唐遠謀，周金洋

(1.成都大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610106;2.西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039)

響應(yīng)面法優(yōu)化石榴皮多酚提取工藝研究

唐遠謀1，周金洋2

(1.成都大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610106;2.西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039)

對石榴皮中多酚的提取工藝進行了優(yōu)化研究.探討了提取溶劑、乙醇濃度、分離目數(shù)、提取時間、料液比和提取溫度對石榴皮中多酚提取的影響，并利用響應(yīng)面法對提取工藝進行了優(yōu)化.結(jié)果表明:當乙醇濃度為72%、提取溫度為86℃、料液比為1∶26(w∶v)，提取2.5 h，石榴皮中多酚含量最大值為209.055 mg/g.

石榴皮;多酚;提取;響應(yīng)曲面法

0 引言

石榴作為一種水果，其產(chǎn)地遍布我國四川、云南、安徽、山東與陜西等地，市場上各類石榴加工產(chǎn)品也層出不窮.但在石榴產(chǎn)品的加工過程中，石榴皮幾乎都被丟棄，這不僅造成嚴重的資源浪費，且還對環(huán)境造成污染.研究表明，石榴皮中富含多酚類物質(zhì)，其具有抗氧化、抑菌、抗突變及抗腫瘤等功能［1－4］，可廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和日用化學(xué)品領(lǐng)域.

響應(yīng)曲面法(Response Surface Method，RSM)是一種優(yōu)化生物過程的統(tǒng)計學(xué)實驗設(shè)計方法［5］，其中，Box-Behnken響應(yīng)曲面分析是一種常用的響應(yīng)面分析法，利用該方法不僅可以建立連續(xù)變量的曲面模型，還可以對影響生物過程的因子及其交互作用進行評價.與傳統(tǒng)優(yōu)化方法相比，RSM所需的試驗組數(shù)相對較少，能確定最佳水平范圍，所得結(jié)果最優(yōu).因此，為了獲得最佳的工藝參數(shù)，本研究擬采用RSM對石榴皮中多酚的提取工藝進行優(yōu)化，為實現(xiàn)石榴資源的綜合利用及深度開發(fā)其副產(chǎn)品提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材 料.

實驗所用材料包括:石榴皮(成都中藥飲片公司)，福林—酚試劑(北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司)，其他試劑均為實驗室常用試劑(成都科龍化工試劑廠)，分析純.

1.1.2 儀 器.

實驗所用儀器包括:DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)，ST-02A型多功能粉碎機(永康帥通工具有限公司)，80目分樣篩(沈陽沈河架線器材廠)，TB-214型電子天平(美國丹佛儀器設(shè)備廠)，HH-S型數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇金城國勝實驗儀器廠)，SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵(鞏義子華儀器有限公司)，UV-2600型紫外可見分光光度計(上海尤尼柯儀器有限公司).

1.2 實驗方法

1.2.1 石榴皮中多酚提取工藝流程.

石榴皮中多酚提取工藝流程為:石榴皮→干燥至恒重→粉碎過篩→溶劑提取→抽濾→多酚含量測定.

在“溶劑提取"流程中，首先，通過單因素實驗，鎖定其他提取參數(shù)，逐級考查不同的提取溶劑、乙醇濃度、分離目數(shù)、提取時間、料液比和提取溫度對石榴皮中多酚提取的影響;然后，在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，固定其他最佳單因素結(jié)果參數(shù)，選取對石榴皮多酚提取結(jié)果影響較大且好操控的3因素，在其附近各選取3水平進行Box-Behnken響應(yīng)面分析.

1.2.2 多酚含量的測定.

多酚含量的測定采用福林—酚比色法［6］，即:取1 mL樣品液加到10 mL比色管中，依次加入去離子水1 mL、福林—酚試液0.5 mL、26.7%碳酸鈉溶液1.5 mL，然后用水定容至10 mL，室溫下反應(yīng)2 h，在760 nm下測定其吸光度.測得的吸光度代入標準曲線，y=0.0081x+0.0286，相關(guān)系數(shù)，R2=0.9999，求得試樣中多酚含量，計算公式為，

式中，P為多酚含量，mg/g;C為由回歸方程計算得到樣品中多酚類物質(zhì)的質(zhì)量濃度，μg/mL;n為稀釋倍數(shù);V為溶液體積，mL;W為投料量，g.

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的篩選

用電子天平精確稱取粉碎后過80目篩的石榴皮粉樣品5.000g，分別用水、70%的甲醇、乙醇、丙酮溶液作為溶劑，采用溶劑水浴浸提，提取時間為2 h，料液比為1∶20，提取溫度為80℃，實驗結(jié)果如圖1所示.

圖1 溶劑對石榴皮中多酚提取的影響

由圖1可知，提取溶劑為甲醇時，石榴皮中多酚提取率最高，乙醇次之.由于甲醇潛在的毒性，加之乙醇作為提取溶劑時，石榴皮中多酚得率與甲醇作為提取溶劑相當，故選取乙醇作為提取溶劑.

2.2 單因素實驗結(jié)果與分析

2.2.1 乙醇濃度對石榴皮中多酚提取的影響.

參照“2.1”項下的方法，固定其他提取參數(shù)，分別采用濃度為10%、30%、50%、70%、90%的乙醇提取，實驗結(jié)果如表1所示.

表1 乙醇濃度對提取結(jié)果的影響

由表1可知，當乙醇濃度為70%時，石榴皮中多酚的含量最高，故選取70%的乙醇作為提取溶劑.

2.2.2 篩目目數(shù)對石榴皮多酚提取的影響.

取乙醇溶度為70%，其他條件如“2.2.1”項，石榴皮粉碎后改變篩目大小，實驗結(jié)果如表2所示.

表2 篩目目數(shù)對提取結(jié)果的影響

不同的篩目孔徑得到的石榴皮粉末在提取過程中可能與提取溶劑的接觸面積相關(guān).由表2可知，當篩目目數(shù)為100～120時，石榴皮中多酚的含量最高，故篩目目數(shù)選取為100～120.

2.2.3 提取時間對石榴皮中多酚提取的影響.

篩目目數(shù)為100 ～120，其他條件如“2.2.2”項，改變提取時間，實驗結(jié)果如表3所示.

表3 提取時間對提取結(jié)果的影響

由表3可知，當提取時間為2.5 h時，石榴皮中多酚的含量最大.當提取時間超過2.5 h后，石榴皮中多酚含量有所減少，這可能是由于石榴皮中多酚部分被氧化所致.

2.2.4 料液比對石榴皮中多酚提取的影響.

提取時間為 2.5 h，其他條件如“2.2.3”項，改變料液比，實驗結(jié)果如表4所示.

表4 料液比對提取結(jié)果的影響

料液比的不同可能造成石榴皮粉末與提取溶劑的接觸面積不同，從而影響石榴皮中多酚含量.由表4可知，當料液比為1∶25時石榴皮中多酚含量最高.

2.2.5 提取溫度對石榴皮中多酚提取的影響.

料液比為1∶25，其他條件如“2.2.4”項，改變提取溫度，實驗結(jié)果如表5所示.

表5 提取溫度對提取結(jié)果的影響

由表5可知，當提取溫度為80℃時，石榴皮中多酚含量最高.過低的溫度不能滿足石榴皮中多酚從石榴皮粉末中全部溶出，而過高的溫度可能會加速石榴皮中多酚的氧化.

2.3 RSM結(jié)果與分析

通過單因素實驗結(jié)果可知，在選取的6個單因素中，乙醇濃度、提取溫度和料液比對石榴皮中多酚的提取影響較大，故選擇這3個因素做Box-Behnken設(shè)計，同時以石榴皮中多酚含量為響應(yīng)值，實驗輔助軟件采用Design Expert 8.0，實驗結(jié)果如表6、7所示.

表6 Box-Behnken設(shè)計實驗因素水平及編碼

表7 Box-Behnken設(shè)計

利用Design Expert 8.0軟件對上述結(jié)果進行分析，經(jīng)過擬合，得石榴皮中多酚含量(Y)對乙醇濃度(A)、提取溫度(B)、料液比(C)的二次多項回歸方程為，

實驗所選用模型的p值為0.0033，極顯著(p＜0.05).模型的確定系數(shù)R2=0.9672，模型的調(diào)整確定系數(shù)R2adj=0.9083，此表明該模型擬合程度良好，實驗誤差小，且該模型能解釋90.83%響應(yīng)值的變化，完全可用此模型對石榴皮多酚提取工藝進行分析和預(yù)測.

回歸模型的方差分析如表8所示.

表8 回歸模型方差分析結(jié)果

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對各實驗因子X1、X2、X3所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，根據(jù)回歸方程做出不同因子的響應(yīng)面分析如圖2～4所示.

圖2 乙醇溶度與提取溫度對多酚含量的響應(yīng)面圖

圖3 提取溫度與料液比對多酚含量的響應(yīng)面圖

圖4 乙醇溶度與料液比對多酚含量的響應(yīng)面圖

圖2～4中的等高線為各響應(yīng)面三維圖在底面的投影，其形狀反映了交互效應(yīng)的強弱大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形或馬鞍形則表示兩因素交互作用顯著.由各響應(yīng)面圖可知，其等高線均為橢圓，說明3者彼此間交互效果均顯著.由圖2可知，乙醇濃度對石榴皮中多酚的提取影響不是很大，曲線表現(xiàn)為較為平緩，乙醇濃度在0水平左右多酚含量較大，而提取溫度對石榴皮中多酚含量影響很大，表現(xiàn)為曲線較陡，較高的溫度適宜于石榴皮中多酚的提取.從圖3可看出，料液比對石榴皮中多酚提取影響不大，曲線較為平緩，此圖進一步說明提取溫度對石榴皮中多酚提取影響較大，表現(xiàn)為曲線較陡.由圖4可進一步看出，乙醇濃度和料液比對石榴皮中多酚的提取影響不大，曲線都較為平緩.

2.4 驗證實驗

通過實驗輔助軟件Design Expert 8.0優(yōu)化提取條件得到多酚含量大于211 mg/g的7組數(shù)據(jù)，并得到各參數(shù)范圍:乙醇濃度69.5% ～74.0%，提取溫度81.4℃ ～90.0℃，料液比1∶24～1∶28.考慮到可操作性，本實驗選擇乙醇濃度72%、提取溫度86℃、料液比1∶26，即，A=0.2、B=0.6、C=0.25，代入二次多項回歸方程，計算得出石榴皮中提取的多酚含量的預(yù)測值為212.696 mg/g，同時，做3次平行實驗得到實驗值為209.055 mg/g，相對誤差小于10%，此結(jié)果說明利用響應(yīng)面法優(yōu)化石榴皮中多酚的提取工藝是可行的.

3 結(jié)論

通過單因素實驗，確定了石榴皮多酚提取的最佳實驗條件為:溶劑為乙醇，乙醇濃度為70%、提取溫度為80℃、料液比為1∶25.

通過Box-Behnken響應(yīng)曲面分析，確定了石榴皮中多酚提取的最佳試驗條件為:乙醇濃度為72%、提取溫度為86℃、料液比為1∶26.以該優(yōu)化條件提取2.5 h時，從石榴皮中提取的多酚含量達到209.055 mg/g.

［1］李夢穎，李建科，于振，等.石榴多酚的提取、檢測和成分分析研究進展［J］.食品工業(yè)科技，2013，34(17):384 －388.

［2］田樹革，魏玉龍，劉宏炳.Folin-Ciocalteu比色法測定石榴不同部位總多酚的含量［J］.光譜實驗室，2009，26(2):341－344.

［3］唐鵬程，焦士蓉，唐遠謀.石榴皮多酚提取工藝及活性研究進展［J］.西華大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2011，30(1):98－102.

［4］彭海燕.石榴不同品種及不同部位多酚含量的比較研究［D］.成都:西華大學(xué)，2012.

［5］田泱源，李瑞芳.響應(yīng)面法在生物過程優(yōu)化中的應(yīng)用［J］.食品工程，2010，38(2):8 －11.

［6］劉佳，焦士蓉，唐遠謀，等.苦丁茶多酚的提取及抗氧化活性［J］.食品科學(xué)，2011，32(14):134 －138.

Optimization of Polyphenols Extraction from Pomegranate Peel by Response Surface Method

TANG Yuanmou1，ZHOU Jinyang2
(1.School of Medicine，Chengdu University，Chengdu 610106，China;2.School of Food and Bioengineering，Xihua University，Chengdu 610039，China)

This paper explored the effects about extraction solvent，ethanol concentration，separation mesh，extraction time，material-liquid ratio and extraction temperature on polyphenols extraction from pomegranate peel.The response surface method(RSM)was used for optimization of the extraction process.The experimental results showed that being extracted for 2.5 h when the ethanol concentration was 72%and the material-liquid ratio was 1∶26(w∶v)at extraction temperature 86℃，the maximum polyphenol content was 209.055 mg/g.

pomegranate peel;polyphenols;extraction;response surface method

TS201.1;TS255.36

A

1004－5422(2015)01－0008－04

2015－01－23.

成都大學(xué)校青年基金(2014XJZ12)、藥食同源植物資源開發(fā)四川省高校重點實驗室基金(10Y201404)資助項目.

唐遠謀(1986—)，男，博士研究生，講師，從事生物質(zhì)轉(zhuǎn)化及食品營養(yǎng)與安全研究.