王騰浩,宗 鑫,宋德廣,汪以真*

(1.浙江大學飼料科學研究所,浙江杭州310058;2.重慶民泰香料化工有限責任公司,重慶400063)

產抑菌蛋白的丁酸梭菌的篩選和鑒定及體外益生功能研究

王騰浩1,2,宗 鑫1,宋德廣1,汪以真1*

(1.浙江大學飼料科學研究所,浙江杭州310058;2.重慶民泰香料化工有限責任公司,重慶400063)

試驗旨在篩選產高效抑菌蛋白的丁酸梭菌,并研究其體外生物學特性,為其在動物生產中的應用奠定基礎。采用厭氧培養(yǎng)法進行菌種分離,孔穴瓊脂擴散法進行抑菌活性篩選,并通過形態(tài)學、生理生化特性和16S rDNA基因序列同源性分析進行菌種鑒定。選取丁酸梭菌ZJU-1進行體外抗逆性和益生功能研究,采用試劑盒進行酶活測定,頂空-氣相色譜發(fā)測定揮發(fā)性脂肪酸。結果表明:從盲腸內容物中分離到6株丁酸梭菌,其中3株菌種對大腸桿菌K88、金黃色葡萄球菌ATCC25923均具有明顯抑制作用。目標菌株ZJU-F1經鑒定結果為丁酸梭菌。丁酸梭菌ZJU-F1具有較好人工胃液、人工腸液、膽鹽和抗生素耐受性;分泌淀粉酶和蛋白酶,活性分別達2 515.43 U/mL和93.72 U/mL;并具有分泌揮發(fā)性脂肪酸的功能,其中乙酸和丁酸的分泌量分別達2.29 g/L和1.87 g/L。本試驗獲得的丁酸梭菌ZJU-F1具有較強的抗逆性和益生功能,作為潛在的抗生素替代物具有巨大的開發(fā)利用價值.

丁酸梭菌;抑菌蛋白;抑菌活性;篩選;鑒定

飼用抗生素在促進畜禽生長、提高飼料轉化效率、減少糧食損耗、提高動物產品產量等方面具有顯著的效果［1］。隨著抗生素在飼料中的長期廣泛使用,它的弊端正日益凸現,如導致動物胃腸道菌群失調,產生細菌耐藥性和動物產品藥物殘留等［2］。微生態(tài)制劑被認為是抗生素的潛在替代物之一,

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 仔豬盲腸內容物10份,取自3個豬場;大腸桿菌K88(E.coli K88)、金黃色葡萄球菌ATCC 25923(s.aureus ATCC25923),購自中國普通微生物菌種保藏中心;梭菌增值培養(yǎng)基(RCM培養(yǎng)基)、梭菌選擇性培養(yǎng)基(TSN培養(yǎng)基)、LB培養(yǎng)基,國產分析純;細菌生化微量反應管、藥敏紙片(杭州微生物試劑有限公司);細菌DNA提取試劑盒(上海生工);豬膽鹽,胰蛋白酶、蛋白酶K、過氧化氫酶(sigma公司),人工胃液、人工腸液根據中國藥典進行配制;蛋白酶測定試劑盒、淀粉酶測定試劑盒、脂肪酶測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分離培養(yǎng)方法 采用厭氧培養(yǎng)箱來進行厭氧菌的液體培養(yǎng)、分離和稀釋平板計數。取盲腸內容物10 g加到90 mL PBS中,放入80℃水浴10 min以殺死非芽孢菌,放入RCM培養(yǎng)基,于37℃厭氧培養(yǎng)36 h;將樣品分別稀釋到10-3、10-5、10-7,涂布于TSN培養(yǎng)基,37℃厭氧培養(yǎng)48 h;采用影印平板法分離菌種[6],選取嚴格厭氧生長的菌株,進行鏡檢;根據丁酸梭菌的培養(yǎng)特性、菌落形態(tài)和顯微形態(tài)等特征,挑選符合特性的菌株進行生理生化鑒定和16S rDNA序列分析。

1.2.2 產抑菌蛋白的丁酸梭菌篩選 發(fā)酵上清菌液:分離的菌株在RCM液體培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)24 h作為種子液;種子液按1%接種于新的RCM液體培養(yǎng)基中,37℃靜置培養(yǎng)24 h作為發(fā)酵液。以8 000 r/min, 4℃離心10 min,取上清液備用。

指示菌的制備:LB培養(yǎng)基培養(yǎng)。種子液按1%接種于LB液體培養(yǎng)基中37℃,200 r/min搖床過夜,稀釋到107CFU/mL備用。

抑菌試驗初篩:采用孔穴瓊脂擴散法。接種E. coli K88和S.aureus ATCC25923至LB培養(yǎng)基,培養(yǎng)過夜后轉接1%至5 mL體積LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)(200 r/min, 37℃)至OD600=0.6左右;滅菌后的250 mL LB固體培養(yǎng)基冷卻至45～50℃時加入1‰的上述菌液,混勻后倒板;凝固后,用打孔器(孔徑5 mm)在平板上打孔,分別加入50 μL發(fā)酵上清菌液,陰性對照加入等體積的RCM培養(yǎng)基,3個重復/樣,置于37℃培養(yǎng)24 h,測定抑菌圈直徑。

抑菌試驗復篩:發(fā)酵液和指示菌液體制備同上。檢測各發(fā)酵液的pH值,對上清液進行排酸、過氧化氫酶和蛋白酶處理[7],孔穴瓊脂擴散法測定其抑菌活性。

1.2.3 丁酸梭菌的鑒定 形態(tài)學鑒定:將目標菌株涂板于RCM培養(yǎng)基平板,37℃培養(yǎng)24 h,觀察菌落形態(tài),挑取單菌落進行革蘭氏染色鏡檢。

生理生化鑒定:運用細菌微量生化反應管對菌株進行生理生化特征分析。

16SrDNA基因序列分析鑒定:細菌總DNA提取采用細菌基因組DNA抽提試劑盒提取。PCR引物序列: 7F:5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′、1540R:5′AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′;反應體系(25 μL):5× Buffer(with Mg2+)2.5 μL;dNTP(各2.5 mmol/L)1 μL; 7F(10 μmol/L)0.5 μL;1540R(10 μmol/L)0.5 μL;基因組 DNA(50 ng/μL)0.5 μL;TaKaRaExTaq酶(5 U/μL)0.3 μL;加雙蒸水至25 μL。PCR擴增程序: 98℃預變性3 min,98℃變性25 s,55℃退火25 s,72℃延伸1 min,進行30循環(huán),最后72℃延伸4 min。PCR產物利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,片段為1 500 bp左右的陽性產物經純化后送上海生工序列測定。運用NCBI上的BLAST將測得的基因序列和GenBank數據庫進行同源性比較;利用merga6.0構建丁酸梭菌系統發(fā)育樹。

1.2.4 丁酸梭菌的體外益生功能研究

1.2.4.1 耐人工胃液和人工腸液研究 耐人工胃液能力研究取生長末期培養(yǎng)物離心(3 000 r/min,10 min), PBS洗滌2次后重懸,以107/mL接種于人工胃液中,震蕩混勻,37℃水浴孵育,每隔0.5 h取樣進行活菌計數,3個重復/樣;耐人工腸液能力研究將經過人工胃液處理后的菌體離心(3000 r/min,10 min),PBS洗滌2次后重懸,以107/mL接種于人工腸液中,實驗步驟同上。

1.2.4.2 耐膽鹽研究 耐膽鹽能力研究在RCM液體培養(yǎng)基加入使其質量分數分別0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40%的豬膽鹽,121℃、15 min滅菌。菌種按1%接種,37℃靜置培養(yǎng),觀察菌體生長變化。

1.2.4.3 抗生素敏感性研究 抗生素敏感性用無菌玻棒將菌液(108/mL)均勻涂布在RCM平板上,攝取各種藥敏紙片,分別緊貼于培養(yǎng)基表面,37℃厭氧培養(yǎng)24 h,測量抑菌圈的直徑,根據標準進行判定,3個重復/樣。

1.2.4.4 產酶活性研究 蛋白酶活力測定采用福林酚法進行測定,采用蛋白酶測定試劑盒進行測定。淀粉酶活力測定:采用碘-淀粉比色法,采用淀粉酶測定試劑盒進行測定。脂肪酶活力測定:采用比濁法測定,采用脂肪酶測定試劑盒進行測定。

1.2.4.5 產酸特性研究 揮發(fā)性脂肪酸測定采用頂空—氣相色譜儀(Agilent 6890)測定。菌液上清液用6%H3PO3溶液按1∶2(m/V)混懸后密封于頂空進樣瓶中,直接進行HS-GC檢測[8]。頂空震蕩室加熱溫度80℃、震蕩加熱時間28 min,進樣針溫度為100℃,分流進樣,分流比3∶1;采用DB-FFAP毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),進樣口溫度220℃,升溫程序為初始溫度80℃ ,以10℃/min升至230℃,保持2 min。恒流模式,載氣流速為1.4 mL/min,FID檢測器,檢測器溫度250℃。

1.3 統計分析 采用SPSS Statistics 18.0軟件中的One-Way ANOVA進行方差分析,采用Duncan′s法進行多種比較,結果均以平均值±標準差表示。

2 結果

2.1 丁酸梭菌分離與篩選

2.1.1 丁酸梭菌的分離 從樣品中分離出21株嚴格厭氧的革蘭氏陽性細菌。根據細菌的菌落形態(tài)、細菌形態(tài)及嚴格厭氧特性能鑒定到屬[9],經鑒定,12株菌株符合梭菌屬細菌特性。根據梭菌屬內的菌株進行芽孢位置染色實驗和明膠液化實驗可以鑒定到群,在群內只需進行蜜二糖、松三糖和淀粉利用實驗,即可鑒定到種[6]。分離到的12株梭菌進行芽孢染色實驗、明膠液化實驗和糖發(fā)酵實驗。結果如表1所示,根據結果判定菌株ZJU-F1、ZJU-F2、ZJU-K3、ZJU-Y2、ZJU-Y3、ZJU-Z2為丁酸梭菌。

2.1.2 產抑菌蛋白的丁酸梭菌篩選 對篩選到的6株丁酸梭菌,使用孔穴瓊脂擴散法進行發(fā)酵上清液的抑菌活性實驗。發(fā)酵上清液經過酸排、H2O2酶、和蛋白酶(胰蛋白酶、蛋白酶K)處理后與上清液原液相比,抑菌活性結果如圖1、表2、表3所示。各菌株發(fā)酵液pH較低,酸排除處理后,ZJU-Y2、ZJU-Y3、ZJUZ2菌株的發(fā)酵上清液抑菌活性消失,但pH4.5的乙酸、丁酸溶液對照并無抑菌活性。H2O2酶處理后抑菌活性并無顯著差異,胰蛋白酶、蛋白酶K處理后抑菌活性則消失,說明起抑菌作用的物質是蛋白質。菌株ZJU-F1、ZJU-F2、ZJU-K3的發(fā)酵上清液對E.coliK88和s.aureus ATCC25923均具有抑菌活性。選擇菌液抑菌活性最強的ZJU-F1菌株作為目標菌株進行下一步實驗。

表1 群內及種的鑒定結果

圖1 C.buttricum發(fā)酵液對指示菌的抑菌效果圖

2.2 丁酸梭菌ZJU-F1的鑒定

2.2.1 形態(tài)學鑒定 丁酸梭菌ZJU-F1菌株在RCM固體平板培養(yǎng)12 h后,形態(tài)如圖2-A所示,菌落呈奶油色圓形菌落,邊緣整齊、不十分規(guī)則、稍突、表面濕潤光滑,不透明,有酸臭味。挑取單菌落進行革蘭氏染色,如圖2-B所示,細菌直徑為(0.6～1.2)×(3.0～7.0)μm,端圓,中間部分輕度膨脹,單個或成對,短鏈,偶見有絲狀菌體,孢子卵圓、次端生,紅色箭頭為芽孢。

表2 C.butyricum上清液不同處理對E.coli K88的抑菌圖譜

表3 C.butyricum上清液不同處理對S.aureus ATCC25923抑菌圈直徑

圖 C.butyricum ZJU-F1的菌落形態(tài)和菌體形態(tài)圖

2.2.2 生理生化鑒定 丁酸梭菌ZJU-F1的生理生化試驗和對不同碳源發(fā)酵利用情況試驗結果如表4所示對照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[9]檢索,初步鑒定結果為丁酸梭菌。

2.2.3 16Sr DNA序列同源性分析 以菌株丁酸梭菌ZJU-F1的DNA為模板,16S rDNA通用引物進行擴增后得到約1 500 bp的特異性擴增產物。經同源性比對,菌株與C.buttricum的同源性達100%,屬于梭菌屬群1丁酸梭菌種,系統發(fā)育樹見圖3。

表4 C.butyricum ZJU-F1的生理生化和糖發(fā)酵試驗

2.3 體外益生功能研究

2.3.1 耐人工胃液和人工腸液研究丁酸梭菌 ZJUF1的人工胃液和人工腸液耐受結果如表5所示,pH= 2的人工胃液對丁酸梭菌ZJU-F1的存活幾乎沒有影響。經人工胃液消化后,丁酸梭菌對人工腸液仍具有良好的耐受性,作用2.5 h后,細菌數目仍然沒有顯著變化。

2.3.2 膽汁耐受性研究 不同消化道部位膽鹽的質量分數不同,豬小腸中膽鹽質量分數在0.03%～0.3%波動。由表6可以看出,ZJU-F1耐膽鹽能力較強,在0.35%的膽鹽培養(yǎng)能中仍能生長。

2.3.3 抗生素敏感性研究 丁酸梭菌ZJU-F1對抗生素的敏感性和相容性如表7所示,青霉素類、頭孢類和四環(huán)素類抗生素對丁酸梭菌ZJU-F1的抑菌作用較強,在飼料生產中不宜配伍;丁酸梭菌ZJU-F1對多膚類、氨基糖苷類和喹諾酮類抗生素耐受性較強,在動物生產中可以配伍。

2.3.4 丁酸梭菌分泌消化酶活性實驗 如表8所示,丁酸梭菌ZJU-F1能分泌淀粉酶和蛋白酶,不產生脂肪酶。當該菌株在動物腸道存活繁殖時,就可能分泌淀粉酶和蛋白酶來輔助消化,提高飼料的消化率和動物生長性能。

2.3.5 丁酸梭菌分泌有機酸實驗 丁酸梭菌ZJUF1分泌的有機酸結果如表9所示,當丁酸梭菌在動物腸道存活繁殖時,丁酸梭菌能分泌丁酸、乙酸等有機酸到周圍環(huán)境中,降低動物腸道pH值,同時丁酸是動物腸道上皮細胞的能量物質,能增強動物腸道屏障功能。

3 討 論

3.1 產抑菌蛋白的丁酸梭菌分離、篩選和鑒定 丁酸梭菌,根據其產芽孢的特性,對樣品進行熱處理以殺死非芽孢菌,涂布TSN培養(yǎng)基平板后初步得到純菌株,再通過影印厭氧和好氧培養(yǎng),得到嚴格厭氧菌。接著對所得到的菌株進行明膠液化實驗、芽孢位置染色實驗和糖醇發(fā)酵實驗鑒定到丁酸梭菌種[6]。抑菌試驗常用方法包括孔穴瓊脂擴散法、牛津杯法、濾紙片法和濁度法等,瓊脂擴散法具有操作便捷結果驗證有效且更加直觀等優(yōu)點被廣泛使用。菌液的抑菌活性則是通過其發(fā)酵過程中產生各種代謝產物包括酸性物質(有機酸)、過氧化氫酶和抑菌蛋白等來實現的。本試驗采用孔穴瓊脂擴散法對E.coli K88和s.aureus ATCC25923的抑菌效果表明,抑菌圈直徑小于6 mm時抑菌活性較低,且發(fā)酵上清液對不同指示菌的抑菌效果并不相同。

圖3 菌株ZJU-F1的同源性屬種的16S rDNA序列系統進化樹

表5 C.butyricum ZJU-F1人工胃液和人工腸液的耐受能力LogN·mL-1

表6 C.butyricum ZJU-F1在不同濃度膽汁中的生長情況

表7 C.butyricum ZJU-F1藥敏實驗結果

表8 C.butyricum ZJU-F1分泌的淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶活性

表9 C.butyricum ZJU-F1分泌乙酸、丁酸產量

為了得到產抑菌蛋白的丁酸梭菌,排除丁酸梭菌在發(fā)酵過程中代謝產物對結果的影響,本試驗采用酸排除、H2O2排除等消除干擾因素。利用H2O2酶處理發(fā)酵上清后發(fā)現抑菌活性無明顯影響,而調整pH至5.5后抑菌活性有所減弱,說明pH對抑菌活性有影響,而pH=4.5的乙酸、丁酸的培養(yǎng)基對照并無抑菌活性,說明抑菌活性并非由于酸性物質所致,但低pH環(huán)境可以增強其他抑菌物質的抑菌活性。發(fā)酵上清經胰蛋白酶、蛋白酶K處理后抑菌活性消失,說明發(fā)酵液中抑菌活性為蛋白質,可以初步確定其為細菌素,且該細菌素可被蛋白酶降解而不在體內殘留,具有較高的安全性。

傳統的菌落和細菌形態(tài)學、生理生化鑒定分析方法不能準確的鑒定出細菌的種屬。16S rDNA序列是編碼核糖體RNA小亞基16S rRNA的基因,具有高度保守的特性[10]。16S rDNA技術則是通過對遺傳特征的保守性序列分析,能夠判斷出細菌間親緣關系的遠近,從而準確的鑒定細菌的種屬,該方法因其準確、快速、靈敏等優(yōu)點已成為細菌鑒定有力手段之一。本研究通過嚴格厭氧條件下產芽孢確定其為梭菌屬細菌,并通過芽孢位置實驗、明膠液化、糖發(fā)酵實驗鑒定到種,最后通過16S rDNA序列分析技術鑒定。

3.2 丁酸梭菌的體外益生功能研究 益生菌制劑作為飼料添加劑,需經過口腔、胃后進入腸道發(fā)揮益生功能,這就要求益生菌制劑能夠耐受動物機體的防御機制。丁酸梭菌因具有產芽孢的特性,能夠耐受各種消化酶、胃酸和膽汁的影響,具有較強的抗逆性,本試驗篩選的丁酸梭菌ZJU-F1對人工胃液、人工腸液和膽汁具有較高耐受能力。

益生菌制劑的菌種選育標準要求篩選的菌株對常用抗生素具有較高敏感性,以證明菌株本身不含有耐藥性質粒[11]。而在實際動物生產中,飼料特別是幼齡飼料往往添加一定量的抗生素以防病和促生長,從而影響了益生菌的使用效果。因此,研究益生菌對各種藥物的敏感性及配伍禁忌及其重要。本研究表明,丁酸梭菌ZJU-F1可和多膚類氨基酸苷類、喹喏酮類抗生素聯合使用。

丁酸梭菌在動物腸道內產生對宿主的健康具有重要的生理意義的多種代謝產物,包括蛋白酶、淀粉酶、乙酸、丁酸等益生物質等[12]。幼齡動物因其消化功能發(fā)育不全、消化酶分泌不足,導致生長性能受阻[13]。丁酸梭菌能產蛋白酶和淀粉酶,在動物生產中應用可以提高動物的消化性能,從而提高飼料利用率。揮發(fā)性脂肪酸(如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸),對動物腸道健康起到重要作用[14]。丁酸是動物腸道上皮細胞首選能源底物,具有促進動物生長、改善小腸形態(tài)、促進小腸消化吸收并增強動物機體免疫等功能[15]。丁酸梭菌ZJU-F1在動物機體內生長繁殖可分泌大量的消化酶、乙酸、丁酸,在提高動物消化功能的同時具有降低腸道pH,并發(fā)揮抑菌效應,增強動物免疫功能的效果。

4 結論

本研究仔豬盲腸內容物中分離到6株丁酸梭菌,通過多重抑菌實驗對菌株進行初篩和復篩,得到產高活性抑菌蛋白的丁酸梭菌ZJU-F1。對目標菌株進行形態(tài)學、生理生化和16S rDNA基因序列同源性分析,鑒定結果為丁酸梭菌。丁酸梭菌ZJU-F1具較強的抗逆性和益生功能,作為飼料益生菌制劑具有很大的應用潛力。

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Screening,Identification and in vitro Functional Study of Clostridium Butyricum Which Produce Antimicrobial Protein

WANG Teng-hao1,2,ZONG Xin1,SONG De-guang1,WANG Yi-zhen1*
(1.Institute of Feed Science,Zhejiang University,Zhejiang Hangzhou 310058,China; 2.Chongqing Mintai Flavor Chemical Co.,Ltd.Chongqing 400063,China)

This study was conducted to separate and screen Clostridium buttricum from piglets'cecal contents,which produce efficient antimicrobial protein,and to study itsbiological characteristics in vitro.Strains were isolated by anaerobic cultivation,selected by Cavity AGAR diffusion method,and identified by physiological and biochemical experiments and the sequence analysis of 16S rDNA.C.buttricum ZJU-1,which had the strongest antimicrobial activity,and its stress resistance and probiotic function were also studied in vitro.Enzyme activities were measured by ELISA kits and volatile fatty acids were measured by headspace-gas chromatography.Results showed that,six strains of C.buttricum were isolated from the cecal contents,and three strains which had obvious inhibitory effect on E.coli K88,s.aureus ATCC25923 were obtained.The target strain ZJU-F1was identified as C.buttricum.In vitro functional study indicated that it was tolerant against low pH,bile concentration and antibiotics.C.buttricum ZJU-F1had high ability to produce digestive enzyme,and the amylase and protease actives were up to 2515.43 U/mL and 93.72 U/mL. C.buttricum ZJU-F1 also produced volatile fatty acids,such as acetic acid and butyric acid,which were reached to 2.29 g/L and 1.87 g/L,respectively.C.buttricum ZJU-F1,with a high stress resistance and strong antimicrobial ability,could be a potential alternative for antibiotics.

closridum butyricum;antimicrobial protein;bacteriostatic activity;sereening;identification

S816.730.15

:A

:0258-7033(2015)13-0075-07已被廣泛關注［3］。丁酸梭菌是從健康人和動物腸道分離出來的一種嚴格厭氧的革蘭氏陽性芽孢桿菌,具有產丁酸、產酶、葉酸等益生物質等特性［4］。近年來,對丁酸梭菌的研究主要集中在生物醫(yī)學和生物化工方面,在飼料工業(yè)上研究相對較少。相比于非芽孢桿菌,丁酸梭菌具有較強的抗逆性,并能促進動物生長、調節(jié)動物腸道微生態(tài)平衡、提高機體免疫力,在畜牧生產中具有廣闊的應用前景［5］。本研究旨在篩選出對動物常見致病菌具有廣譜抑菌活性的產抑菌蛋白的丁酸梭菌菌株,對其進行鑒定,并在體外研究其抗逆性和益生特性,為其在動物生產應用提供理論支撐。

2014-10-31;

2014-12-08

國家生豬產業(yè)體系崗位科學家項目(CARS-36)

王騰浩(1985-),男,浙江天臺人,博士研究生,主要從事動物營養(yǎng)和新型飼料添加劑研發(fā)工作,E-mail:wangth85@gmail. com

*通訊作者:汪以真,E-mail:yzwang321@zju.edu.cn