馬曉敏，張紅娟，顧沐宇，歸 靜，高 偉，王佺珍

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊陵712100）

隨著工業(yè)化的發(fā)展和不可再生資源的過度利用，石油能源在不久的將來便會(huì)面臨枯竭的危險(xiǎn)，并且石油燃料的燃燒也帶來了大氣污染、全球氣候變暖等一系列的環(huán)境問題，人類即將面臨能源危機(jī)和大氣污染的雙重挑戰(zhàn)，而能源植物以其資源的豐富性、可再生性、環(huán)境友好性和碳零排放等優(yōu)點(diǎn)必將成為一種重要的替代能源。在各種能源植物中，柳枝稷因其抗逆性強(qiáng)，肥料需求少，生產(chǎn)成本低，適應(yīng)性廣，低灰分，纖維素含量高等優(yōu)點(diǎn)成為了目前能源植物研究的熱點(diǎn)。另外較長時(shí)間的研究實(shí)踐表明，其對(duì)我國的各地水文氣候有較強(qiáng)的適應(yīng)性，進(jìn)一步發(fā)展不僅可以保障能源安全，改善生態(tài)環(huán)境，如在水土流失嚴(yán)重的黃土高原區(qū)，種植柳枝稷改良了當(dāng)?shù)氐纳?，具有生態(tài)效益，因此，近些年我國政府加大了對(duì)能源作物的研究開發(fā)。

植物的生長受到很多非生物因素的限制，土壤鹽漬化是干旱和半干旱地區(qū)農(nóng)作物產(chǎn)量降低的主要原因之一［1］。目前，全球范圍超過50%的灌溉土地和20%的可耕作土地受到鹽漬化的影響［2］，每年世界上由于土壤鹽漬化而喪失的可耕作土地高達(dá)25～50萬hm2，尤其是在一些干旱和半干旱地區(qū)［3］。因此提高農(nóng)作物的耐鹽性，培育耐鹽作物，開發(fā)利用鹽堿地成為未來農(nóng)業(yè)發(fā)展的一個(gè)重要方向，并上升為我國西部農(nóng)業(yè)發(fā)展的重大課題［4］。植物根際促生菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）是指定殖于植物根際系統(tǒng)，并能促進(jìn)植物生長的一類細(xì)菌的總稱，這些促生菌通過一些機(jī)制來促進(jìn)植物生長并提高植物的抗逆性，例如，分泌嗜鐵素和各種激素，溶磷性和固氮性［5］。另外，PGPR可以在分子水平上通過分泌一些酶來調(diào)節(jié)植物生理，促進(jìn)植物生長，具有ACC脫氨酶的內(nèi)生菌是一種重要PGPR［6］。ACC是乙烯的前體，高水平的乙烯會(huì)阻礙植物根系的延長和生長，進(jìn)而影響植物的生長和發(fā)育［7］。該酶可以催化乙烯的關(guān)鍵中間前體ACC轉(zhuǎn)化成α－酮丁酸和氨，從而影響植物生長時(shí)的乙烯水平，因而利用這類PGPR可能有助于提高植物的耐鹽性［8－9］。具有ACC脫氨酶活性的促生菌已經(jīng)在很多在植物上進(jìn)行了研究，如小麥、玉米、西紅柿、油菜［10－13］，可是目前在能源草柳枝稷上還沒有報(bào)道。本文從柳枝稷根莖中分離PGPR，并評(píng)價(jià)這些PGPR對(duì)柳枝稷種子在鹽脅迫下的促生作用，為利用植物促生菌改善和提高鹽脅迫條件下柳枝稷的生長，以及促進(jìn)其在鹽漬化地區(qū)的可持續(xù)生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 PGPRs分離于柳枝稷（Panicum virgatumL.）根莖，柳枝稷（品種Blackwell）生長于西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)科學(xué)實(shí)驗(yàn)地。實(shí)驗(yàn)所用柳枝稷種子來自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)。

1.1.2 主要試劑和儀器 ACC（A－3903）購自三力試劑公司；用于PCR擴(kuò)增的全套試劑購自天根生化公司；實(shí)驗(yàn)中其他試劑均AR級(jí)國產(chǎn)。種子培養(yǎng)箱SPX－100B－Z；超凈操作臺(tái)SW－CJ－1D；電導(dǎo)率儀DDS－307；PCR儀器T100。16SrDNA序列測(cè)定由天根生化公司完成。

1.1.3 培養(yǎng)基 PAF培養(yǎng)基（每升）：蛋白胨10g，絡(luò)蛋白水解物10g，MgSO41.5g，K2HPO41.5g，pH 7.2；DF鹽培養(yǎng)基（每升）：KH2PO44.0g，NaHPO46.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，葡萄糖2.0g，葡萄糖酸2.0g，檸檬酸2.0g，（NH4）2SO42.0g，pH 7.1－7.5；加富培養(yǎng)基（DFa）：ACC溶于超純水后抽濾滅菌，加到不含有（NH4）2SO4且預(yù)先滅菌的D F鹽培養(yǎng)基中，ACC終濃度為3.0mmol· L－1；TSB培養(yǎng)基：胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，葡萄糖2.5g，NaCl 5g，H2PO42.5g，pH 7.1～7.5。

1.2 方 法

1.2.1 ACC脫氨酶活性菌株的制備 參照Zhang［14］的方法，取柳枝稷根莖5g，研磨后取濾液1mL于50mL PAF液體培養(yǎng)基中，在28℃下200 r·min－1振蕩培養(yǎng)24h。重復(fù)轉(zhuǎn)接1次后，吸取1 mL懸浮液至50mL DF培養(yǎng)液中，相同條件下培養(yǎng)24h。然后吸取1mL懸浮液至DFa培養(yǎng)基中，進(jìn)行ACC脫氨酶活性菌株的篩選。如此轉(zhuǎn)接3次后，用接種環(huán)蘸取少量富集培養(yǎng)液，在分離純化培養(yǎng)基平板上劃線分離、28℃培養(yǎng)，待平板上出現(xiàn)單菌落后，挑取單菌落轉(zhuǎn)接至TSB固體分離純化斜面培養(yǎng)基上，選擇連續(xù)接種、傳代3次，保存在固體TSB培養(yǎng)基上于－20℃保存生長，進(jìn)行下一步研究。

1.2.2 分離菌株鑒定 分離的菌株進(jìn)行16SrDNA基因測(cè)序。16SrDNA通過菌落PCR獲得，引物使用細(xì)菌通用引物27f（5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′）和1492r（5′－TACGGCTACCTTGTTACGACTT－3′）。PCR反應(yīng)體系（The 70－μL）：35 μL of 2x反應(yīng)混合物［0.1unit Taq聚合酶／μL，0.5 mmol·L－1dNTP，20mmol·L－1Tris－HCl（pH 8.3），100mmol·L－1KCl，3mmol·L－1MgCl2］，10μmol·L－1的引物2.8μL，0.56μL 2.5xTaq DNA聚合酶，28.84μL無菌水，2μL菌液。PCR程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性0.5min，54℃退火0.5min，72℃延伸5min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)過純化的PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序。通過BLAST軟件對(duì)測(cè)定16S rDNA基因序列進(jìn)行同源性比較，選取相似性較高的序列，并向GenBank提交獲得序列號(hào)。

1.2.3 ACC脫氨酶和IAA活性測(cè)定 ACC脫氨酶活性測(cè)定Donna M［15］的方法進(jìn)行，ACC脫氨酶在利用ACC的時(shí)候會(huì)產(chǎn)生α－丁酮酸，在540nm下測(cè)量處測(cè)定光吸收值，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出α－丁酮酸的濃度。IAA活性測(cè)定按照sheng［16］的方法進(jìn)行一些調(diào)整來測(cè)定，供試菌株先在DF培養(yǎng)液中培養(yǎng)2d，再定量轉(zhuǎn)入添加不同濃度色氨酸（L－Trp）的DF培養(yǎng)液（含0、50、100、200和500μg L－Trp ·mL－1）中繼續(xù)培養(yǎng)2d，取樣測(cè)菌液OD600，其余培養(yǎng)液室溫下8 000g離心，取500μL上清液，添加2mL Salkowski試劑（含150mL H2SO4、250mL ddH2O和0.5mL 0.5mol／L FeCl3），室溫培養(yǎng)20min后，在535nm處測(cè)吸光值（OD535）。IAA含量單位為μg·（mL·OD600）－1，IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線平行3次。

1.2.4 在鹽脅迫條件下促生菌對(duì)茄子種子和形態(tài)、生理指標(biāo)的影響 挑選大小一致飽滿無病害的柳枝稷種子，用70%乙醇處理1min，用無菌水洗凈；再用1%NaCl處理10min，用無菌水洗凈，將種子分為4組，處理組3組用前面分離的，Pseudomonas sp.（P）菌，Rhizobiumsp.（R）菌或Pseudomonas sp.＋Rhizobiumsp.（P＋R）混菌處理1h（用滅菌的0.03mmol·L－1MgSO4重懸浮，OD600＝0.5）對(duì)照組只用0.03mmol·L－1MgSO4處理相同時(shí)間作為對(duì)照。在培養(yǎng)皿（直徑9cm）中進(jìn)行不同濃度梯度的NaCl脅迫試驗(yàn)。供試NaCl濃度分別為：0mmol，50mmol，100mmol，150mmol，200mmol，250mmol每1個(gè)梯度設(shè)3組重復(fù)。每個(gè)培養(yǎng)皿播種50粒種子，每個(gè)處理中一次性加入某一濃度的NaCl溶液8mL，28℃種子培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以后每天稱重補(bǔ)水，每天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù)。發(fā)芽第14d每個(gè)培養(yǎng)皿選取10株幼苗測(cè)定根長、芽長（N＝3＊10）（發(fā)芽不足10株的測(cè)定所有發(fā)芽的根長和芽長）和相對(duì)電導(dǎo)率，并計(jì)算發(fā)芽率，發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，并用Duncan法進(jìn)行多重比較，用Excel 2010進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離和篩選

本試驗(yàn)得到兩個(gè)菌株Rhizobiumsp.（R），Pseudomonas sp.（P）。在GenBank獲得注冊(cè)序列號(hào)分別為KM269075和KJ698416。

2.2 菌株的ACC脫氨酶活性和IAA活性

P菌的ACC脫氨酶和IAA活性分別為895± 35nmol（α－丁酮酸／蛋白mg／h），22.5±1.6μg mL－1。R菌沒有ACC脫氨酶活性，IAA活性為11.3±0.5μg mL－1。

2.3 不同濃度的NaCl鹽脅迫條件下促生菌對(duì)柳枝稷種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

2.3.1 不同濃度的NaCl鹽脅迫條件下促生菌對(duì)柳枝稷種子發(fā)芽率影響 圖1顯示，隨著NaCl鹽濃度的升高，各處理組的發(fā)芽率都下降。0mmol和50mmol鹽濃度處理下，處理組和對(duì)照組的發(fā)芽率沒有顯著差異，100mmol NaCl鹽脅迫下，接種R菌的發(fā)芽率顯著高于無菌的發(fā)芽率，但與接種P菌和混合菌的處理組沒有顯著差異。150mmol和250mmol NaCl脅迫下，處理組的發(fā)芽率均顯著高于對(duì)照組的發(fā)芽率。200mmol NaCl脅迫下，接種R菌和混合菌的發(fā)芽率顯著高于無菌的發(fā)芽率。

圖1 不同濃度NaCl鹽脅迫條件下接菌和不接菌對(duì)柳枝稷種子發(fā)芽率的影響Fig.1 Effect of inoculation on germination rate of switchgrass under NaCl salt stress

2.3.2 不同濃度的NaCl鹽脅迫條件下促生菌對(duì)柳枝稷種子發(fā)芽勢(shì)的影響 圖2顯示，隨著NaCl濃度的升高，4組處理的發(fā)芽勢(shì)都降低。0～100 mmol NaCl下，處理組和對(duì)照組的發(fā)芽勢(shì)沒有顯著差異，150～250mmol NaCl脅迫下，R和P菌處理組種子發(fā)芽勢(shì)顯著高于無菌處理組的發(fā)芽勢(shì)。

2.3.3 不同濃度的NaCl鹽脅迫條件下促生菌對(duì)柳枝稷種子發(fā)芽指數(shù)的影響 圖3顯示，隨著NaCl濃度的升高，各組的發(fā)芽指數(shù)都下降。0～100mmol NaCl脅迫下，各組柳枝稷種子的發(fā)芽指數(shù)沒有顯著差異。但是，150～250mmol NaCl脅迫下，接種P菌，R菌和混合菌的發(fā)芽指數(shù)都要顯著高于無菌的發(fā)芽指數(shù)。

圖2 不同濃度NaCl鹽脅迫條件下接菌和不接菌對(duì)柳枝稷種子發(fā)芽勢(shì)影響Fig.2 Effect of inoculation on tgerminability of switchgrass under NaCl salt stress

圖3 不同濃度NaCl鹽脅迫條件下接菌和不接菌對(duì)柳枝稷種子發(fā)芽指數(shù)影響Fig.3 Effect of inoculation on germination index of switchgrass under NaCl salt stress

2.3.4 不同濃度的NaCl鹽脅迫條件下促生菌對(duì)柳枝稷種子胚根生長的影響 圖4顯示，各處理組中，50mmol NaCl處理下，胚根長度有升高的趨勢(shì)。100～250mmol NaCl處理下，隨著NaCl濃度的升高，胚根長度下降。0mmol和50mmol，100mmol，250mmol NaCl脅迫下，接種P菌組的胚根長度顯著高于不接菌組的。200mmol NaCl脅迫下，所有接菌組的胚根長度顯著高于不接菌的。

2.3.5 不同濃度的NaCl鹽脅迫條件下促生菌對(duì)柳枝稷種子胚芽生長的影響 圖5顯示，隨之NaCl鹽濃度的升高，各組的胚芽長度均下降。0mmol NaCl下，混合菌處理組的胚芽長度顯著高于無菌和R菌的胚芽長度，50mmol NaCl下，P菌和混菌處理組的胚芽長度顯著高于無菌組的，150mmolNaCl下，R菌處理組的胚芽長度顯著高于無菌組的，200mmol NaCl下，接菌組的胚芽長度均高于無菌組的，250mmol NaCl下，P菌的胚芽長度顯著高于其他組的。

2.3.6 不同濃度的NaCl鹽脅迫條件下促生菌對(duì)柳枝稷幼苗相對(duì)電導(dǎo)率的影響 圖6顯示，隨之NaCl濃度的升高，各組的相對(duì)電導(dǎo)率均上升，0mmol和50mmol NaCl脅迫下下，各組的相對(duì)電導(dǎo)率沒有顯著差異，100mmol NaCl脅迫下，無菌組的相對(duì)電導(dǎo)率顯著高于R菌和混合菌組的，150～250mmol NaCl脅迫下無菌組的相對(duì)電導(dǎo)率顯著高于其他接菌的相對(duì)電導(dǎo)率。

圖4 不同濃度NaCl鹽脅迫條件下接菌和不接菌對(duì)柳枝稷種子胚根的影響Fig.4 Effect of inoculation on radicle of switchgrass under NaCl salt stress

圖5 不同濃度NaCl鹽脅迫條件下接菌和不接菌對(duì)柳枝稷種子胚芽的影響Fig.5 Effect of inoculation on plumule of switchgrass under NaCl salt stress

圖6 不同濃度NaCl鹽脅迫條件下接菌和不接菌對(duì)柳枝稷幼苗相對(duì)電導(dǎo)率的影響Fig.6 Effect of inoculation on relative electrical conductivity of switchgrass seedlings under NaCl salt stress

3 討 論

本研究首次從柳枝稷根莖中分離具有ACC脫氨酶活性的促生菌：P、R，并向GenBank獲得注冊(cè)序列號(hào)。菌株P(guān)和R能在以ACC為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長，且P菌具有較高的ACC脫氨酶活性和IAA活性；R菌雖然沒有ACC脫氨酶活性，但是R菌是根瘤菌具有固氮性。P菌和R菌能促進(jìn)柳枝稷在NaCl鹽脅迫的種子萌發(fā)，尤其是高濃度鹽脅迫下的萌發(fā)，提高了種子的發(fā)芽率，發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)，說明P、R菌不但可以在0～250mmol·L－1NaCl下存活，而且可以促進(jìn)柳枝稷種子的萌發(fā)、提高發(fā)芽的整齊度和種子活力。另外，接菌處理組幼苗的胚根長和胚芽長顯著高于對(duì)照組幼苗的胚根和胚芽長，特別是在高濃度NaCl脅迫下。表明促進(jìn)菌P、R和他們的混合菌可以緩解NaCl鹽脅迫，促進(jìn)柳枝稷幼苗的生長。植株相對(duì)電導(dǎo)率（REC）是衡量植株?duì)顟B(tài)的重要生理指標(biāo)。隨之鹽濃度的升高，幼苗具有的相對(duì)電導(dǎo)率升高，植物受損。同等NaCl鹽濃度下特別是高鹽濃度下，接菌的幼苗的相對(duì)電導(dǎo)率要顯著低于無菌幼苗的相對(duì)電導(dǎo)率，表明同等鹽濃度下，接種促生菌的幼苗受到的脅迫小，促生菌具有緩解和抵消NaCl鹽脅迫的作用。

高濃度的NaCl通過離子毒害，水分脅迫和養(yǎng)分不平衡給植物生長發(fā)育造成的脅迫［17］。植物在NaCl鹽脅迫下會(huì)產(chǎn)生大量的乙烯，乙烯是一種植物調(diào)節(jié)激素，低濃度的乙烯可以促進(jìn)植物生長，高度濃度的乙烯可以抑制植物的生長［18］。具有ACC脫氨酶的促生菌可以催化乙烯的前體ACC，把ACC轉(zhuǎn)化成α－酮丁酸和氨，從而降低植物在NaCl鹽脅迫下的乙烯水平，減少乙烯對(duì)植物生長的危害。IAA也是一種植物激素，具有促進(jìn)細(xì)胞生長和分化的作用，另外還能減緩高濃度乙烯對(duì)根造成的抑制作用［19－20］。當(dāng)將促生根際菌定植到種皮或是植物根系時(shí)，會(huì)合成并分泌IAA（生長素），新合成的IAA將會(huì)被植物體吸收形成內(nèi)源生長素，從而刺激植物細(xì)胞的分裂與延長。與此同時(shí)，IAA會(huì)激發(fā)ACC合成酶的活性，將S－腺營酸轉(zhuǎn)化成1－氨基環(huán)丙烷1－梭酸。Penrose研究表明，用ACC脫氨酶活性菌處理植物的種子可以降低2～4倍的乙烯含量［21］。產(chǎn)生固氮酶的PGPR可將空氣中的二氧化氮固定成為有機(jī)氮，被植物和微生物使用促進(jìn)作物生長。本實(shí)驗(yàn)中分離的P菌既具有ACC脫氨酶活性，又具有IAA活性，R菌雖然沒有ACC脫氨酶活性但具有固氮酶活性，可以在只含有ACC為唯一氮源的培養(yǎng)基中生長，而且R菌具有IAA活性，因此可以提高柳枝稷種子在NaCl鹽脅迫下的抗性。P菌、R菌及其兩者的混合菌通過ACC脫氨活性、IAA活性、兩者之間的相互作用，促進(jìn)柳枝稷種子在NaCl鹽脅迫下的種子萌發(fā)和幼苗生長。

4 結(jié) 論

研究結(jié)果表明，促生菌P、R、P＋R處理的柳枝稷的種子，可以提高種子在NaCl鹽脅迫的萌發(fā)，促進(jìn)幼苗的生長，緩解鹽脅迫對(duì)植物的毒害作用，從而增強(qiáng)植物對(duì)鹽脅迫的抗性。本研究為提高和擴(kuò)大柳枝稷在鹽漬化土地柳枝稷的建植提供了新的思路和方法。

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