楊銘乾，黃繼紅，2*，許 茜，陶宜辰，馮軍偉，蘇雪鋒，王 文，李海月

（1.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.河南省食品工業(yè)科學(xué)研究所有限公司，河南 鄭州 450000）

0 前言

抗性淀粉（Resistant Starch，RS），是一種非常重要的功能因子，在20 世紀(jì)八九十年代被發(fā)現(xiàn)[1]，并定義為“健康人的小腸中不能被消化吸收的淀粉及其降解物的總稱”[2]，具有更優(yōu)越于膳食纖維的生理功能和特性[3-4]，如緩解糖尿病，控制體質(zhì)量等[5-8].隨著人們對抗性淀粉研究的逐漸深入，其特殊的生理功能和營養(yǎng)價值逐漸展現(xiàn)于人們眼前，近年來越來越受到營養(yǎng)界、醫(yī)學(xué)界和食品界的好感和關(guān)注.

抗性淀粉RS3 是淀粉經(jīng)過糊化之后凝沉而來的，現(xiàn)階段公認(rèn)的形成機理主要是直鏈淀粉分子之間回生形成雙螺旋結(jié)構(gòu)[9-10].目前抗性淀粉制備方法主要有高溫壓熱法、微波輻射法、酶法（單酶法或雙酶法）、酸法、擠壓法或多法相結(jié)合，但普遍存在抗性淀粉含量偏低的問題.如余飛等[11]研究了普魯蘭酶處理條件對抗性淀粉增抗效應(yīng)的規(guī)律，并用普魯蘭酶處理糊化后的蠟質(zhì)玉米淀粉，在最優(yōu)條件下制得的抗性淀粉含量大于10%.劉一洋[12]利用酸酶（普魯蘭酶）法制備大米抗性淀粉，其RS 含量為24.31%；李俊偉[13]利用擠壓法制備大米抗性淀粉的含量為8.87%；吳享等[14]利用耐高溫α-淀粉酶聯(lián)合壓熱-冷卻循環(huán)處理制備玉米抗性淀粉，其含量為17.94%.作者針對上述抗性淀粉制備中含量低的問題，對本實驗室經(jīng)壓熱和普魯蘭酶脫支得到的玉米抗性淀粉采用真菌α-淀粉酶進行純化試驗，研究了原抗性淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶添加量、酶解時間對純化效果的影響；并通過響應(yīng)面設(shè)計對其純化工藝進行了優(yōu)化，為制備高純度抗性淀粉提供技術(shù)參考.

1 材料與方法

1.1 材料

玉米淀粉：成武大地玉米開發(fā)有限公司（含直鏈淀粉25%）；真菌α-淀粉酶（20 000 U/g）：山東隆大生物工程有限公司；抗性淀粉測定試劑盒：愛爾蘭Megazyme 公司.

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3E 雷茲pH 計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SHA-C 數(shù)顯水浴恒溫振蕩器：金壇華峰儀器有限公司；湘儀TDZ5-WSTDZ5-WS 多管架自動平衡離心機：河南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；GZX-GF-MBS-Ⅰ型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FA12048 電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司.

1.3 方法

1.3.1 抗性淀粉制備工藝

采用壓熱法與酶法相結(jié)合的方法制備玉米抗性淀粉，即將一定濃度的淀粉懸浮液經(jīng)過壓熱而斷鏈糊化之后，再加入普魯蘭酶進行脫支處理，然后經(jīng)高溫作用使直鏈淀粉最大程度地溶出，4 ℃放置結(jié)晶，24 h 之后干燥粉碎即得抗性淀粉，以AOAC Official Method 2002.2 測得所得樣品抗性淀粉的含量為30.2%.

1.3.2 抗性淀粉純化方法

在一定的條件下，用真菌α-淀粉酶對按1.3.1制得的玉米抗性淀粉進行酶解，以提高其抗性淀粉含量，酶解之后進行離心，并洗滌沉淀，置于60℃烘箱中進行干燥、粉碎得抗性淀粉，并對其進行含量測定和提純率的計算，以綜合評價其純化效果.

1.3.3 單因素試驗設(shè)計

預(yù)試驗表明，酶法純化玉米抗性淀粉過程中，原抗性淀粉乳的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、真菌α-淀粉酶的添加量和酶解時間是影響玉米抗性淀粉純化程度的主要因素，依次設(shè)計單因素和響應(yīng)面試驗進行純化工藝條件的優(yōu)化，并確定酶法純化玉米抗性淀粉的最佳工藝條件.酶解溫度和酶解pH 值根據(jù)所購買產(chǎn)品的最適條件進行，不需進行優(yōu)化.

1.3.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以原抗性淀粉乳的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、真菌α-淀粉酶的添加量和酶解時間3 個因素為影響因素，利用Design-Expert 8.0.6 軟件進行響應(yīng)面試驗設(shè)計，以獲得酶法純化玉米抗性淀粉的最佳工藝條件，其中各因素及水平見表1.

1.3.5 抗性淀粉含量的檢測

依據(jù)AOAC Official Method 2002.2 測定.

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface optimization test

1.3.6 抗性淀粉提純率的計算

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 原抗性淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)對純化效果的影響

分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%、20%、25%、30%的原抗性淀粉乳，添加真菌α-淀粉酶10 u/g，在一定的條件下酶解20 min，酶解完畢之后進行離心洗滌及二次結(jié)晶，并于60 ℃下干燥，粉碎得純化樣品，按照AOAC 2002.02 方法測定其抗性淀粉含量，并計算其提純率，結(jié)果如圖1 所示，并對其進行單因素方差分析，如表2 所示.

圖1 原抗性淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)對純化效果的影響Fig.1 Effect of mass fraction of raw resistant starch on purification

表2 原抗性淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)的單因素方差分析Table 2 Single-factor ANOVA of raw resistant starch mass fraction

由圖1 可知，隨著原抗性淀粉乳濃度的增大，純化后的抗性淀粉的含量呈現(xiàn)先增后減的變化趨勢，在原抗性淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%左右時達到最大值，且在此時提純率也達到最大值，可知適宜的底物（未轉(zhuǎn)化的淀粉）濃度有利于酶解反應(yīng)的高效進行，在一定的酶量下，當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時，酶量充足，則酶解作用強；而當(dāng)?shù)孜餄舛冗^高時，可能由于酶量不足或產(chǎn)生底物抑制，反而使得酶解作用逐漸減弱.由表2 可知，F(xiàn)=41.51676＞＞F0.05，表明該因素對純化效果影響顯著.

2.1.2 淀粉酶的添加量對純化效果的影響

在其他酶解條件不變的情況下，選取真菌淀粉酶的添加量依次為1、5、10、15、20、25 u/g，進行純化試驗，采用AOAC Official Method 2002.2 法測定純化后的抗性淀粉的含量，并計算其提純率，結(jié)果如圖2 所示，同時對測得的結(jié)果進行單因素方差分析，見表3.

圖2 真菌α-淀粉酶添加量對純化效果的影響Fig.2 Effect of addition amount of fungal α-amylase on purification

由圖2 可以看出，酶添加量也是影響抗性淀粉純化程度的重要因素之一，在添加量小于15 u/g時，隨著酶添加量的增大，抗性淀粉含量呈現(xiàn)增大趨勢；當(dāng)其大于15 u/g 時，抗性淀粉含量逐漸趨于恒定，其提純率也同樣如此.由此可知，在底物一定的前提下，當(dāng)酶量較低時，產(chǎn)物的生成與酶添加量成正相關(guān)；當(dāng)酶過量時，反應(yīng)完全，產(chǎn)物恒定，因此選擇酶添加量為15 u/g 為較佳條件.同時如表3 所示，F(xiàn)=276.660 2＞＞F0.05，表明酶添加量也顯著影響其純化效果.

2.1.3 酶解時間對純化效果的影響

在其他酶解條件不變的情況下，改變酶解時間依次為10、20、30、40、50 min，進行純化試驗，采用AOAC Official Method 2002.2 法測定純化后的抗性淀粉的含量，并計算其提純率，結(jié)果如圖3 所示，同時對測得的結(jié)果進行單因素方差分析，見表4.

表3 真菌α -淀粉酶添加量單因素方差分析Table 3 Single-factor ANOVA of addition amount of fungal α-amylase

由圖3 可以看出，不同的酶解時間得到的酶解效果也有所區(qū)別，當(dāng)酶解時間較短，即小于30 min時，純化效果隨著酶解時間的增長而增大；當(dāng)酶解時間過長，即大于30 min 時，由于底物量固定，酶解完全，使得其結(jié)果逐漸趨于恒定.同時，如表4所示，F(xiàn)=103.839 5＞＞F0.05，可知酶解時間同樣對該抗性淀粉的純化效果影響顯著.

圖3 真菌α-淀粉酶酶解時間對純化效果的影響Fig.3 Effect of enzyme digestion time of fungal αamylase on purification

表4 真菌α-淀粉酶酶解時間單因素方差分析Table 4 Single-factor ANOVA of enzyme digestion time of fungal α-amylase

2.2 響應(yīng)面試驗

根據(jù)表1 設(shè)計3 因素3 水平響應(yīng)面試驗，試驗結(jié)果見表5.

對表5 進行回歸擬合，得到純化后抗性淀粉含量的回歸方程為：

運用Design-Expert 8.0.6 軟件對試驗結(jié)果進行回歸方差和顯著性分析，其中純化后抗性淀粉含量的分析如表6 所示.

由表6 可知，本試驗所建立的二次多項式模型極為顯著（p＜0.000 1），失擬項不顯著（p=0.337 4＞0.005），因此該模型成立；回歸方程的決定系數(shù)為0.978 1，校正決定系數(shù)為0.949 9，說明該模型能解釋94.99%的響應(yīng)值變化，擬合程度良好，可利用此模型進行分析和預(yù)測酶法純化抗性淀粉的工藝優(yōu)化.其中B、C、A2、C2都極為顯著（p＜0.01），表明在酶法純化抗性淀粉工藝中，真菌α-淀粉酶的添加量、酶解時間、原抗性淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)的二次方和酶解時間的二次方對純化效果有顯著影響.

表5 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 5 The design and results of response surface optimization test

表6 純化后抗性淀粉含量的回歸方程分析Table 6 ANOVA of regression equation for the content of RS after purification

圖4 為不同因子的響應(yīng)曲面和等高線圖，根據(jù)響應(yīng)曲面和等高線所呈現(xiàn)的結(jié)果，可以看出因素B、C，即真菌α-淀粉酶的添加量和酶解時間對純化后抗性淀粉的含量影響較大；依據(jù)純化后抗性淀粉含量與提純率的相關(guān)性可知，此兩因素同樣對提純率有著顯著影響，為影響純化效果的重要因素，與回歸方差分析結(jié)果一致.

圖4 響應(yīng)面曲面與等高線Fig.4 Plots of response surface and contour

利用Design-Expert 8.0.6 軟件對純化后抗性淀粉含量的二次多項式模型進行分析，求得最佳純化工藝條件為：原抗性淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)19.51%，真菌α-淀粉酶添加量20 u/g，酶解時間36.21 min，純化后抗性淀粉含量預(yù)測值為46.76%，提純率為54.84%.但考慮到操作的方便性，工藝參數(shù)修正為原抗性淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，真菌α-淀粉酶添加量20 u/g，酶解時間36 min，并采用此最佳條件進行純化試驗，重復(fù)3 次，測得純化后抗性淀粉含量平均為46.51%，此時提純率為54.01%，證明了此最佳純化條件的可靠性.

3 結(jié)論

酶法純化工藝可有效提高玉米抗性淀粉的純度，在其純化過程中原抗性淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)、真菌α-淀粉酶添加量和酶解時間均是主要的影響因素，應(yīng)控制原抗性淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，真菌α-淀粉酶添加量20 u/g，酶解時間36 min，有利于抗性淀粉含量的顯著增加.相比于原抗性淀粉，酶法純化工藝在確保安全健康的基礎(chǔ)上大大提高了其純度，為制備高純度抗性淀粉提供了基礎(chǔ)方法，有利于抗性淀粉制備研究的繼續(xù)進行.

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