胞在經(jīng)丁酸鈉處理后，積累大量乙?；慕M蛋白，同時(shí)半胱天冬酶得到激活，半胱天冬酶是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵酶，由此揭示了丁酸導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯可能的機(jī)制，即丁酸作為HDAC抑制劑，能夠激活細(xì)胞中由于不適當(dāng)?shù)慕M蛋白去乙?；磉_(dá)受阻的基因(如腫瘤抑制基因)，該基因能夠終止非正常細(xì)胞的周期，促使其凋亡，防止發(fā)生惡變。與此相近，Das等［11］研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加1.0或5.0 mmol/L的丁酸鈉，能夠顯著提高豬成纖維細(xì)胞組蛋白乙酰化程度。

在體外細(xì)胞試驗(yàn)開展的同時(shí)，也有部分研究者通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)來(lái)研究丁酸對(duì)于機(jī)體組織組蛋白乙?；挠绊憽eu等［12］通過(guò)給大鼠飼喂5種不同形式的含高抗性淀粉(占飼糧總淀粉含量的46% ～53%)的飼糧，并通過(guò)注射氧化偶氮甲烷誘導(dǎo)結(jié)腸細(xì)胞DNA損傷，研究飼糧處理對(duì)大鼠結(jié)腸發(fā)酵及對(duì)DNA受損細(xì)胞的影響。結(jié)果表明，其中3種形式的淀粉飼糧能夠顯著提高大鼠結(jié)腸中丁酸濃度，并且增強(qiáng)對(duì)于DNA受損細(xì)胞的凋亡應(yīng)答，證明丁酸在動(dòng)物體內(nèi)同樣能夠起到誘導(dǎo)非正常細(xì)胞凋亡，防止細(xì)胞癌變的作用。

細(xì)胞周期受3類蛋白質(zhì)家族的調(diào)控，包括細(xì)胞周期蛋白、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑［13］。研究表明丁酸能夠下調(diào)人類小腸細(xì)胞周期蛋白D1的mRNA，以及成纖維細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)［14］，因此 Kien等［15］通過(guò)分別給仔豬飼喂乳果糖和向其盲腸內(nèi)灌注丁酸測(cè)定盲腸組織組蛋白乙?；潭?、細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)量以及細(xì)胞增殖情況，來(lái)研究體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果是否與體外試驗(yàn)相符，結(jié)果表明，飼喂乳果糖的仔豬盲腸內(nèi)丁酸濃度顯著升高，導(dǎo)致組蛋白乙?；潭壬?然而盲腸內(nèi)灌注丁酸顯著降低了組蛋白乙?；潭取?個(gè)試驗(yàn)中均能夠得出組蛋白乙?；潭扰c仔豬盲腸細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)量呈正相關(guān)的結(jié)論，與公認(rèn)的組蛋白乙?；軌蛞谆虮磉_(dá)的研究結(jié)果［14］相符。當(dāng)飼喂仔豬乳果糖產(chǎn)生“內(nèi)源”丁酸時(shí)，與體外細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果相同，即丁酸的HDAC抑制劑作用得到體現(xiàn)，乙?；潭群图?xì)胞周期蛋白D1表達(dá)量均高于對(duì)照組;但當(dāng)灌注“外源”丁酸時(shí)，則出現(xiàn)與體外相反的結(jié)果，乙酰化程度和細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)量均低于對(duì)照組。研究者將這一結(jié)果首先歸結(jié)于丁酸對(duì)于體外培養(yǎng)細(xì)胞的影響并不能反映體內(nèi)的生理情況，因?yàn)橄惹敖Y(jié)果表明，盲腸腸腔內(nèi)的丁酸濃度不隨丁酸進(jìn)入盲腸的速率以及丁酸在盲腸內(nèi)的吸收速率的變化而變化［16］，因此腸腔內(nèi)的丁酸濃度并不能反映供給腸細(xì)胞的丁酸濃度;其次飼喂乳果糖會(huì)造成盲腸中梭菌密度下降至原有的約1/16，微生物群落的變化也可能會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答來(lái)影響細(xì)胞增殖及組蛋白乙?；潭取?/p>

此外，Mátis等［17］研究了口服丁酸藥丸對(duì)雞肝臟組蛋白乙酰化和細(xì)胞色素相關(guān)酶活性的影響，亦旨在驗(yàn)證體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果是否能夠反映體外試驗(yàn)結(jié)果。分別給1日齡肉仔雞口腔灌注2種濃度［0.25或 1.25 g/(kg BW·d)］的丁酸藥丸連續(xù)5 d，隨后屠宰取肝臟細(xì)胞核及微粒體等組織，分別測(cè)定細(xì)胞核組蛋白乙?；潭纫约拔⒘ｓw中細(xì)胞色素相關(guān)酶活性。試驗(yàn)結(jié)果表明，雖然灌注丁酸能夠使肝臟組織細(xì)胞核組蛋白高度乙?；?，但細(xì)胞色素相關(guān)酶活性未發(fā)生變化，可見(jiàn)在實(shí)際生理?xiàng)l件下，丁酸并未體現(xiàn)出作為HDAC抑制劑在體外能夠影響細(xì)胞色素相關(guān)酶活性的作用［18］，這可能與飼糧營(yíng)養(yǎng)水平、飼料原料和環(huán)境等多方面因素有關(guān)。由此可見(jiàn)，丁酸對(duì)于動(dòng)物體內(nèi)組蛋白乙?；挠绊戇h(yuǎn)比體外對(duì)細(xì)胞的研究復(fù)雜的多，很多體外研究結(jié)果尚須體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

2 植物提取物對(duì)組蛋白乙酰化的影響

2.1 姜黃素(curcumin)

姜黃素是植物姜黃的主要成分，是印度和東南亞常用的一種香料，同時(shí)也具有抗炎癥和抗氧化的功能［19］，研究表明姜黃素能夠抑制HDAC1、HDAC3、以及 p300/CBP(屬于 HAT蛋白家族)，從而抑制細(xì)胞增殖［20］;Liu等［21］同樣證實(shí)姜黃素能夠抑制淋巴瘤胃細(xì)胞中Ⅰ型HDAC的表達(dá);在以小鼠為試驗(yàn)動(dòng)物的研究中，姜黃素能夠降低腫瘤的生長(zhǎng)，提高成神經(jīng)管細(xì)胞瘤小鼠的成活率，其潛在機(jī)制為降低了HDAC4的表達(dá)，提高微管蛋白乙酰化程度，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而促使腫瘤細(xì)胞凋亡［19］。

2.2 蘿卜硫素(sulforaphane)

蘿卜硫素是一類存在于花菜、甘藍(lán)、卷心菜中的植物化學(xué)素，能夠促進(jìn)異型生物質(zhì)代謝，從而誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯及凋亡［22］。目前開展的動(dòng)物試驗(yàn)相對(duì)有限，Myzak等［23］給小鼠口服 10 μmol的蘿卜硫素，發(fā)現(xiàn)6 h后其結(jié)腸黏膜HDAC活性顯著降低，免疫印跡結(jié)果同時(shí)表明組蛋白H3和H4的乙?；潭蕊@著升高，直到48 h恢復(fù)到正常水平;而長(zhǎng)期飼喂添加蘿卜硫素的飼糧的小鼠盲腸、結(jié)腸、前列腺、外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞的組蛋白乙?；骄仙Ｔ撗芯啃〗M另一研究結(jié)果表明，當(dāng)小鼠每天采食7.5μmol蘿卜硫素，前列腺和單核血細(xì)胞中HDAC活性相比對(duì)照組顯著降低［24］，從而證實(shí)了蘿卜硫素在小鼠體內(nèi)具有抑制HDAC活性的作用。

2.3 有機(jī)硫化合物

蔥屬植物包括大蒜、韭菜等主要的功能性成分為有機(jī)硫化合物，包括二烯丙基一硫醚(diallyl sulfide，DAS)、二烯丙基二硫醚(diallyl disulfide，DADS)、二烯丙基三硫醚(diallyl trisulfide，DATS)。有機(jī)硫化合物已被廣泛證實(shí)具有抗癌作用，其機(jī)制為能夠介導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和凋亡、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)等［25］。體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明，DADS能夠有效抑制異種轉(zhuǎn)移模型小鼠器官癌變以及腫瘤生長(zhǎng)，DADS及其代謝物S-烯丙半胱氨酸最終轉(zhuǎn)化成烯丙硫醇，DAS、DADS和DATS均為有效的HDAC 抑制劑［26］。

2.4 槲皮素(quercetin)

多酚具有廣泛的抗微生物和抗炎癥作用，槲皮素是一類主要存在于柑桔類和蕎麥中的生物黃酮。細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果表明，槲皮素能夠通過(guò)促進(jìn)組蛋白乙?；瘡亩_(dá)到抗腫瘤、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用［27-28］。動(dòng)物試驗(yàn)研究表明槲皮素能夠緩解降低經(jīng)致癌物二甲基苯蒽處理倉(cāng)鼠的腫瘤發(fā)生率、并顯著降低腫瘤生長(zhǎng)速度，該作用與槲皮素抑制HDAC1的作用呈顯著正相關(guān)［29］。

其他植物提取物包括茶多酚［30-31］、二吲哚甲烷［32］、大豆異黃酮［33］、異硫氰酸苯酯［34-35］、白藜蘆醇［36］等均具有HDAC抑制劑的作用，但上述提取物作為飼料添加劑成分對(duì)于動(dòng)物表觀遺傳的影響研究相對(duì)較少，甚至以小鼠或仔豬為模型動(dòng)物的研究報(bào)道也不多見(jiàn)，因此還有很大的研究空間。

3 潛在的HDAC抑制劑——維生素E

丁酸是已知的最小分子質(zhì)量的HDAC抑制劑，其分子由丙基和羧基組成，其中的丙基能夠和HDAC的活性基團(tuán)相匹配［37］，從而起到抑制HDAC的作用。生物素、α-硫鋅酸以及維生素E的代謝產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)上均具備類似于丁酸“丙基”的能夠與HDAC活性基團(tuán)相互作用的基團(tuán)［38］，因此上述飼糧營(yíng)養(yǎng)素可能也具有潛在的HDAC抑制劑的作用。

維生素E是一種常見(jiàn)的營(yíng)養(yǎng)添加劑，以8種不同的形式(α-、β-、γ-、δ-生育酚/生育三烯酚)存在于植物當(dāng)中，其中α-生育酚是自然界中分布最廣泛、含量最豐富、活性最高的維生素E形式，且其是人類和動(dòng)物體內(nèi)沉積的維生素E的主要形式［39］。研究表明，α-琥珀酸生育酚相對(duì)其他形式的維生素E能夠更有效地介導(dǎo)鼠細(xì)胞分化、抑制細(xì)胞增殖、促使細(xì)胞凋亡［40］。維生素 E作為一種營(yíng)養(yǎng)添加劑，能夠提高畜禽生產(chǎn)性能，但其機(jī)理一直未完全搞清楚。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)α-生育酚除具有脂溶性抗氧化劑的作用外，還能夠調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)及基因表達(dá)［41-42］。Li等［43］使用 α - 生育酚處理正常培養(yǎng)基條件下MDBK細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)，α-生育酚能夠介導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G1/S分界處，且細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制程度與α-生育酚劑量呈正相關(guān)，表明α-生育酚具有抑制細(xì)胞增殖的作用。為進(jìn)一步研究α-生育酚介導(dǎo)細(xì)胞周期停滯的潛在機(jī)制，采用高密度寡核苷酸微陣列分析α-生育酚調(diào)控后的MDBK細(xì)胞全局基因表達(dá)情況，結(jié)果顯示有2.60%(1 183/45 383)的基因受α-生育酚的影響，其中包含與細(xì)胞周期、核酸代謝、DNA復(fù)制相關(guān)的基因。雖然目前尚未明確α-生育酚調(diào)控基因表達(dá)及其潛在的抑制HDAC的機(jī)制，但細(xì)胞層面的研究為今后理解維生素E影響畜禽生產(chǎn)性能的機(jī)理提供了幫助。

4 小結(jié)

越來(lái)越多的飼料添加劑被證實(shí)具有HDAC抑制劑或其他影響表觀遺傳的功能，表明傳統(tǒng)意義上可作為飼糧成分的物質(zhì)能夠通過(guò)調(diào)節(jié)表觀遺傳機(jī)制來(lái)改變動(dòng)物的表型特征。然而目前相關(guān)研究大多限于人類和小鼠上，對(duì)于實(shí)際生產(chǎn)中畜禽的影響研究還比較匱乏，隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，能夠幫助我們深入理解飼料添加劑調(diào)控畜禽表觀遺傳的機(jī)制，對(duì)于促進(jìn)畜禽產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有積極影響。

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