陳祥娥

（濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)學(xué)院，山東 日照276826）

肝素原（heparosan，又稱 N－acetylheparosan），（－4－β－D－GlcA－1，4－α－D－GlcNAc－1）n（其中 GlcA 代表葡糖醛酸；GlcNAc代表乙酰氨基葡糖）［1］，是某些細(xì)菌莢膜中多糖骨架的二糖重復(fù)單位，同時也是肝素和硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）的生物合成前體。細(xì)菌莢膜肝素原的發(fā)現(xiàn)，引起了廣泛關(guān)注。因?yàn)樗雇ㄟ^細(xì)菌合成，化學(xué)或生物修飾生產(chǎn)肝素、HS成為可能。肝素原二糖骨架結(jié)構(gòu)與脊椎動物中的肝素類似，但未硫酸化，也沒有將GlcA異構(gòu)化為艾杜糖醛酸（IdoA）［2］。

已發(fā)現(xiàn)的可以生產(chǎn)肝素原的細(xì)菌有大腸桿菌K5（Escherichia coli K5），多殺性巴氏桿菌D型（Pasteurella multocida type D）以及副雞禽桿菌基因型II（Avibacterium paragallinarum genetype II）3種［3－5］。肝素原可以通過微生物發(fā)酵提取或重組酶體外合成［6］。目前，文獻(xiàn)報道的肝素原發(fā)酵生產(chǎn)多采用 E．coli K5。Wang等［7］采用優(yōu)化培養(yǎng)基，富氧給予并指數(shù)補(bǔ)加葡萄糖，在7L發(fā)酵罐中培養(yǎng)E．coli K5菌株制備肝素原，產(chǎn)量可達(dá)15g／L，相對分子質(zhì)量為5．8×104，重均分子質(zhì)量為8．4×104。

目前，肝素原的研究熱點(diǎn)集中于以其作為前體骨架修飾合成肝素、HS及其類似物［8］。近來研究發(fā)現(xiàn)，肝素原還可作為良好的藥物載體，具有調(diào)節(jié)腸道菌群等作用［9－10］。

1 肝素類生物合成前體

肝素被發(fā)現(xiàn)已近一百年，作為抗凝血和抗血栓藥物廣為應(yīng)用。2008年，曾因雜質(zhì)過量引起嚴(yán)重的過敏反應(yīng)甚至死亡。動物源性肝素的質(zhì)量成為廣泛關(guān)注的焦點(diǎn)，同時也引發(fā)了對非動物來源肝素大規(guī)模生產(chǎn)的需求［11］。脊椎動物合成肝素或HS的過程是先催化合成肝素原作為前體聚合物，然后在一系列酶的作用下進(jìn)行硫酸化及異構(gòu)化修飾，生成的高度N－，O－硫酸化，IdoA含量較高的多糖鏈為肝素，而部分修飾后生成的O－硫酸化程度較低，GlcNAc、GlcA 含量較高的多糖鏈為 HS［12］。目前，商品化肝素主要從豬腸黏膜或牛肺中提取，以細(xì)菌發(fā)酵獲得的肝素原為前體，經(jīng)化學(xué)或生物修飾生產(chǎn)肝素是一種較有希望的替代方法［13－15］。

1．1 合成途徑

以肝素原作為前體多糖，首先采用化學(xué)方法或在N－去乙酰化酶／N－磺基轉(zhuǎn)移酶（N－deacetylase／N－sulfatransferase，NDST）的作用下獲得 N－去乙?；疦－硫酸化的肝素原，在 C5－異構(gòu)化酶（C－5 epimerase，C5－epi）作用下將大部分 GlcA異構(gòu)化為IdoA 后，經(jīng) 2－O－磺基轉(zhuǎn)移酶 （2－O－sulfotransferase，2－OST）、6－OST 和3－OST 的依次作用，在IdoA的C2位，GlcA的C3和C6位進(jìn)行硫酸化修飾，即可獲得具有抗凝血活性的肝素或 HS［16－20］。部分修飾可生成N－硫酸化肝素原（NSH）、O－硫酸化肝素原（OSH）、N，O－硫酸化肝素原（NOSH）、差向異構(gòu)化N，O－硫酸化肝素原（Epi－NOSH）等一系列衍生物。采用肝素原作為前體還可修飾獲得低分子肝素類產(chǎn)品，如 Arixtra［21］。

Bhaskar等［22］研究開發(fā)了一鍋燴化學(xué)酶法合成肝素的制備工藝。構(gòu)建可表達(dá)C5－epi、2－OST、6－OST－1、6－OST－3、3－OST－1 和 芳 基 磺 基 轉(zhuǎn) 移 酶IV（AST IV）融合蛋白的E．coli，發(fā)酵培養(yǎng)獲得重組酶。具體制備工藝是先化學(xué)修飾肝素原獲得NSH作為底物。在緩沖體系中加入3′－磷酸腺苷5′－磷酰硫酸（PAPS）作為硫酸基供體，在重組酶的作用下，37℃孵育過夜即可獲得具有抗凝血活性的全長或寡聚肝素／HS。本工藝主要通過對酶與底物比的控制實(shí)現(xiàn)酶活性的調(diào)節(jié)，適于進(jìn)行肝素結(jié)構(gòu)異質(zhì)性及其對構(gòu)效關(guān)系影響的高通量篩選研究。

1．2 生物活性

以肝素原為起始物，修飾生成的多種肝素類衍生物表現(xiàn)出多種與肝素類似的生物活性，主要有抗凝血、抗炎、抗癌、抗病毒和誘導(dǎo)干細(xì)胞分化等［23－25］。已報道的由肝素原修飾獲得的衍生物的基本結(jié)構(gòu)及活性見表1。

表1 肝素原衍生物的基本結(jié)構(gòu)及活性

肝素原硫酸化衍生物的藥理作用與肝素類似，部分明顯優(yōu)于肝素，如OSH、NOSH的抗病毒活性，且不引發(fā)出血等副作用［23］。隨著人們對肝素結(jié)構(gòu)和功能之間關(guān)系的不斷認(rèn)識和研究，可以有選擇性的對肝素原進(jìn)行修飾，獲得具有特定功能的衍生物，以更好地適用于不同的治療需求。

2 藥物載體

肝素原作為肝素和HS的生物合成前體，具有良好的生物相容性，生物可降解性、低毒性和易于化學(xué)修飾的特點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，肝素原具有細(xì)胞內(nèi)化作用，可逃避調(diào)理素作用，具有適宜的血漿循環(huán)半衰期，不具有免疫原性，可作為良好的藥物載體改進(jìn)藥物的藥代動力學(xué)特性，提高性能［26－27］。

基于肝素原的納米載體可以實(shí)現(xiàn)藥物的胞內(nèi)傳遞，細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)表明，其內(nèi)吞途徑包括網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和巨胞飲。Chen等［28］采用基于肝素原和去氧膽酸共軛作為藥物載體制備的新型膠束，可以抵抗血清吸附，表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)，這種膠束能夠有效地將模型疏水性藥物阿霉素靶向運(yùn)送到Hela細(xì)胞。此膠束為pH敏感型，在pH5．0的酸性條件下阿霉素的釋放速率遠(yuǎn)高于生理pH7．4時的釋放速率，在過表達(dá)β－葡糖醛酸酶的腫瘤組織中也可加速釋放，增強(qiáng)治療效果，具有良好的臨床應(yīng)用潛能。作為荷負(fù)電的糖胺聚糖家族一員，肝素原有望成為新一代藥物載體［29］。

3 調(diào)節(jié)腸道菌群

研究表明，肝素和HS具有廣譜抗感染作用。越來越多不同種類的傳染性微生物對宿主的黏附、胞內(nèi)化或在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移已證實(shí)可被肝素或HS降低。但肝素靜脈注射治療潰瘍性結(jié)腸炎的臨床試驗(yàn)結(jié)果并不理想，部分病人甚至出現(xiàn)了嚴(yán)重的直腸出血反應(yīng)［30］。

體外研究發(fā)現(xiàn)，肝素原可顯著抑制腸致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等常見腸道致病菌對腸道上皮細(xì)胞和黏液層的黏附，對鼠李糖乳酸桿菌等益生菌的黏附則無明顯影響，可協(xié)同增強(qiáng)益生菌的黏附競爭優(yōu)勢，表現(xiàn)出與肝素類似的作用效果［10］。大鼠體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肝素原可調(diào)節(jié)體內(nèi)腸道菌群組成，增加和維持Lactobacillus taiwanensis和Lactobacillus gallinarum等乳酸桿菌屬益生菌的相對數(shù)量及優(yōu)勢，有利于維持健康腸道菌群，有效預(yù)防外源性致病菌感染，減少腸道疾病的發(fā)生，且與肝素之間并無顯著性差異［31］。肝素原具有與肝素類似骨架結(jié)構(gòu)，可發(fā)酵生產(chǎn)，有開發(fā)為腸道菌群調(diào)節(jié)劑的潛能，且不引發(fā)出血等副作用，在臨床應(yīng)用方面比肝素更有優(yōu)勢。

4 其他

Munoz等［32］將生物素?；母嗡卦潭ㄔ趥鞲衅餍酒?，用參與肝素生物合成的酶選擇性修飾獲得與肝素具有相似結(jié)構(gòu)的多糖，通過表面等離子體共振檢測確定這些多糖與抗凝血酶Ⅲ的相互作用，進(jìn)行肝素－蛋白質(zhì)相互作用的高通量篩選，并可提供參與結(jié)合的關(guān)鍵硫酸化基團(tuán)的結(jié)構(gòu)信息。

5 展望

肝素原作為肝素和HS的生物合成前體，具有良好的生物相容性，生物可降解性和易于化學(xué)修飾的特點(diǎn)。細(xì)菌莢膜肝素原的發(fā)現(xiàn)，為我們提供了一條通過發(fā)酵工程獲得肝素原的途徑，使以肝素原為前體，化學(xué)或酶法修飾生產(chǎn)肝素成為可能，并獲得了一些具有特殊生物活性的衍生物。肝素原還具有開發(fā)為新一代藥物載體及腸道菌群調(diào)節(jié)劑的良好潛能。隨著研究的深入和不斷開展，肝素原在生化藥物開發(fā)和功能材料等方面的應(yīng)用將更為廣泛。

［1］ 陳祥娥，凌沛學(xué)，張?zhí)烀瘢P(guān)于heparosan中文譯名的建議［J］．中國科技術(shù)語，2014，16（4）：33－34．

［2］ 陳祥娥，凌沛學(xué)，張?zhí)烀瘢?xì)菌肝素前體（heparosan）合酶［J］．中國生化藥物雜志，2008，29（6）：422－424．

［3］ Hickey A M，Bhaskar U，Linhardt R J，et al．Effect of eliminase gene （elmA）deletion on heparosan production and shedding in Escherichia coli K5［J］．J Biotechnol，2013，165（3－4）：175－177．

［4］ Otto N J，Green D E，Masuko S，et al．Structure／function analysis of Pasteurella multocida heparosan synthases：toward defining enzyme specificity and engineering novel catalysts［J］．J Biol Chem，2012，287（10）：7203－7212．

［5］ Chen X，Ling P，Jin Y，et al．Heparosan：precursor of bioengineered heparin and heparan sulfate［J］．Food and Drug，2012，14（4）：286－290．

［6］ Chavaroche A A，van den Broek L A，Eggink G．Production methods for heparosan，aprecursor of heparin and heparan sulfate［J］．Carbohydr Polym，2013，93（1）：38－47．

［7］ Wang Z Y，Ly M，Zhang F，et al．E．coli K5fermentation and the preparation of heparosan，a bioengineered heparin precursor［J］．Biotechnol Bioeng，2010，107（6）：964－973．

［8］ Li P，Sheng J，Liu Y，et al．Heparosan－derived heparin sulfate／heparin－like compounds：one kind of potential therapeutic agents［J］．Med Res Rev，2013，33（3）：665－692．

［9］ Chen J X，Liu W，Zhang M，et al．Heparosan based negatively charged nanocarrier for rapid intracellular drug delivery［J］．Int J Pharm，2014，473（1－2）：493－500．

［10］Chen X，Ling P，Duan R，et al．Effects of heparosan and heparin on the adhesion and biofilm formation of several bacteria in vitro［J］．Carbohydr Polym，2012，88（4）：1288－1292．

［11］Liu H，Zhang Z，Linhardt R J．Lessons learned from the contamination of heparin［J］．Nat Prod Rep，2009，26：313－321．

［12］Lever R，Mulloy B，Page C P．A century of progress［M］．York Springer，2012：23－42．

［13］陳祥娥，凌沛學(xué)．肝素微生物生產(chǎn)展望［J］．中國生化藥物雜志，2012，33（4）：502－504．

［14］Driguez P A，Potier P，Trouilleux P．Synthetic oligosaccharides as active pharmaceutical ingredients：Lessons learned from the full synthesis of one heparin derivative on a large scale［J］．Nat Prod Rep，2014，31（8）：980－989．

［15］DeAngelis P L，Liu J，Linhardt R J．Chemoenzymatic synthesis of glycosaminoglycans：re－creating，re－modeling and re－designing nature＇s longest or most complex carbohydrate chains［J］．Glycobiology，2013，23（7）：764－777．

［16］Wu B，Wei N，Thon V，et al．Facile chemoenzymatic synthesis of biotinylated heparosan hexasaccharide［J］．Org Biomol Chem，2015，13（18）：5098－5101．

［17］Mochizuki H，Yamagishi K，Suzuki K，et al．Heparosan－glucuronate 5－epimerase：molecular cloning and characterization of novel enzyme［J］．Glycobiology，2015，Epub ahead of print．

［18］Xiong J，Bhaskar U，Li G，et al．Immobilized enzymes to convert N－sulfo，N－acetyl heparosan to a critical intermediate in the production of bioengineered heparin［J］．J Biotechnol，2013，167（3）：241－247．

［19］Raman K，Kuberan B，Arungundram S．Chemical modification of heparin and heparosan［J］．Methods Mol Biol，2015，1229：31－36．

［20］Sheng J，Xu Y，Dulaney S B，et al．Uncovering biphasic catalytic mode of C5－epimerase in heparan sulfate biosynthesis［J］．J Biol Chem，2012，287（25）：20996－21002．

［21］Xu Y，Masuko S，Takieddin M，et al．Chemoenzymatic synthesis of homogeneous ultralow molecular weight heparins［J］．Science，2011，334（6055）：498－501．

［22］Bhaskar U，Li G，F(xiàn)u L，et al．Combinational one－pot chemoenzymatic synthesis of heparin［J］．Carbohydr Polym，2015，122：399－407．

［23］陳祥娥，凌沛學(xué)．大腸桿菌K5莢膜多糖硫酸化衍生物的應(yīng)用［J］．中國生化藥物雜志，2009，30（6）：427－429．

［24］陳祥娥．Heparosan的提取分離及其對腸道菌作用的研究［D］．濟(jì)南：山東大學(xué)，2012．

［25］Zhao S，Wang Z，Chen J，et al．Preparation of heparan sulfatelike polysaccharide and application in stem cell chondrogenic differentiation［J］．Carbohydr Res，2015，401：32－38．

［26］Raman K，Mencio C，Desai U R，et al．Sulfation patterns determine cellular internalization of heparin－like polysaccharides［J］．Mol Pharm，2013，10（4）：1442－1449．

［27］DeAngelis P L，HEP tune：aprocess of conjugating a naturally occurring sugar molecule，heparosan，to a drug for enhanced drug delivery［J］．Drug Dev Deliv，2013，13：34－38．

［28］Chen J X，Zhang M，Liu W，et al．Construction of serum resistant micelles based on heparosan for targeted cancer therapy［J］．Carbohydr Polym，2014，110：135－141．

［29］DeAngelis P L．Heparosan，apromising‘naturally good’polymeric conjugating vehicle for delivery of injectable therapeutics［J］．Expert Opin Drug Deliv，2015，12（3）：349－352．

［30］段榮帥，凌沛學(xué)，王鳳山，等．肝素的抗感染作用［J］．中國生化藥物雜志，2009，30（4）：Ⅱ－Ⅴ．

［31］Duan R，Chen X，Wang F，et al．Oral administration of heparin or heparosan increases the lactobacillus population in the gut microbiota in mice［J］．Carbohydr Polym，2013，94（1）：100－105．

［32］Munoz E，Xu D，Avci F，et al．Enzymatic synthesis of heparin related polysaccharides on sensor chips：rapid screening of heparin－protein interactions［J］．Biochem Biophys Res Commun，2006，339（2）：597－602．