廖 奇 劉旭川 李 清， 樊月圓 張春勇，楊舒黎， 毛華明， 冷 靜，*

(1.云南省動物營養(yǎng)與飼料科學重點實驗室，昆明 650201;2.云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，昆明 650201)

瘤胃特殊的內(nèi)環(huán)境為瘤胃微生物提供了優(yōu)越的棲息場所，但也導致了體外純培養(yǎng)瘤胃微生物的困難［1］。RNA-Seq技術(shù)，又稱轉(zhuǎn)錄組測序(transcriptome sequencing)技術(shù)或全轉(zhuǎn)錄鳥槍法測序(whole transcriptome shotgun sequencing)技術(shù)，是基于新一代測序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組學研究方法，能夠從群體水平上研究瘤胃微生物功能基因的表達水平以及在不同環(huán)境條件下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律，這是傳統(tǒng)分子生物學技術(shù)所欠缺的［2］。2008年6月，Nagalakshmi等［3］、Wilhelm 等［4］分別在《科學》和《自然》雜志發(fā)表了利用RNA-Seq技術(shù)論述有關(guān)釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)與裂殖酵母(fission yeast)轉(zhuǎn)錄組學的研究成果，為后續(xù)環(huán)境微生物研究奠定了RNA-Seq技術(shù)的應(yīng)用基礎(chǔ)。目前RNASeq 技術(shù)在土壤［5］、植物［6］、人體［7］、昆蟲［8］、水產(chǎn)［9］、食品［10］、海洋［11］微生物研究領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，但在反芻動物瘤胃微生物研究領(lǐng)域的應(yīng)用較少，本文就RNA-Seq技術(shù)及其在瘤胃微生物研究中的應(yīng)用進展作一介紹。

1 RNA-Seq技術(shù)原理、測序流程及測序平臺的特點

1.1 原理及測序流程

RNA-Seq技術(shù)是建立在高通量測序的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的，基于Solexa測序平臺測序原理是采用可逆性末端邊合成邊測序反應(yīng)。具體流程是通過對樣本中總RNA的提取，使用相關(guān)分子生物學技術(shù)將mRNA分離純化，利用超聲波處理mRNA使其片段化，然后進行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，同時補平雙鏈cDNA黏性末端并且磷酸化，在3＇端加上腺嘌呤“A”，應(yīng)用Solexa測序平臺的測序接頭連接在cDNA片段兩端，采用橋式PCR擴增形成一個簇，構(gòu)建cDNA文庫，此時的文庫cDNA由待測序列、測序接頭、引物互補序列及index標簽序列(如非index文庫則無)組成，最后上機測序，根據(jù)4種不同的熒光信號確認堿基種類［12］。

1.2 測序平臺的特點

目前，RNA-Seq技術(shù)主要是建立在第2代高通量測序平臺基礎(chǔ)上的，已實現(xiàn)商品化的測序平臺包括:Illumina公司的基因組分析儀(原Solexa技術(shù))、羅氏(Roche)公司的 GS-FLX 454基因組測序儀和Life Technology公司的SOLID序列分析儀［13-16］。其中Roche公司的 GS-FLX 454基因組測序儀平臺讀長最長，平均讀長400 bp，最長可達1 000 bp，可用于基因組的從頭測序和轉(zhuǎn)錄組的拼接，但缺點是通量低，費用高，易由于堿基插入缺失引起測序錯誤;Illumina公司的基因組分析儀采用雙端測序，平均讀長在100 bp，通量最高，一次測序數(shù)據(jù)可達200 Gb/run，可用于ChIP-Seq與RNA-Seq定量測定基因的表達水平，缺點是測序序列讀長短;Life Technology公司的SOLID序列分析儀也是采用雙端測序，讀長最短，但是測序錯誤率最低，可用于基因組反復測序以檢測變異位點。

2 RNA-Seq技術(shù)測序的數(shù)據(jù)處理與分析方法

2.1 數(shù)據(jù)處理

不同的高通量測序平臺產(chǎn)生的數(shù)據(jù)文件格式不同，F(xiàn)ASTQ格式是高通量數(shù)據(jù)分析常用的文件格式［17］。在進行數(shù)據(jù)分析之前，需要根據(jù)不同的測序文件格式對數(shù)據(jù)進行標準化處理，以常見的FASTQ格式為例，數(shù)據(jù)預處理包括質(zhì)量控制、讀段(reads)清理、轉(zhuǎn)錄組組裝、轉(zhuǎn)錄組定量和標準化5個過程［18］。質(zhì)量控制可以使用基于R語言的bioconductor程序中的 ShortRead 安裝包［19］或者FastQC 與 StatsDB 工具［20-21］，reads清理主要是清理reads兩端低質(zhì)量的區(qū)域(測序質(zhì)量分數(shù)小于Q20)、3＇端測序接頭、測序中出現(xiàn)的未知核苷酸，可以使用 Fastx_toolkit與 FastQC工具［21-22］共同完成;轉(zhuǎn)錄組的組裝包括有參考基因序列的組裝、從頭組裝以及2種方法的結(jié)合這3種方式，有參考基因序列的組裝可以使用Tophat與Cufflinks工具［23］，從頭組裝可以使用 Trinity 工具［24］，轉(zhuǎn)錄組定量與標準化可以使用RPKM(reads per kilo bases per million reads)指標，標準化后的數(shù)據(jù)可以直接用作后續(xù)的數(shù)據(jù)分析工作。

2.2 分析方法

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析與計算機、網(wǎng)絡(luò)技術(shù)聯(lián)系緊密，形式多種多樣［25］。比如將序列比對到NCBI的子數(shù)據(jù)庫進行BLAST同源比對的數(shù)據(jù)庫分析形式，應(yīng)用Bowtie與Trinity軟件組裝及拼接reads的單機程序分析形式，應(yīng)用在線程序如CpGPlot預測核酸序列CpG島的在線分析形式。根據(jù)參考基因組的有無［26］，RNA-Seq數(shù)據(jù)分析的內(nèi)容與方法有所差異。對于沒有參考基因組的從頭組裝數(shù)據(jù)，分析的內(nèi)容主要包括基因預測與注釋、KOG/COG分析、GO分析、代謝通路分析、基因差異表達分析、差異基因富集分析與SSR/SNP分析;對于有參考基因組的重測序數(shù)據(jù)，分析內(nèi)容主要包括基因表達差異分析、差異基因富集分析、新轉(zhuǎn)錄本預測、非翻譯區(qū)(UTR)分析、可變剪接分析、SSR/SNP分析、UTR分析、Operon分析與 Noncoding RNA分析。

3 RNA-Seq技術(shù)在反芻動物瘤胃微生物研究中的應(yīng)用

3.1 瘤胃微生物代謝酶特性

RNA-Seq 技術(shù)能夠從轉(zhuǎn)錄組的水平定性研究瘤胃微生物酶基因的表達情況，結(jié)合原核表達、真核表達和酶動力學試驗等能夠進一步定量分析酶學特性。Dai等［27］對荷斯坦奶牛瘤胃微生物進行轉(zhuǎn)錄組研究，發(fā)現(xiàn)分別約有1%和0.1%的基因能夠編碼糖苷水解酶(GH)和碳水化合物降解酶，這些基因編碼的酶有98%來自GH蛋白家族，并且發(fā)現(xiàn)飼糧中含有大量木聚糖時瘤胃瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、纖維桿菌屬(Fibrobacter)和普氏菌屬(Prevotella)細菌GH48家族中外切葡聚糖酶(cellobiohydrolases，CBH)基因表達量最高，占纖維素酶基因的7.65%。研究表明，底物木聚糖能夠誘導GH48基因的表達，是提高飼料中碳水化合物利用率的重要因素。然而，在 Dodd等［28］的試驗中發(fā)現(xiàn)一些能夠抑制碳水化合物酶活性的營養(yǎng)成分，試驗中用小麥阿拉伯糖基木聚糖(arabinoxylan)為唯一碳源的培養(yǎng)基(WAX)和以木糖(xylose)加果膠糖(arabinose)為碳源的培養(yǎng)基(XA)富集培養(yǎng)瘤胃布氏普雷沃氏菌(Prevotella bryantii)，提取mRNA進行轉(zhuǎn)錄組學研究發(fā)現(xiàn)，與XA培養(yǎng)環(huán)境比較，在WAX培養(yǎng)環(huán)境下GH基因高度表達，其表達量是XA培養(yǎng)環(huán)境下的4～16倍，因而推測飼料中的木糖和果膠糖能夠抑制木聚糖酶基因的表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)，影響酶活的因素不僅僅是底物的營養(yǎng)成分，不同酶之間的協(xié)同作用也是影響酶活的重要原因。例如，在WAX培養(yǎng)環(huán)境下發(fā)現(xiàn)一些未知功能的新基因，命名為PbXyn5A，通過薄層色譜(TLC)分析發(fā)現(xiàn)PbXyn5A有木聚糖內(nèi)切酶(endoxylanase)活性，與PbAra43A共同存在時對WAX的降解率遠遠高于二者單獨存在時。在瘤胃真菌方面，Wang等［29］利用RNA-Seq技術(shù)對瘤胃Neocallimastix patriciarum進行轉(zhuǎn)錄組學研究，發(fā)現(xiàn)潛在的219個編碼GH家族蛋白的疊連群(contigs)，這些contigs被細分到25個GH蛋白家族，在對應(yīng)的25個GH蛋白家族中發(fā)現(xiàn)4種酶共同參與水稻、紫狼尾草和甘蔗渣的降解，這些酶具有葡萄糖苷酶、木聚糖酶和葡聚糖酶活性，組裝后的contigs進一步通過真核表達試驗成功克隆獲得19個纖維素酶基因，當培養(yǎng)基中底物是紫狼尾草時，纖維素內(nèi)切酶的活性最強，活性為0.6 U/mg，純化后的活性為1.15 U/mg;當?shù)孜锸撬緯r，葡聚糖外切酶(exoglucanase，EXG)與 β -葡萄糖苷酶(β-glucosidases，BGLUs)的活性最強，其中EXG的活性為16.93 U/mg，BGLUs的活性為0.81 U/mg，純化后的活性分別為78.97和2.17 U/mg，推測這2種酶具有潛在的工業(yè)生產(chǎn)價值，紫狼尾草、水稻和甘蔗渣中不同營養(yǎng)組分對纖維素酶的誘導作用的差異性可能導致了酶活性的不同。此外，Lawley等［30］利用RNA-Seq技術(shù)對3頭牛瘤胃乳酸桿菌(L.ruminis)轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)了苔聚糖酶和木質(zhì)纖維素酶基因，這些基因編碼的苔聚糖酶和木質(zhì)纖維素酶可以將飼糧中的葡聚糖降解成［3-O-β-cellotriosyl-D-glucose (LDP4) 和4-O-β-laminaribiosyl-D-cellobiose(CDP4)］，當?shù)孜镏蠰DP4或CDP4含量增加，操縱子正調(diào)控作用增強，促進苔聚糖酶和纖維素酶基因的表達。以上研究表明，瘤胃微生物所產(chǎn)生的酶的活性受飼糧組分或培養(yǎng)基底物影響，可能是飼糧中底物的營養(yǎng)成分或其代謝的中間產(chǎn)物對酶的分泌與活性有一定的誘導作用，從而促使相應(yīng)操縱子的調(diào)控，進而影響酶基因的表達，這種調(diào)控作用可能促進也可能抑制酶的代謝，RNA-Seq技術(shù)應(yīng)用于了解酶與酶、酶與底物之間的調(diào)控關(guān)系，有利于提高飼糧的利用效率。

3.2 瘤胃微生物多樣性

3.2.1 瘤胃未知微生物

Fouts等［31］利用 RNA-Seq技術(shù)獲得 12頭牛瘤胃微生物轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對每頭牛瘤胃細菌部分reads(5 520個)中的16S rRNA的V1～V3保守區(qū)域進行分析，發(fā)現(xiàn)1 903～2 432個歸類到種水平的操作性分類單元(operational taxonomic unit，OTU)，其中80%來自梭菌目(Clostridiales)、擬桿菌目(Bacteroidales)、丹毒絲菌目(Erysipelotrichales)和未知分類情況的unclassified TM7，同時發(fā)現(xiàn)13個OTU可以歸類到古細菌(archaeal)，并且其中有2種未知古細菌，分別與甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)和熱裸單胞菌屬(Thermogymnomonas)最為相似;在對真菌18S rRNA保守區(qū)歸類分析發(fā)現(xiàn)71個OTU，與Gen-Bank數(shù)據(jù)庫比對后發(fā)現(xiàn)53個OTU與數(shù)據(jù)庫中已知序列的相似度在97%以上，通過BLAST(同源檢索)與LCA(聚類分析)后發(fā)現(xiàn)未知曲霉屬(Aspergillus)真菌，目前在GenBank數(shù)據(jù)庫中的基因編號是HQ393873.1，而在這之前 GenBank數(shù)據(jù)庫中沒有報道過。

3.2.2 瘤胃微生物組成

瘤胃中擁有數(shù)量龐大、種類繁多的微生物，其中有大量的纖維、淀粉和脂肪降解菌，這些微生物共同參與營養(yǎng)物質(zhì)的代謝。有研究通過RNA-Seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)，與飼喂標準飼糧相比較，分別攝入富含淀粉與脂肪的飼糧后，瘤胃內(nèi)容物中的細菌種類沒有顯著變化，但是細菌菌種的主體地位變化顯著，尤其是在飼糧中添加脂肪的環(huán)境下瘤胃脂肪降解菌脂解厭氧弧菌(Anaerovibrio lipolytica)的數(shù)量明顯增加［32］。另據(jù)報道，脂肪能夠附著在飼料顆粒表面阻礙非脂肪降解細菌對營養(yǎng)物質(zhì)的攝取，導致其他細菌的生長速率下降，推測瘤胃中脂肪能夠影響瘤胃微生物的組成［33］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，增加飼糧淀粉含量時，瘤胃中 Barnesiella、Oribacterium與 Olsenella的數(shù)量顯著增加，同時丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)-假丁酸弧菌屬(Pseudobutyrivibrio)與Rikenellaceae_RC的數(shù)量顯著減少［32］，原因可能是 Barnesiella、Oribacterium與 Olsenella能夠產(chǎn)生高效降解淀粉的復合酶，通過降解淀粉提供的營養(yǎng)物質(zhì)促進自身的生長，這與 Fava等［34］研究中認為Barnesiella、Oribacterium與Olsenella能夠分泌高活性淀粉酶的結(jié)果一致。此外，Li［35］利用 RNASeq技術(shù)研究5頭被去勢的公牛瘤胃微生物的菌落組成，結(jié)果表明瘤胃中變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、螺旋體門(Spirochaetes)和互養(yǎng)菌門(Syn-ergistetes)為優(yōu)勢細菌，其中Proteobacteria在瘤胃微生物中占 45.7%，遠大于 Bacteroidetes的23.7%，廣古菌門(Euryarchaeota)在所有古細菌中占94.2%，研究表明，盡管這些牛在個體上有差異，但是瘤胃微生物組成差異不大。在Fouts等［31］的研究中發(fā)現(xiàn)，僅在瘤胃液中存在并且占優(yōu)勢的細菌是 Prevotella(7.3%)和 Tannerella(1%)，而僅在瘤胃內(nèi)容物中存在并且占優(yōu)勢的細菌是 Butyrivibrio(2.5%)和 Blautia(0.5%)，研究表明細菌在瘤胃液與瘤胃內(nèi)容物中的組成差異顯著，但古細菌和真菌(fungi)在瘤胃液與瘤胃內(nèi)容物中的組成沒有顯著差異，而瘤胃液與瘤胃內(nèi)容物中的營養(yǎng)成分相似，進而推測，瘤胃中營養(yǎng)物質(zhì)存在的環(huán)境可能是導致細菌差異分布的重要原因。以上研究表明，瘤胃微生物的組成與飼糧的營養(yǎng)成分、形態(tài)有關(guān)，且RNA-Seq技術(shù)是研究瘤胃微生物多樣性的一種有效的方法，在瘤胃微生物的組成以及挖掘未知瘤胃微生物資源方面有很大的前景。

3.3 瘤胃微生物新功能基因

RNA-Seq技術(shù)不僅可以高效挖掘瘤胃微生物新的基因，同時可以挖掘這些基因相關(guān)的功能。Dassa等［36］利用基于新一代高通量測序平臺的RNA-Seq技術(shù)在瘤胃微生物中首次發(fā)現(xiàn)黃色瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)和白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)的 strains FD-1、007c、17 和 strains 7、8、SY3 基因，這些基因能夠編碼錨定蛋白。Qi等［37］利用 RNA-Seq技術(shù)對加拿大麝牛瘤胃微生物總mRNA測序獲得2.8 G的reads，組裝拼接后獲得59 129個 contigs，并且從2 500個編碼蛋白質(zhì)的功能contigs中鑒定出1 000個與GH、糖脂酶以及多聚糖裂解酶活性有關(guān)的功能基因，其中發(fā)現(xiàn)54條編碼GH48家族蛋白的基因序列，它們均來自瘤胃中的厭氧真菌。李勁亭等［38］在瘤胃細菌中發(fā)現(xiàn)455條編碼GH48家族蛋白的基因序列，以89%相似度作為區(qū)分其種類的界定標準，發(fā)現(xiàn)這些基因序列分別編碼66種不同的GH48家族蛋白。此外，有研究通過真核表達試驗成功克隆到瘤胃Neocallimastix patriciarum GH家族基因，在這些被克隆到的基因里，還包含了以往瘤胃宏基因組學中很少提及到的GH6和GH48家族基因［29］?；蚯贸囼炞C明，GH48家族蛋白中的纖維素酶對梭熱桿菌(Clostridium thermocellum)和Ruminococcus albus的纖維素降解能力有重要的影響，將GH48基因敲除后前者降解纖維素的能力嚴重下降，后者則完全喪失［39］。而在 Sukharnikov 等［40］的研究中發(fā)現(xiàn)放線菌門(Actinobacteria)、Firmicutes和綠彎菌門(Chloroflexi)類群的 GH48基因可能源于一個共同的祖先，推測GH48家族基因可能存在一定的保守性，并且這種保守性與宿主種類沒有關(guān)系。Xu等［41］對瘤胃細菌進行轉(zhuǎn)錄組學研究，發(fā)現(xiàn)76個與纖維素降解有關(guān)的碳水化合物活性酶(CAZymes)，之后 Schellenberg等［42］利用 Roche/454 WGS測序技術(shù)在瘤胃Clostridium stercorarium的轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)17個與碳水化合物降解酶有關(guān)的功能基因，其中包括纖維素酶的celYZ，纖維二糖磷酸化酶的 cepAB，木聚糖酶的 xynABC，木糖苷酶的 xylAB、bxlAB、bglZ，阿拉伯糖苷酶的 arfAB，α-半乳糖苷酶的agaA，果膠酸裂解酶的pelA和α-鼠李糖苷酶的ramA，但仍有大量CAZymes基因未被挖掘，并且這些基因所編碼的碳水化合物酶的功能有待更深入的研究。與反芻動物不同，有研究發(fā)現(xiàn)白蟻體內(nèi)半纖維素的消化由腸道內(nèi)的共生菌完成，而纖維素的消化卻是由白蟻與其共生菌協(xié)同完成［43］，白蟻自身是否能夠產(chǎn)生纖維素酶有待進一步試驗驗證。此外，對豬和人類腸道的研究也發(fā)現(xiàn)了一些功能基因。Poroyko等［44］通過對全部轉(zhuǎn)錄組進行RNA-Seq技術(shù)測序，研究對新生仔豬飼喂母乳(MF)和人工乳(FF)時腸道微生物的功能基因表達的差異，發(fā)現(xiàn)2種處理下基因的表達模式是相似的，所有樣品均表達了大量與碳水化合物及蛋白質(zhì)代謝相關(guān)酶類的轉(zhuǎn)錄本。Booijink等［45］運用 RNA-Seq技術(shù)對人類腸道微生物的宏轉(zhuǎn)錄組進行研究，通過對2個尚未斷奶的嬰兒的排泄物總RNA測序分析，闡明腸道微生物的原位基因表達，并通過與COG(cluster of orthologous genes)數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)有26%的功能基因簇與新陳代謝有關(guān)。以上研究表明，RNA-Seq技術(shù)在挖掘腸道微生物新基因和基因所編碼的酶上有巨大的潛力，有助于人類探知復雜環(huán)境中的微生物之間的關(guān)聯(lián)。

4 小結(jié)

RNA-Seq技術(shù)的瘤胃微生物轉(zhuǎn)錄組學研究已有數(shù)年，新一代高通量測序技術(shù)的發(fā)展促進了該領(lǐng)域的進步，對于有參考基因組數(shù)據(jù)的瘤胃微生物，轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)可以很好地驗證基因組數(shù)據(jù)的注釋，在沒有參考基因組序列的瘤胃微生物中，轉(zhuǎn)錄組測序可以豐富和完善該物種的遺傳數(shù)據(jù)庫，這些完善的數(shù)據(jù)資源有助于對該物種進行后續(xù)的分子生物學研究。通過與蛋白質(zhì)組、基因組、代謝組、基因芯片技術(shù)等其他分子生物學研究手段的結(jié)合，使人們更加深入地了解復雜瘤胃微生物菌群功能基因表達與調(diào)控的方式，如何將RNA-Seq技術(shù)與其他分子生物學技術(shù)結(jié)合探討瘤胃微生物相關(guān)基因在特殊的瘤胃內(nèi)環(huán)境中的表達與調(diào)控、瘤胃微生物之間的關(guān)系、瘤胃微生物與宿主之間的關(guān)系、環(huán)境對瘤胃微生物多樣性的影響是今后研究的熱點。然而，問題和挑戰(zhàn)并存，首先，瘤胃環(huán)境復雜，RNA純化試劑盒并不能除掉所有雜質(zhì)，尤其是內(nèi)容物中攜帶的腐殖酸，而獲得高純度的RNA樣品是試驗的關(guān)鍵;其次，在對瘤胃微生物群體或個體進行cDNA序列分析時，轉(zhuǎn)錄組中mRNA的富集是主要的難題;再次，瘤胃中大量未知微生物的相關(guān)功能基因在基因注釋數(shù)據(jù)庫中沒有注釋信息，這些缺陷導致尋找功能基因存在很大困難;最后，RNA-Seq技術(shù)獲得的遺傳信息是海量的，生物信息學分析將面臨巨大的挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)生物信息學分析工具很難滿足大數(shù)據(jù)要求，適用于常規(guī)實驗室使用的新算法和分析軟件的開發(fā)成為當前的迫切需求。隨著測序技術(shù)本身以及配套技術(shù)的不斷發(fā)展完善，相信這類技術(shù)難題最終會得到解決，測序成本將更加低廉。

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